專利名稱：雙相羅氏培養基及其制備方法
技術領域：
本發明屬于醫學檢驗技術領域，具體涉及一種能促進分枝桿菌快速生長的新型培養基及其制備方法。
背景技術：
分枝桿菌是一類廣泛分布于自然界的細菌，其中某些分枝桿菌可使人和動物致病。近年來，國內外普遍報道由分支桿菌感染引起的疾病日益增多。特別是免疫功能低下患者的繼發感染、以及醫院內感染的暴發流行顯著增加。對于分枝桿菌引起的感染性疾病的診斷，只要從待檢樣品中培養出分枝桿菌即可確診。
目前，國內外普遍使用改良羅氏培養基分離培養分枝桿菌(見中華醫學會編著臨床技術操作規范-結核病分冊，人民軍醫出版社2004年10月第1版30～33頁)。這種培養基培養需時較久(通常需4-8周)，陽性率不高(通常為10％-30％)，遠不能滿足臨床診治和防病的需要。因此，迫切需要研制一種快速、靈敏的分枝桿菌培養基。
發明內容
本發明的目的在于提出一種能促進分枝桿菌快速生長的培養基及其制備方法。
本發明提出的分枝桿菌培養基，是以傳統的改進羅氏培養基為基礎，再加入液體培養基培養組成，該液體培養基包括基礎培養基、促生長劑和抑菌劑三種成份，其組成配比如下基礎培養基硫酸銅0.001～0.002克、硫酸鋅0.001～0.002克、氯化鈣0.001～0.002克、硫酸鎂0.01～0.02克、油酸0.01～0.02克、枸櫞酸鐵銨0.05～0.1克、枸櫞酸鈉0.1～0.2克、硫酸銨0.2～0.4克、丙酮酸鈉0.5～1克、吐溫-800.5～1克、天門冬素1～2克、磷酸二氫鉀1～2克、磷酸二氫鈉2～4克、中性甘油8～12毫升、蒸餾水1000毫升。
促生長劑鹽酸吡哆醇0.01克～0.02克、生物素0.01克～0.02克，輔酶A 0.1克～0.2克，三磷酸腺苷0.1克～0.2克，過氧化氫酶0.1克～0.2克，α-萘乙酸0.1克～0.2克，蛋白胨1克～2克，葡萄糖10克～20克，牛血清白蛋白V5因子100克～200克。
抑菌劑由濃度分別為50μg～100μg/ml的氨芐青霉素、二性霉素B、多粘菌素B、奈啶酮酸和阿洛西林的蒸餾水溶液等量混合而成。
改良羅氏培養基和上述液體培養基、促生長劑、抑菌劑的組份比例為改良羅氏培養基8ml
基礎培養基4-8ml促生長劑 1-2ml抑菌劑0.1-0.2ml。
上述分枝桿菌培養基中還加入氧化還原指示劑(也稱顯色劑)，加入量為對應于1000ml改良羅氏培養基，加入4-6ml濃度為0.1％的顯色劑溶液。得到染色培養基，用于對培養菌落顯色，便于生化鑒定和藥敏試驗。加入的顯色劑可根據實際檢測要求而變化。主要有紅四氮唑(TCC)等。
本發明提出的分枝桿菌培養基的制備方法如下1、將基礎培養基的各組份用蒸餾水溶解，在115-125℃高溫下滅菌10-15分鐘，冷卻，置于4℃冰箱保存；2、將促生長劑的各組份用蒸餾水溶解，然后滅菌過濾、分裝，置于4℃冰箱保存；3、將抑菌劑的各組份分別用蒸餾水配制成濃度為50-100μg/ml的溶液，然后等量混合；4、最后將基礎培養基、促生長劑、抑菌劑加入改良羅氏培養基，各組份的投料比例為改良羅氏培養基 8ml基礎培養基 4-8ml促生長劑 1-2ml抑菌劑 0.1-0.2ml。
此外，在上述混合培養基中再加入顯色劑，混和均勻，即得染色培養基。顯色劑為紅四氮唑，加入量為對應于1000ml改良羅氏培養基，加入4-6ml濃度為1％顯色劑溶液。
本發明提供的雙相羅氏培養基的使用方法如下a.待檢標本經抗污處理后進行離心洗滌；b.取沉淀0.1ml，滴種于雙相羅氏培養基的液體中；c.斜置培養基于35-37℃溫箱孵育；d.每天觀察結果一次，見有細菌生長即為培養陽性；e.培養至30天仍未見細菌生長為培養陰性；f.培養陽性，可見液體培養基中含有細菌形成的顆粒狀物資，固體培養基斜面上出現紫紅色的菌落。
本發明提供的能促進分枝桿菌快速生長的培養基，以改良羅氏培養基為基礎，加入分枝桿菌液培養基和顯色劑，使之成為既含固體成分又含液體成分，故稱其為雙相羅氏培養基。由于該培養基同時含有雙重培養基的營養成分，因此能促進分枝桿菌的快速生長，提高培養陽性率；同時又因為含有顯色劑，可使分枝桿菌在羅氏培養基表面形成紫紅色的菌落，極易觀察。通過觀察菌落特征，有利于分枝桿菌的快速初步鑒定。也可從羅氏培養基表面挑取菌落進行涂片染色、生化鑒定和藥敏試驗，這樣可盡快對患者作針對性的抗菌治療。
具體實施例方式
本發明中的羅氏培養基就是目前國內外通用的改良羅氏培養基，在1000ml改良羅氏培養基中加入(也可不加入)4-6ml 0.1％的顯色劑TTC溶液；液體培養基由基礎培養基、促生長劑和抑菌劑組成。
基礎培養基組成成分如下硫酸銅0.001克、0.0015克或0.002克，硫酸鋅0.001克、0.0015克或0.002克，氯化鈣0.001克、0.0016克或0.002克，硫酸鎂0.01克、0.018克或0.02克，油酸0.01克、0.016克或0.02克，枸櫞酸鐵銨0.05克、0.07克或0.1克，枸櫞酸鈉0.1克、0.15克或0.2克，硫酸銨0.2克、0.3克或0.4克，丙酮酸鈉0.5克、0.7克或1克，吐溫-800.5克、0.7克或1克，天門冬素1克、1.3克或2克，磷酸二氫鉀1克、1.5克或2克，磷酸二氫鈉2克、3克或4克，中性甘油8毫升、10毫升或12毫升，蒸餾水1000毫升。配制方法是先將上述各成分用雙蒸水溶解，然后115℃～121℃高壓滅菌10～15分鐘，冷卻，經無菌試驗后置4℃冰箱保存備用。
促生長劑組成成分如下鹽酸吡哆醇0.01克、0.015克或0.02克、生物素0.01克、0.015克或0.02克，輔酶A 0.1克、0.15克或0.2克，三磷酸腺苷0.1克、0.15克或0.2克，過氧化氫酶0.1克、0.15克或0.2克，α-萘乙酸0.1克、0.15克或0.2克，蛋白胨1克、1.5克或2克，葡萄糖10克、15克或20克，牛血清白蛋白V5因子100克、150克或200克。配制方法是先用雙蒸水將上述成分溶解，然后無菌過濾、分裝，經無菌試驗后置4℃冰箱保存。
抑菌劑配制分別將氨芐青霉素、二性霉素B、多粘菌素B、奈啶酮酸和阿洛西林配制成50μg～100μg/ml濃度的蒸餾水溶液，取等量混合而成。
然后取加有顯色劑TTC溶液的改良羅氏培養基8ml，取上述各種組配中一種組配的液體培養基，其中基礎培養4-8ml，促生長劑1-2ml，抑菌劑0.1-0.2ml，混合均勻，即得所需雙相羅氏培養基。這些培養基經過實驗，都是有良好的效果。
權利要求
1.一種雙相羅氏培養基，以傳統的改進羅氏培養基為基礎，加入液休培養基組成，該液體培養基包括基礎培養基、促生長劑和抑菌劑，其組份配比如下基礎培養基硫酸銅0.001～0.002克、硫酸鋅0.001～0.002克、氯化鈣0.001～0.002克、硫酸鎂0.01～0.02克、油酸0.01～0.02克、枸櫞酸鐵銨0.05～0.1克、枸櫞酸鈉0.1～0.2克、硫酸銨0.2～0.4克、丙酮酸鈉0.5～1克、吐溫-80 0.5～1克、天門冬素1～2克、磷酸二氫鉀1～2克、磷酸二氫鈉2～4克、中性甘油8～12毫升、蒸餾水1000毫升；促生長劑鹽酸吡哆醇0.01克～0.02克、生物素0.01克～0.02克，輔酶A 0.1克～0.2克，三磷酸腺苷0.1克～0.2克，過氧化氫酶0.1克～0.2克，α-萘乙酸0.1克～0.2克，蛋白胨1克～2克，葡萄糖10克～20克，牛血清白蛋白V5因子100克～200克；抑菌劑由濃度分別為50μg～100μg/ml濃度的氨芐青霉素、二性霉素B、多粘菌素B、奈啶酮酸和阿洛西林的蒸餾水溶液等量混合而成；改良羅氏培養基和上述液體培養基、促生長劑、抑菌劑的組份比例為改良羅氏培養基 8ml液體培養基 4-8ml促生長劑 1-2ml抑菌劑 0.1-0.2ml。
2.根據權利要求1所述的雙相羅氏培養基，其特征在于還加入有顯色劑紅四氮唑，其加入量為對應于1000ml改良羅氏培養基，加入4-6ml濃度為0.1％的顯色劑溶液。
3.一種如權利要求1所述雙相羅氏培養基的制備方法如下(1)將基礎培養基的各組份用蒸餾水溶解，在115-125℃高溫下滅菌10-15分鐘，冷卻，置于4℃冰箱保存；(2)將促生長劑的各組份用蒸餾水溶解，然后滅菌過濾、分裝，置于4℃冰箱保存；(3)將抑菌劑的各組份分別用蒸餾水配制成濃度為50-100μg/ml的溶液，然后等量混合；(4)最后將基礎培養基、促生長劑、抑菌劑加入改良羅氏培養基，各組份的投料比例為改良羅氏培養基 8ml基礎培養基 4-8ml促生長劑1-2ml抑菌劑 0.1-0.2ml。
4.根據權利要求3所述的雙相羅氏培養基的制備方法，其特征在于還加入顯色劑紅四氮唑，加入量為對應于1000ml改良羅氏培養基，加入4-6ml濃度為0.1％的顯色劑溶液。
5.一種如權利要求1所述的雙相羅氏培養基的使用方法，其特征在于具體步驟如下a.待檢標本經抗污處理后進行離心洗滌；b.取沉淀0.1ml，滴種于雙相羅氏培養基的液體中；c.斜置培養基于35-37℃溫箱孵育；d.每天觀察結果一次，見有細菌生長即為培養陽性；e.培養至30天仍未見細菌生長為培養陰性；f.培養陽性，可見液體培養基中含有細菌形成的顆粒狀物資，固體培養基斜面上出現紫紅色的菌落。
全文摘要
本發明屬醫學檢測技術領域，具體涉及一種能促進分枝桿菌快速生長的新型培養基及其制備方法。該培養基由固體和液體二部分組成。固體部分是在國內外通用的改良羅氏培養基，液體部分由基礎培養基、促生長劑和抑菌劑組成。該培養基既能選擇性地促進分枝桿菌的快速生長，又能抑制其它雜菌，生長的分枝桿菌可在培養基的固體斜面上形成紫紅色菌落，有利于分枝桿菌的初步鑒定。該培養基能顯著縮短培養所需時間，大幅度提高培養陽性率，非常適用于待檢樣品的分枝桿菌快速檢測。該培養基可用于各級醫院和衛生防病部門。
文檔編號C12Q1/04GK1699592SQ20051002561
公開日2005年11月23日 申請日期2005年4月29日 優先權日2005年4月29日
發明者胡忠義 申請人:胡忠義