專利名稱：一種用于原核分泌、融合表達大腸桿菌熱敏毒素b亞單位的載體的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于原核表達大腸桿菌熱敏毒素B亞單位(E.coli heat-labile enterotoxin Bsubunit，LT-B)的載體，特別涉及一種用于原核分泌、融合表達LT-B的載體。
背景技術：
大腸桿菌熱敏腸毒素(E.coli heat-labile enterotoxin，LT)由A、B兩個亞基組成，其中無毒性的B亞基(LT-B)具有較強的免疫原性，特別是有較強的粘膜免疫活性。因此在LT-B后的多克隆位點區無目的基因插入時，所表達的蛋白質可以產生抗大腸桿菌熱敏腸毒素的抗體，因而可以作為預防“旅游者腹瀉”與幼畜腹瀉的疫苗成分。
目前LT-B原核表達多以包涵體形式，這給表達產物(目標蛋白LT-B)純化帶來困難。此外，LT-B是一種公認的粘膜免疫激活因子，在與其融合表達的保護性抗原蛋白中，可以作為粘膜免疫佐劑提高疫苗的粘膜免疫活性，從而改變疫苗的接種途徑。因此，如何實現LT-B及與其融合的保護性抗原蛋白的原核分泌表達(克服包涵體表達形式的缺陷)，同時又能與其它保護性抗原蛋白融合表達(形成粘膜疫苗，便于通過粘膜進行預防接種)是本發明需要解決的技術問題。
發明內容
本發明的目的在于，提供一種能實現LT-B的原核分泌、融合表達的載體。
本發明所說的能實現LT-B的原核分泌、融合表達的載體(pET-LTB)是一個以pET32a(購自NOVGE公司)為基礎骨架的閉環質粒，在pET32a的RBS后的第一個限制性酶切位點NdeI和多克隆位點區的Noc I之間插入大腸桿菌熱敏毒素B亞基(LT-B)的核酸序列構建而成，其結構如圖1所示。
其中LT-B的核酸序列的前端帶有起始密碼子ATG和完整的信號肽序列，末端去除終止密碼子，且與其后的多克隆位點直接相連。
pET-LTB的構建過程如下1.合成引物本發明合成的上、下游引物分別為P15’-GCGCAT ATGAAT AAA GTA AAA TGT TATGTT-3’；P25’GTCCCA TGGGTT TTC CAT ACT GAT TGC CGC-3’。在引物P1中引入了Nde I酶切位點。引物P2中引入了Noc I酶切位點。
2.將LT-B基因克隆入pET32a載體LT-B基因克隆自致病性大腸桿菌E.coli O6H16(LT+，ST+)。經過高保真PCR擴增出的LT-B全基因首先克隆入pGEM(購自Promega公司)，經測序正確后，以Nde I和Noc I位點定向亞克隆入以同樣酶切的pET32a載體，即可獲得pET-LTB(構建過程參見圖2)，本發明的pET-LTB載體仍帶有質粒pET32a的啟動子、終止子及其它元件，因而其不但具有原有載體的表達與純化優勢，而且具有與LT-B融合分泌表達的特性。即pET-LTB既可以直接表達LT-B這一蛋白抗原，也可用于單個與多個串連的目的基因插入及表達，只要目的基因含有與pET-LTB載體上相同的酶切位點，就可按照基因工程的常規方法，將目的基因(可以是化學合成的小基因片段，也可以是PCR擴增的產物)插入pET-LTB載體，轉化大腸桿菌后，可以得到目的基因與LT-B相融合的分泌型表達。
本發明的特點及優點如下首先，LT-B本身是很強的免疫原，通過pET-LTB表達載體在大腸桿菌中表達的LT-B小分子肽產物可以刺激產生抗大腸桿菌熱敏毒素的抗體，具有預防產LT腸毒素性大腸桿菌腹瀉的作用。
其次，LT-B是一種公認的粘膜免疫激活因子，在與其融合表達的保護性抗原蛋白中，可以作為粘膜免疫佐劑提高疫苗的免疫活性，從而使經注射接種的疫苗可以通過口服、鼻噴等粘膜途徑進行預防接種。
第三，pET-LTB載體的多克隆位點區可以方便地進行基因間的連接，因此也可以作為多抗原與LT-B融合表達的理想載體。
第四，LT-B在pET-LTB中可以作為融合蛋白表達的一個檢測與純化標簽，利于目的抗原蛋白質的表達檢測與純化。
第五，LT-B的信號肽具有將所表達的目的蛋白分泌入大腸桿菌周質腔的作用，同時在目的蛋白末端又帶有6×HIS純化標簽，這在很大程度上克服了通常大腸桿菌以包涵體形式表達與表達產物純化困難的問題。
圖1.pET-LTB結構示意圖。
圖2.為pET-LTB構建過程示意圖。
圖3.為LT-B的PCR擴增與pET-LTB表達載體的雙酶切鑒定的電泳圖，其中(A)中lane1和2表示LT-B的PCR擴增結果電泳圖？(B)中lane1和2表示pET-LTB表達載體的雙酶切鑒定的電泳4為LT-B在pGEM-LTB中的全序列測定結果。
圖5為LT-B在pET-LTB中的全序列測定與MCS分析結果。
圖6為BL21(DE3)/pET-LTB誘導表達的周質液SDS-PAGE與Western-blot鑒定其中lane1為標準分子量蛋白；lane2和3為表達于周質液中蛋白質；lane4為Western-blot鑒定結果。
圖7為BL21(DE3)/pET-LTB-EGFP誘導表達于周質液的SDS-PAGE鑒定其中lane1為標準分子量蛋白，lane2-3為陽性E.coli BL21(DE3)經誘導表達分泌入周質的蛋白質；lane4為陰性E.coli BL21(DE3)經誘導表達后入細胞裂解液蛋白質。其中箭頭所指方向為誘導表達于周質液的LTB-EGFP。
具體實施例方式
為了進一步說明表達載體pET-LTB的構建及應用，參照下列實施例和附圖作進一步闡述，以使pET-LTB的構建及應用解釋的更為詳細、明了，但并不限制本發明的保護范圍。
實施例1pET-LTB的構建由NOVGE公司構建的pET32a表達載體是目前分子生物學與基因工程實驗室多利用的原核載體，其表達效果通常較好，易于操作，因此，我們選擇其接近核糖體結合位點(RBS)最近的起始密碼子ATG，并以包含這一密碼子的NdeI(CAT ATG)與多克隆位點區的第一個限制性酶切位點Noc I(CCA TGG)為LT-B基因的插入位點，且這兩個位點也是LT-B基因中不存在的，這樣也去除了pET32a中的一些不必要的序列，同時把含有信號肽序列的LT-B基因序列插入了pET32a，從而獲得pET-LTB表達載體。具體構建方法如下1、引物設計根據擴增需要及要引入的酶切位點，設計并合成如下引物上游引物P15’GCGCAT ATGAAT AAA GTA AAA TGT TAT GTT-3’(引入Nde I酶切位點)；下游引物P25’GTCCCA TGGGTT TTC CAT ACT GAT TGC CGC-3’(引入Noc I酶切位點)。
2、產腸毒素性大腸桿菌LT-B基因全序列的克隆以致病性大腸桿菌E.coli O6H16(LT+)培養的收集的菌落，在1.5ml離心管中，加無菌雙蒸水50μl，100℃煮沸5分鐘后，1200g離心10分鐘，取上清5μl為模板，分別用P1和P2引物進行PCR擴增，擴增體系為含鎂離子的10×擴增緩沖液10μl，4×dNTPs(10mmol)1.5μl，上下游引物(P1和P2)各1μl(25pmol/l)，Taq DNA聚合酶(5U/μl)1μl，加滅菌水至100μl。PCR擴增反應95℃5分鐘預變性后，以94℃變性50秒，57℃退火30秒，72℃延伸30秒，共30循環后，72℃延伸7分鐘，冷卻到4℃。經1％的瓊脂糖凝膠電泳加DNA Marker DL-2000確認有目的條帶后，用小量PCR產物快速純化試劑盒(杭州維特潔生物公司產品)按說明書方法純化。
3、LT-B插入pGEM-T vector質粒pGEM購自Promega公司。按照《分子克隆》的操作，將LT-B基因克隆入pGEM載體，構建重組質粒pGEM-LTB。
純化后的目的片段經加尾反應(+A Tailing)后，與pGEM-T vector連接，連接體系為純化后的LT-B加尾產物2μl，pGEM-T vector 1μl，2×T4DNA連接緩沖液5μl，12u/μl的T4DNA連接酶1μl，水1μl，14℃水浴過夜。連接產物42℃90秒轉化感受態大腸桿菌DH5α，在涂有IPTG/X-gal的LB/Amp是培養17-20小時。
采用藍/白斑篩選法，從LB/Amp平皿上選取生長的白色菌落，經菌落PCR鑒定擴增出約370bp的條帶后，提取質粒進行序列測定，結果如下，經分析發現含有起始密碼子、信號肽、成熟肽及終止密碼子的LT-B全序列已正確插入pGEM-T vector載體，即pGEM-LTB已構建成功。
…… aataaagtaaaatgttatgttttatttacggcgttactatcctctctatgtgcatacggagctccccagtctattacagaactatgttcggaatatcgcaacacacaaatatatacgataaatgacaagatactatcatatacggaatcgatggcaggtaaaagagaaatggttatcattacatttaagagcggcgcaacatttcaggtcgaagtcccgggcagtcaacatatagactcccaaaaaaaagccattgaaaggatgaaggacacattaagaatcacatatctgaccgagaccaaaattgataaattatgtgtatggaataataaaacccccaattcaattgcggcaatcagtatggaaaac ……4、表達載體pET-LTB的構建與鑒定以質粒pGEM-LTB為模板，分別用P1和P2引物進行PCR擴增，擴增體系為含鎂離子的10×擴增緩沖液10μl，4×dNTPs(10mmol)1μl，上下游引物(P1和P2)各1μl，上述質粒模板1μl，pfu DNA聚合酶(5U/μl)1μl，加滅菌水至100μl。
PCR擴增反應同前所述，共30循環。用小量PCR產物純化試劑盒(杭州維特潔生物公司產品)按說明書方法純化。純化的PCR產物與pET32a質粒均用Nde I和Noc I酶切。酶切體系為5μl10×酶切緩沖液(K)，水21μl，10×BSA 5μl，純化產物30μl，Nde I和Noc I酶各2.5μl(10單位/μl)，加水至50μl，37℃水浴5小時。酶切后產物分別用瓊脂糖凝膠電泳分離。用離心式小量膠回收試劑盒(杭州維特潔生物公司產品)按說明書方法回收。
插入連接，連接體系為雙酶切后線性質粒pET32a 2μl、雙酶切后LT-B片段5μl，10×T4DNA連接緩沖液1μl，T4DNA連接酶(12u/μl)1μl，加水至總體積10μl，14℃水浴過夜。
大腸桿菌DH5α為本室保存，復蘇活化冷凍的菌株后，按，《分子克隆》(科學出版社，第二版)的CaCl2方法制備感受態；取感受態細胞100μl，加入連接產物5μl，輕輕旋轉以混勻內容物，在冰浴中放置30分鐘，立即轉到42℃水浴中放置2分鐘，然后每管加入0.5ml不加抗生素的LB培養基，37℃水浴中15分鐘后，37℃搖床輕搖45分鐘，取100μl轉化菌體，均勻涂布于含100mg/ml氨芐的瓊脂平板培養基上，室溫晾干后，37℃倒置培養過夜。
從平皿上選取生長的菌落，提取質粒進行酶切鑒定，用Nde I和Noc I酶切，雙酶切體系同上，用1.0％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定的結果可見(如圖3-B所示)，除約5kb的載體外，還可看到370bp的目的條帶，測序結果與構建分析結果如下，結果表明，LT-B片段確已裝入pET32a載體，即pET-LTB構建成功，至此完成了此載體系統的構建與鑒定。
taatacgactcactataggggaattgtgagcggataacaattcccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgaataaagtaaaatgttatgttttatttacggcgttactatcctctctatgtgcatacggagctccccagtctattacagaactatgacggaatatcgcaacacacaaatatatacgataaatgacaagatactatcatatacggaatcgatggcaggtaaaagagaaatggttatcattacatttaagagcggcgcaacatttcaggtcgaagtcccgggcagtcaacatatagactcccaaaaaaaagccattgaaaggatgaaggacacattaagaatcacatatctgaccgagaccaaaattgataaattatgtgtatggaataataaaacccccaattcaattgcggcaatcagtatggaaaacccatggctgatatcggatccgaattcgagctccgtcgacaagcttgcggccgcactcgagcaccaccaccaccaccactgagatccggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg5、pET-LTB載體在大腸桿菌中的周質腔分泌表達與鑒定轉化有pET-LTB載體的大腸桿菌BL21(DE3)(購自美國Stratagene公司)，在30℃培養2小時后轉入42℃誘導培養2.5小時，制備大腸桿菌周質腔分泌蛋白溶液做聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，分離膠濃度為15％，操作過程見《分子克隆》，結果如圖(6)所示，在17kd處有一深染帶，表明插入LT-B得到了高效的表達。大腸桿菌周質腔分泌蛋白的制備方法為改良的滲透休克法(Modified Osmotic Shock)經誘導表達后的菌液100ml經8000g，4℃離心10分鐘，收集菌體，以上述條件用去離子無菌水洗2次后，以4℃5mM的CaCl2懸浮靜置5分鐘，加入4℃8ml pH8.0的含33mM Tris.HCl(pH8.0)和5mM Na2EDTA的20％(w/v)的蔗糖溶液，混勻后哺育10分鐘，經8000g，4℃離心10分鐘，去上清，將細胞懸浮于8ml 4℃的去離子無菌水中10分鐘，以8000g，4℃離心10分鐘，收集上清，既為含有周質腔分泌蛋白的溶液。
實施例2目的基因EGFP和LT-B的融合與分泌性表達1.目的基因的插入以模式蛋白——增強性綠色熒光蛋白(EGFP)基因的插入為例，將構建于pGEM-T-egfp上的EGFP基因采用EcoR I和XhoI雙酶切，對載體pET-LTB也采用同樣的酶雙酶切，然后使酶切后的基因和載體連接為pET-LTB/EGFP表達載體，然后轉化、誘導表達等操作均同實施例1例所述。
2.表達質粒的PCR鑒定以EGFP基因為例，以純化后pET-LTB/EGFP為模版，以Pegfp1為正向引物，Pegfp2為反向引物進行PCR擴增，擴增體系為含鎂離子的10×擴增緩沖液10μl，4×dNTPs(10mmol)1μl，上下游引物(Pegfp1和Pegfp2)各1μl，上述質粒模板1μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)1μl，加滅菌水至100μl。PCR擴增反應94℃5分鐘變性后，以94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，共30循環。擴增產物在1.0％瓊脂糖凝膠上電泳，可擴增出約720bp的特異帶，證明EGFP基因已插入pET-LTB表達載體中。
3.基因表達的SDS-PAGE鑒定以模式蛋白EGFP為例，基因表達的鑒定過程如下取插入EGFP基因的表達載體pET-LTB/EGFP，按照實施例1方法進行轉化、培養和IPTG誘導培養，將離心收集的全菌體采用實施1例所述的改良的滲透休克法，取分泌到周質腔液進行SDS-PAGE，膠濃度為12％，鑒定結果如圖7。區帶LTB-EGFP在約38KDa處有一條深染帶，和EGFP與LT-B融合后的理論分子量相一致，而與之對照的未攜帶表達載體的大腸桿菌全菌體裂解液表達蛋白中，卻在相應位置未見此蛋白的表達。
4.LT-B-EGFP融合蛋白的Western Blotting鑒定將以上和LT-B融合表達的蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，其中包括未經誘導的BL21細胞裂解液作為陰性對照。SDS-PAGE電泳結束時，切出含待轉移蛋白的凝膠，剪6張同樣大小的Whatman 3mm濾紙和1PVDF，用軟鉛筆在PVDF膜一角做好標記。將它們漂浮于ddH2O水平面上，潤濕后浸于水中5min，驅除膜上的氣泡，再浸泡于轉移緩沖液(39mmol/L甘氨酸，48mmol/L Tris，0.037％SDS，20％甲醇)中。在塑料支架上依次疊放浸濕的海綿、3層濾紙、凝膠、PVDF、3層濾紙和海綿，使濾紙、凝膠和PVDF對齊，且各層之間無氣泡存在；將塑料支架夾緊插入電轉移槽中；PVDF膜一側接陽極，凝膠一側接陰極，加轉移液(39mmol/L甘氨酸，48mmol/LTris.Cl，0.037％SDS，20％甲醇)沒過凝膠，以30V～35V電壓，4℃轉移14～16h。轉移完畢，分離出的目的蛋白由semi-dry transfer apparatus(Bio-RadLaboratories)轉移至PVDF膜上。將膜用封閉緩沖液(PBST中含有5％脫脂奶粉)封閉1小時。進行三次洗滌，每次用PBST洗10分鐘，之后室溫下與一抗溫育1小時。同樣三次洗滌后，在由辣根過氧化物酶標記的二抗山羊抗小鼠IgG1 1∶1000稀釋液中溫育1小時。再經三次洗滌后，膜用ECL Western Blotting檢測試劑(Amersham Pharmacia Biotech.)處理后送去暗室曝光。Western Blotting結果如圖6所示。
結果表明實施例中將LT-B克隆入所構建的載體系統中后，在周質液中獲得了較高的表達水平，并很好地保存其原有的抗原活性，而且在引入了模式蛋白EGFP后，具有表達融合蛋白的功效。這為LT-B與其它保護性抗原基因一起融合表達，產生粘膜免疫提供了驗證與方法上的借鑒。由此也驗證了所構建的表達載體系統的實踐意義與開發價值。
SEQUENCE LISTING(1)<110>華東理工大學<120>一種用于原核分泌、融合表達大腸桿菌熱敏毒素B亞單位的載體<130>說明書<140>200510028084.0<141>2005-07-25<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>375<212>DNA<213>人工序列<400>1atgaataaag taaaatgtta tgttttattt acggcgttac tatcctctct atgtgcatac60ggagctcccc agtctattac agaactatgt tcggaatatc gcaacacaca aatatatacg120ataaatgaca agatactatc atatacggaa tcgatggcag gtaaaagaga aatggttatc180attacattta agagcggcgc aacatttcag gtcgaagtcc cgggcagtca acatatagac240tcccaaaaaa aagccattga aaggatgaag gacacattaa gaatcacata tctgaccgag300accaaaattg ataaattatg tgtatggaat aataaaaccc ccaattcaat tgcggcaatc360agtatggaaa actag 375
SEQUENCE LISTING(2)<110>華東理工大學<120>一種用于原核分泌、融合表達大腸桿菌熱敏毒素B亞單位的載體<130>說明書<140>200510028084.0<141>2005-07-25<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>652<212>DNA<213>人工序列<400>1taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa ttcccctcta gaaataattt60tgtttaactt taagaaggag atatacatat gaataaagta aaatgttatg ttttatttac120ggcgttacta tcctctctat gtgcatacgg agctccccag tctattacag aactatgttc180ggaatatcgc aacacacaaa tatatacgat aaatgacaag atactatcat atacggaatc240gatggcaggt aaaagagaaa tggttatcat tacatttaag agcggcgcaa catttcaggt300cgaagtcccg ggcagtcaac atatagactc ccaaaaaaaa gccattgaaa ggatgaagga360cacattaaga atcacatatc tgaccgagac caaaattgat aaattatgtg tatggaataa420taaaaccccc aattcaattg cggcaatcag tatggaaaac ccatggctga tatcggatcc480gaattcgagc tccgtcgaca agcttgcggc cgcactcgag caccaccacc accaccactg540agatccggct gctaacaaag cccgaaagga agctgagttg gctgctgcca ccgctgagca600ataactagca taaccccttg gggcctctaa acgggtcttg aggggttttt tg65權利要求
1.一種用于原核分泌、融合表達大腸桿菌熱敏毒素B亞單位(E.coli heat-labile enterotoxinB subunit，LT-B)的載體，其特征在于，所說的載體是以pET32a為基礎骨架的閉環質粒，在pET32a的RBS后的第一個限制性酶切位點Nde I和多克隆位點區的Noc I之間插入大腸桿菌熱敏毒素B亞基(LT-B)的核酸序列構建而成，即pET-LTB；其中LT-B的核酸序列的前端帶有起始密碼子ATG和完整的信號肽序列，末端去除終止密碼子，且與其后的多克隆位點直接相連。
2.如權利要求1所說的載體，其特征在于，其中LT-B的核酸序列是克隆自致病性大腸桿菌E.coli O6H16(LT+，ST+)，經引物P15’-GCGCAT ATGAAT AAA GTA AAA TGT TATGTT-3’，P25’GTCCCA TGGGTT TTC CAT ACT GAT TGC CGC-3’PCR擴增而得。
全文摘要
本發明涉及一種用于原核分泌、融合表達大腸桿菌熱敏毒素B亞單位(E.coli heat－labileenterotoxin B subunit，LT－B)的載體，其是一個以pET32a為基礎骨架的閉環質粒，在pET32a的RBS后的第一個限制性酶切位點Nde I和多克隆位點區的Noc I之間插入人源大腸桿菌熱敏毒素B亞基(LT－B)的核酸序列構建而成，即pET－LTB。應用本發明所述的表達載體既可實現LT－B的原核分泌表達(克服包涵體表達形式的缺陷)，同時又能與其保護性抗原蛋白融合表達(形成粘膜疫苗便于接種)。
文檔編號C12N15/66GK1769458SQ20051002808
公開日2006年5月10日 申請日期2005年7月25日 優先權日2005年7月25日
發明者魏東芝, 馬興元, 王天文, 鄭文云 申請人:華東理工大學