專利名稱：一種抗艾滋病表面糖蛋白的全人單克隆抗體及其制備方法
技術領域：
本發明屬于生物醫學領域，有關于一種抗艾滋病表面糖蛋白的全人單克隆抗體及其制備方法，尤其有關于一種抗艾滋病表面糖蛋白gp41的全人單克隆抗體及其制備方法。
背景技術：
自首例艾滋病(AIDS)于1981年6月被美國疾病控制中心(CDC)確認以來，艾滋病橫行肆虐于全球，嚴重威脅著人類的健康和生存。據聯合國艾滋病規劃署和世界衛生組織的最新統計，截至2001年底，全世界共有500萬人感染上艾滋病毒，至少有4000萬艾滋病毒攜帶者，其中270萬人是15歲以下的兒童。在全球范圍內，AIDS是十大主要死因之一。按目前發展趨勢預測，在不久的將來，AIDS死亡將替代一些常見死因而進入五大死因之列。我國自1985年在云南發現首例AIDS以來，HIV感染人數不斷上升，尤以近年來發展勢頭迅猛，目前據專家估計，我國實際HIV感染者可能已逾100萬，流行學研究表明入侵我國的艾滋病病毒現已有兩個病毒類型(HIV I、HIV II)及其8種亞型分類，兩個病毒類型間還存在有混合。因此積極尋找抗艾滋病藥物、控制HIV的感染，已經越來越被關注。
自齊多夫定(AZT)—第一個治療HIV感染藥物于1987年被美國FDA批準上市后，抗艾滋病藥物的研究發展突飛猛進，目前國外已有14個藥物上市，主要針對HIV復制過程的關鍵酶-HIV逆轉錄酶(HIVRT)及HIV蛋白酶(HIVPR)。自1995年以來，每年都有2至3個新品種上市，是抗病毒藥物發展史上進展最迅速的藥物，充分說明國際上為研制抗艾滋病藥物已投入了巨大人力、財力，以期克制這一危害人類健康的元兇，同時也說明了迄今還未出現能完全控制HIV感染的藥物，生命科學工作者開始努力尋找新的有效治療途徑。
艾滋病主要是HIV I感染導致，HIV I入侵宿主細胞的過程分為兩個步驟受體識別和膜融合。HIV I首先識別宿主細胞表面的特異受體蛋白并與之相結合。這種結合引發了病毒和宿主細胞表面的復雜構象變化，導致HIV I包膜與宿主細胞質膜相融合，使得HIV I核心顆粒進入宿主細胞的原生質中。HIV I入侵人體過程中起核心作用的是包膜糖蛋白，新型的抗病毒藥物設計旨在切斷這一個感染的關鍵門戶。
HIV I入侵的第一步是gp120與細胞表面的受體分子CD4相結合，gp120的糖基化程度很高，其分子量有一半以上來自糖鏈，序列對比分析表明，不同HIV I株中gp120的變異程度很高，這也是HIV I易于逃避gp120抗體的主要原因(Modrow S，Hahn B H，Shaw G M，et al，J Virol，1987；61570)。共受體在HIV I入侵中的作用不容忽視，嗜T細胞HIV I感染必需的輔助因子-融合素(fusin)(Feng Y，Broder C C，Kennedy P E，et al，Science，1996；272872)，即CXCR4；初始嗜巨嗜細胞HIV I株需要共受體CCR5(Atchison R E，Gosling J，Monteclaro F S，et al，Science，1996；2741924)。gp120與CD4以及CXCR4或CCR5形成一種復雜的結構，而決不僅僅是簡單的位點結合。這種結構一旦形成，就使gp120與gp41脫離，從而啟動了HIV I入侵宿主細胞的下一過程膜融合。
基于上述原理，已有不少公司分別正在開發以CXCR3和CCR5為藥靶的新藥。目前Trimeris和Hoffmann-La Roche公司針對gp41抗原，已經開發出多肽抗體藥物T20(36個氨基酸)。T-20在作用其他抗病毒藥物治療失敗的病人時，結果表明在78個至少用過11種抗艾滋病藥物治療的病人中，55-60％的病人體內HIV的載量下降了90％，在治療4個月后，1/3的病人體內不再檢測到HIV的存在。實驗的結果表明了以gp41為靶點開展藥物研究的可行性。以gp41為靶點的藥物T-20已經上市，但在長期使用病人身上出現許多問題，如T-20分子太小，很容易產生抗性；遇酸不穩定，不能進行口服；一天要靜脈注射兩次等。
患者感染HIV后，會產生抗HIV包膜糖蛋白的抗體，臨床研究表明，被動性免疫治療(passive immunotherapy，PIT)，即轉輸感染早期并具有較強抗艾滋病抗體的患者的血清，對艾滋病的晚期患者有一定的保護作用，能延緩病程的惡化，增加艾滋病患者的平均生存時間，PIT與現有的化學藥物治療相比無明顯副作用，這預示中和性抗體是治療艾滋病的更佳途徑。
發明內容
本發明的主要目的在于提供一種抗艾滋病病毒表面糖蛋白gp41的全人單克隆抗體，其為全人抗體，沒有鼠源性異種蛋白，無副作用。
本發明的另一目的在于提供一種抗艾滋病病毒表面糖蛋白gp41的全人單克隆抗體，其為無需抗體分子結構的變構轉換及拼接等，技術更為簡便，高通量篩選，開發周期短。
本發明的再一目的在于提供一種抗艾滋病病毒表面糖蛋白gp41的全人單克隆抗體，其為生產工藝簡單，抗體產量高。
本發明的再一目的在于提供一種抗艾滋病病毒表面糖蛋白gp41的全人單克隆抗體，其為與人體內天然產生的抗體完全一致，具有經過人體整個免疫系統擇優選擇篩選的、最優的特異性親和力和結合力。
為了實現上述目的，本發明提供了一種抗艾滋病病毒表面糖蛋白gp41的全人單克隆抗體。其特征為通過人-人雜交瘤技術或其他單克隆抗體技術制備得到；具有序列9報道的重鏈和序列10報道的輕鏈；沒有鼠源性異種蛋白；以及，與人體內天然產生的抗體完全一致，具有經過人體整個免疫系統擇優選擇篩選的、最優的特異性親和力和結合力。
為了實現上述目的，本發明還同時提供有一種抗艾滋病病毒表面糖蛋白gp41的全人單克隆抗體的制備方法。其特征是至少包括如下步驟(a)篩選產生高滴度gp41抗體的病人，分離艾滋病患者的外周血B細胞；(b)將人骨髓瘤Karpas 707H和外周血B細胞融合產生雜交瘤；
(c)篩選產生gp41高親和力抗體的雜交瘤；(d)制備和純化抗體；(e)抽提細胞總mRNA，通過通用引物，獲得抗體序列；以及，(f)裝入T載體進行測序。
如本領域的普通技術人員所知，一種氨基酸可以有多種密碼子編碼，但密碼子編碼獲得的氨基酸序列不變。因此本發明提供了一種核酸密碼子序列，但并不僅限于這種核酸序列。
圖1為本發明中通用引物序列1的名稱和描述。
圖2為本發明中通用引物序列2的名稱和描述。
圖3為本發明中通用引物序列3的名稱和描述。
圖4為本發明中通用引物序列4的名稱和描述。
圖5為本發明中通用引物序列5的名稱和描述。
圖6為本發明中通用引物序列6的名稱和描述。
圖7為本發明中重鏈基因序列7的名稱和描述。
圖8為本發明中輕鏈基因序列8的名稱和描述。
圖9為本發明中重鏈蛋白序列9的名稱和描述。以及，圖10為本發明中輕鏈蛋白序列10的名稱和描述。
具體實施例方式
本發明提供了一種抗艾滋病病毒表面糖蛋白gp41的全人單克隆抗體。該抗體具有序列9報道的重鏈和序列10報道的輕鏈，沒有鼠源性異種蛋白，與人體內天然產生的抗體完全一致，具有經過人體整個免疫系統擇優選擇篩選的、最優的特異性親和力和結合力。該抗體可以用于臨床上艾滋病的診斷和治療。
同時，本發明還提供有一種該抗體的制備方法，以下通過一個較佳實施例對該方法所至少包含的步驟作出說明。
(a)篩選產生高滴度gp41抗體的病人，分離艾滋病患者的外周血B細胞。
選擇100名自愿者，均為艾滋病患者，各自去靜脈血5ml，分離血清，-20℃保存，經商業化gp41試劑盒篩選，抗gp41抗體陽性且滴度大于1；64的病人為目標自愿者，然后在目標自愿者取外周血50ml，加淋巴細胞分層液，200g離心，取界面B細胞層，取100ul B細胞做免疫珠試驗判斷是否致敏。合并致敏的B細胞，用RPMI 1640洗滌3次。
(b)人骨髓瘤Karpas 707H和外周血B細胞融合產生雜交瘤。
用RPMI 1640調B細胞至5×106/ml，人骨髓瘤細胞Karpas 707H用RPMI1640調至2×106/ml。將Karpas 707H與致敏人B細胞各1ml混合，在2分鐘內逐滴加入新鮮配制的2mlPEG-2000，然后立即快速滴入50ml RPMI 1640終止PEG作用，200g離心5分鐘，棄上清，重復加入50ml RPMI 1640洗滌，將融合細胞用HAT培養基配制成1×106/ml，預培養飼養細胞一天，在96孔細胞培養板中每孔加入100ul，HAT RPMI 1640培養10天(37℃，5％CO2)，轉HT RPMI 1640培養7天。
(c)篩選產生gp41高親和力抗體的雜交瘤。
用于篩選克隆的96孔微孔板用gp41胞外區包被，每孔加100ul細胞培養上清，37℃培養過夜，洗滌后加HRP標記的鼠抗人IgG Fc mAb，37℃培養30分鐘，洗滌后加入底物(TMB)顯色，OD值大于10×空白OD值為陽性，得到陽性克隆。
(d)制備和純化抗體。
將陽性克隆雜交瘤細胞調為1×106/ml，在RPMI 1640添加10％FBS的培養基中37℃培養過夜，1000g離心5分鐘取上清，測抗體滴度為1∶20000，共80ml，加等量50％的甘油，-20℃保存。用gp41抗原的胞外段經CNBr偶聯到sephrose 4B制備全人gp41單克隆抗體親和層析柱，全人gp41單克隆抗體親和層析柱用0.01M PB，pH6.8，0.1mM a-mercaptothanol BufferA預平衡4小時，4℃保存。其操作是首先將160ml含全人gp41單克隆抗體的上清，假如200ml柱體積的親和層析柱中，4℃過夜，然后用BufferA充分流洗到OD280小于0.01，流速8ml/min，用0.01M PB，pH6.8，0.1mM a-mercaptothanol，150mM NaCl Buffer B洗脫，流速2ml/min，收集OD280＞0.02的部分，冷凍干燥，得到純化的全人gp41單克隆抗體。
(e)抽提細胞總mRNA，通過通用引物，獲得抗體序列；以及，(f)裝入T載體進行測序。
根據抗體氨基酸及核酸序列，設計通用引物H5，H3，κ5，κ3，λ5，λ3如下。通用引物分別為序列1，2，3，4，5，和6，其名稱和描述分別見圖1至圖6。在序列1至6中，M＝A/C，R＝A/G，W＝A/T，S＝G/C，Y＝C/T，K＝G/T，V＝A/G/C，H＝A/C/T，D＝A/G/T，B＝G/C/T。
取表達量最高的雜交瘤細胞約2×106個，用Qiagen公司的blood mini RNA抽提試劑盒抽提總RNA，然后取2ul RNA為模板，以Oligo(dT)20為逆轉錄引物，用Invitrogen公司的SuperScriptIIIFirst-Strand Synthesis System for RT-PCR試劑盒進行逆轉錄。取逆轉錄產物1ul作為PCR模板，分別以H5+H3引物、κ5+κ3引物、λ5+λ3引物，用Roche公司的Expand HighFidelityPLUSPCR System擴增抗體基因，反應體系為5×Expand HiFiPLUSReaction Buffer 10ul，模板1ul，5’和3’引物各1ul，dNTP(10mM each)1ul，25mM MgCl21ul，Expand HiFiPLUSEnzyme 0.5ul，無菌水補加到50ul。反應條件為94℃30秒，54℃30秒，72℃2分鐘，共進行30個循環。反應結束后取3ul電泳檢測，發現H5+H3引物組和λ5+λ3引物組擴增出特異性單一條帶，而κ5+κ3引物組無特異性條帶擴出。電泳回收重鏈PCR產物和λ鏈PCR產物，分別連接克隆到pGEM-T載體中，進行基因測序，分別獲得名稱和描述如圖7、圖8所示的重鏈及輕鏈(λ鏈)基因序列7和序列8，翻譯得到名稱和描述分別如圖9和圖10所示的重鏈及輕鏈(λ鏈)蛋白序列9和序列10。
如本技術領域的人所知，本發明的附圖和實施例僅為說明本發明的功能、結構和原理而不應當成為對本發明理解上的限制；同時，本發明的目的均已經實現。上述實施例可能在不脫離本發明原理的情況下有所變更，故此，本發明的保護應以權利要求書中所描述的范圍為準。
權利要求
1.一種抗艾滋病病毒表面糖蛋白gp41的全人單克隆抗體。其特征為所述抗體為通過人-人雜交瘤技術或其他單克隆抗體技術制備得到；具有如序列9報道的重鏈和如序列10報道的輕鏈；沒有鼠源性異種蛋白；以及，與人體內天然產生的抗體完全一致，具有經過人體整個免疫系統擇優選擇篩選的、最優的特異性親和力和結合力。
2.一種如權利要求1中所述的抗體的制備方法，其特征是至少包括如下步驟(a)篩選產生高滴度gp41抗體的病人，分離艾滋病患者的外周血B細胞；(b)將人骨髓瘤Karpas707H和外周血B細胞融合產生雜交瘤；(c)篩選產生gp41高親和力抗體的雜交瘤；(d)制備和純化抗體；(e)抽提細胞總mRNA，通過通用引物，獲得抗體序列；以及，(f)裝入T載體進行測序。
全文摘要
本發明揭露了一種抗艾滋病病毒表面糖蛋白gp41的全人單克隆抗體及其制備方法。該抗體通過人－人雜交瘤技術或其他單克隆抗體技術制備得到，具有如說明書中序列9報道的重鏈和序列10報道的輕鏈，沒有鼠源性異種蛋白，并且與人體內天然產生的抗體完全一致，具有經過人體整個免疫系統擇優選擇篩選的、最優的特異性親和力和結合力。該種抗艾滋病病毒表面糖蛋白gp41的全人單克隆抗體的制備方法至少包括如下步驟(a)篩選產生高滴度gp41抗體的病人，分離艾滋病患者的外周血B細胞；(b)將入骨髓瘤Karpas707H和外周血B細胞融合產生雜交瘤；(c)篩選產生gp41高親和力抗體的雜交瘤；(d)制備和純化抗體；(e)抽提細胞總mRNA，通過通用引物，獲得抗體序列；以及，(f)裝入T載體進行測序。
文檔編號C12N5/22GK1931876SQ200510027880
公開日2007年3月21日 申請日期2005年7月19日 優先權日2005年7月19日
發明者倪健, 楊子義, 羅鵬, 楊武劍 申請人:上海富純中南生物技術有限公司