專利名稱：鱗翅目害蟲的高毒力核型多角體病毒構建技術的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及一種利用雙鏈RNA干涉等現代分子生物學手段，改造野生核型多角體病毒(NPV)，構建鱗翅目害蟲的高毒力NPV的技術。
背景技術：
鱗翅目昆蟲，如尺蠖、毛蟲等，是為害農作物的重要害蟲種類之一。這些害蟲大量發生時，造成作物嚴重減產和品質劣化。因此，尺蠖等鱗翅目昆蟲是農作物生產上的重要防治對象之一。目前生產上應用的農藥主要有兩類一類是化學合成農藥，如菊酯類農藥、有機磷農藥和殺蟲脲等；另一類是生物農藥，如核型多角體病毒(NPV)制劑、蘇云金桿菌(Bt)制劑以及一些捕食性昆蟲等。化學合成農藥，防治速度快、效果好，但容易引起農產品的農藥殘留、環境污染以及害蟲的抗藥性問題。生物農藥NPV屬于昆蟲桿狀病毒，其外被為多角體蛋白，其內為雙鏈環狀DNA分子。游離NPV病毒粒子可通過昆蟲進食和體壁創傷感染；而具有包含體的NPV病毒只能由昆蟲進食感染，進入害蟲中腸的NPV粒子在消化液的作用下，多角體蛋白被破壞并釋放出游離病毒粒子，之后通過附著、融合、去殼等過程進入害蟲細胞，并在核中大量復制并利用宿主細胞核糖體合成多角體包裝成完整的NPV。受NPV侵染的害蟲逐漸出現拒食等癥狀，最終死亡。但是，野生型的NPV病毒株侵染率低，潛伏期長，殺蟲速度慢，防治效果不理想。因此，NPV生物農藥在實際生產中推廣應用還比較有限。
幾丁質是尺蠖等鱗翅目害蟲的卵膜、蛹殼、幼蟲表皮和中腸圍食膜以及成蟲體壁等組織的重要組分。而幾丁質是由尿嘧啶二磷酸-N-乙酰-葡糖胺通過β-1，4方式連接形成的聚合物，該反應由幾丁質合成酶(CS)催化完成。CS為大分子量的細胞膜結合蛋白，主要由位于細胞膜內側的催化活性中心和多個親脂跨膜區域組成。
雙鏈RNA介導的基因干涉(dsRNAi)是近年來分子生物學最突出的科研成果之一。它是一段由21-25nt組成的RNA分子，通過對靶RNA進行特異性降解而“敲除”目的基因，導致基因轉錄后沉默。dsRNAi技術比反義基因技術更加高效、更加特異，因此已廣泛應用于生物基因表達調控研究。
發明內容
本發明在克隆尺蠖等鱗翅目害蟲幾丁質合成酶(CS)基因保守序列的基礎上，根據dsRNAi可有效“敲除”目標基因的原理，構建包含鱗翅目害蟲CS基因dsRNAi序列的載體，并通過酶切和連接反應將該序列成功導入野生型NPV基因組，利用NPV原有的侵染和表達系統，使CS dsRNAi序列在尺蠖等鱗翅目害蟲細胞中表達，抑制害蟲細胞內源的CS基因活性，破壞幾丁質合成，缺乏幾丁質合成的茶尺蠖將無法形成正常的細胞壁，不能進行有效的細胞分裂和生長，而且害蟲重要的消化器官“中腸圍食膜”因為缺乏幾丁質而喪失正常消化功能，最終導致害蟲死亡。改造后的新型NPV具有更快的擴散和再侵染速度，更高毒力和更好防治效果。
本發明鱗翅目害蟲高毒力核型多角體病毒的構建技術包括以下步驟1、鱗翅目害蟲幾丁質合成酶(CS)基因保守序列經克隆純化后連接到pUcm-T載體并轉化大腸桿菌，經抗性篩選獲包含CS保守序列的pUCm-T載體(pUCm-T-CS)；2、通過酶切和連接將CS插入雙鏈干涉序列(dsRNAi)中間載體，獲包含CS雙鏈干涉序列的載體pFGC5941-CS-intron-CSr，經驗證后轉化大腸桿菌擴增；3、將pFGC5941-CS-intron-CSr中間載體雙酶切后獲得的CS-intron-CSr序列插入包含多角體基因(ph)的pFASTBacI-ph質粒，構建pFASTBacI-ph-CS-intronCSr；4、將pFASTBacI-ph-CS-intron-CSr轉化包含NPV DNA(Bacmid)和幫助質粒的大腸桿菌(DH10Bac)，獲包含CS雙鏈干涉序列的重組NPV；5、將上述重組NPV侵染草地葉蛾細胞株sf9擴增，經篩選獲高毒力重組NPV。
按本技術方案所獲高毒力重組NPV應用于植物鱗翅目害蟲的防治。
上述步驟進一步敘述如下①.尺蠖等鱗翅目害蟲CS保守序列克隆根據鱗翅目害蟲CS基因保守序列設計2-4對特異引物，提取害蟲mRNA，并進行RT-PCR，獲得CS基因保守序列，并進行序列分析驗證。CS基因RT-PCR產物純化后連到pUCm-T載體并轉化大腸桿菌，經過抗性篩選和PCR驗證，獲得包含CS保守序列的pUCm-T載體(pUCm-T-CS)。
②.鱗翅目害蟲CS基因dsRNAi中間載體構建重新合成兩對包含酶切位點的引物[其中1對包含Asc I(BssH I)/Swa I位點；另1對包含Xba I/BamH I]，以pUCm-T-CS為摸板，進行PCR擴增，獲得包含酶切位點的產物CS1和CS2。以Asc I/Swa I酶切CS1，并正向插入同樣酶切的pFGC5941中，構建pFGC5941-CS；以Xba I/BamH I酶切CS2，并反向插入同樣酶切的pFGC5941-CS中，獲包含CS雙鏈干涉序列的載體pFGC5941-CS-intron-CSr。將獲得的CS基因dsRNAi載體轉化大腸桿菌、PCR驗證和擴增。
③.包含CS雙鏈干涉序列的NPV轉移載體構建將提取的pFGC5941-CS-intron-CSr，以Asc I/Xba I雙酶切，回收CS-intron-CSr序列，并插入BssH I(與Asc I是同尾酶)/Xba I酶切的包含多角體基因(ph)的pFASTBac I-ph質粒，構建pFASTBac I-ph-CS-intron-CSr。
④.包含CS雙鏈干涉序列的重組NPVpFASTBac I-ph-CS-intron-CSr轉化DH10Bac(包含NPV DNA和幫助質粒的大腸桿菌)，獲得包含CS雙鏈干涉序列的重組NPV。并將重組NPV侵染草地葉蛾細胞株sf9，獲完整重組NPV。
⑤.新型重組NPV病毒分子生物學驗證和殺蟲能力評價通過PCR等方法對重組NPV進行驗證；以野生NPV病毒為對照，對重組NPV進行殺蟲能力評價和篩選，獲得高毒力的重組NPV。
圖1為本發明技術方案流程框圖。
具體實施例方式
實施例含茶尺蠖幾丁質合成酶(CS)雙鏈干涉基因序列的NPV構建方法1)取3齡茶尺蠖幼蟲1條約100mg，以Trizol(Invitrogen公司)試劑提取總RNA，電泳檢測RNA質量，并以GENQUENT分析RNA濃度。具體操作參照試劑和儀器說明。
2)以MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒(上海生工)合成茶尺蠖幼蟲cDNA第一鏈，具體操作參照試劑盒說明。
3)以特異引物對L-CS0/R-CS0(委托上海生工合成)進行RT-PCR。PCR條件如表1。
L-CS0 5’TTCGAATACGCCATCGGCCATTGGR-CS0 5’CCAACGATCCTCGCCCTGATCGTACTG
表1
4)上述PCR后獲192bp左右CS目標產物，經純化后與pUCm-T于16℃條件下連接過夜，連接產物pUCm-T-CS轉化感受態DH5α(上海生工)，經藍白斑篩選，以菌落PCR方法進行連接結果驗證，同時進行序列分析(序列分析委托上海聯合基因公司進行)，所獲得的CS基因序列為TTCGAATACG CCATCGGCCATTGGCTGCAA AAGGCCACGG AGCACATGATTGGCTGCGTG CTCTGTTCACCTGGATGCTT CTCCCTGTTC AGGGGCAAGGCCCTCATGGA TGACAATGTGATGAAGAAAT ACACGACACG GTCGGATGAGGCTCGTCACT ACGTGCAGTACGATCAGGGC GAGGATCGTT GG5)陽性菌落經擴繁后，抽提質粒。
6)重新合成以下兩對包含酶切位點的引物L-CS01/L-CS01和L-CS02/R-CS02(上海生工)，以包含CS序列的T載體(pUCm-T-CS)為模板，進行PCR擴增，獲得包含酶切位點的產物CS1和CS2。以Asc I/Swa I酶切CS1，并正向插入同樣酶切的pFGC5941，構建pFGC5941-CS；以Xba I/BamH I酶切CS2，并反向插入同樣酶切的pFGC5941-CS，獲包含CS雙鏈干涉序列的載體pFGC5941-CS-intron-CSr。將包含CS基因dsRNAi載體轉化大腸桿菌、PCR驗證和擴增。
L-CS01 5’AAGGCGCGCCTTCGAATACGCCATCGGCCATTGG(含Asc I(BssH I)位點)R-CS01 5’AAATTTAAATCCAACGATCCTCGCCCTGATCGTACTG(含Swa I位點)L-CS02 5’AATCTAGATTCGAATACGCCATCGGCCATTGG(含Xba I位點)
R-CS02 5’AAGGATCCCCAACGATCCTCGCCCTGATCGTACTG(含BamH I位點)7)獲得的質粒pFGC5941-CS-intron-CSr經Asc I/Xba I雙酶切，回收CS-intron-CSr序列，并插入BssH I(與Asc I是同尾酶)/Xba I雙酶切的包含多角體基因(ph)的pFASTBacI-ph質粒(Invitrogen公司)，構建pFASTBac I-ph-CS-intron-CSr。
7)將pFASTBac I-ph-CS-intron-CSr轉化DH10Bac(包含NPV DNA和幫助質粒的大腸桿菌，Invitrogen公司)，獲得包含CS雙鏈干涉序列的重組NPV DNA，具體操作參照有關試劑說明。
8)并將重組NPV侵染草地葉蛾細胞株sf9(Invitrogen公司)，獲完整重組NPV。
9)以不包含外源CS雙鏈干涉序列的野生NPV為對照，比較重組病毒對尺蠖幼蟲的侵染和毒殺能力的差異。具體做法為將上述培養獲得的重組NPV以及野生NPV病毒配制成3×104PIB/ml溶液，將茶樹葉片在病毒溶液中浸潤后，自然風干后分別飼喂3齡尺蠖幼蟲(每個處理30頭尺蠖，重復3次)，定時進行觀察并統計尺蠖死亡情況。結果顯示，含CS雙鏈干涉序列的重組病毒侵染尺蠖后，潛伏期縮短1倍以上，茶尺蠖感染前期死亡率超過對照50％以上。
說明上述方法構建的包含鱗翅目害蟲幾丁質合成酶雙鏈干涉基因序列的重組NPV是成功的。
權利要求
1.鱗翅目害蟲的高毒力核型多角體病毒構建技術，其特征在于如下步驟(1)鱗翅目害蟲幾丁質合成酶(CS)基因保守序列經克隆純化后連接到pUcm-T載體并轉化大腸桿菌，經抗性篩選獲包含CS保守序列的pUCm-T載體(pUCm-T-CS)；(2)通過酶切和連接將CS插入雙鏈干涉序列(dsRNAi)中間載體，獲包含CS雙鏈干涉序列的載體pFGC5941-CS-intron-CSr，經驗證后轉化大腸桿菌擴增；(3)將pFGC5941-CS-intron-CSr中間載體雙酶切后獲得的CS-intron-CSr序列插入包含多角體基因(ph)的pFASTBacI-ph質粒，構建pFASTBacI-ph-CS-intron-CSr；(4)將pFASTBacI-ph-CS-intron-CSr轉化包含NPV DNA(Bacmid)和幫助質粒的大腸桿菌(DH10Bac)，獲包含CS雙鏈干涉序列的重組NPV；(5)將上述重組NPV侵染草地葉蛾細胞株sf9擴增，經篩選獲高毒力重組NPV。
2.按權利要求1所述鱗翅目害蟲的高毒力核型多角體病毒構建技術，其特征在于按本技術所獲高毒力重組NPV應用于植物鱗翅目害蟲的防治。
全文摘要
鱗翅目害蟲的高毒力核型多角體病毒構建技術屬于生物技術領域，涉及一種利用雙鏈RNA干涉等現代分子生物學手段，改造野生核型多角體病毒(NPV)，構建鱗翅目害蟲的高毒力NPV的技術。本發明的高毒力核型多角體病毒的構建技術包括以下步驟①尺蠖等鱗翅目害蟲幾丁質合成酶(CS)基因保守序列的克隆；②鱗翅目害蟲CS基因dsRNAi中間載體構建；③包含CS雙鏈干涉序列的NPV轉移載體構建；④包含CS雙鏈干涉序列的NPV重組，并通過PCR等方法對重組NPV進行驗證。以野生NPV病毒為對照，對重組NPV進行殺蟲能力評價和篩選，獲得高毒力的重組NPV。改造后的新型NPV對鱗翅目害蟲具有更快的擴散和再侵染速度，更高毒力和更好防治效果。
文檔編號C12N15/63GK1804030SQ20051006213
公開日2006年7月19日 申請日期2005年12月21日 優先權日2005年12月21日
發明者陸建良, 梁月榮, 張廣輝, 林晨, 杜穎穎, 潘順順 申請人:浙江大學