專利名稱：：一種組成型表達載體及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及生物
技術領域：
中的一種組成型表達載體及其應用。
背景技術：
：木聚糖酶主要由腐生真菌和細菌產生，它能降解植物細胞壁中的木聚糖成分，并被證實在農業和工業各方面都具有重要的應用價值。木聚糖具有異源性，因而完全降解木聚糖需要多種酶的共同作用，其中β-1，4-D-木聚糖酶是其中一種關鍵酶，它能打斷主鏈上D-木糖殘基之間的β-1，4糖苷鍵，從而把多糖的骨架降解成短鏈的木寡糖。因此β-1，4-D-木聚糖酶在食品，飼料，和造紙工業中有著非常廣泛的應用。其中，耐高溫木聚糖酶XynB克隆自一種耐熱真細菌—海棲熱胞菌(Thermotogamaritima)MSB8，該酶的最適反應溫度為90℃，最適反應pH值為6.2，且在堿性條件下穩定，因此在工業上，特別是在紙漿漂白工藝上具有很好的應用價值(WinterhalterC，LieblW.TwoextremelythermostablexylanasesofthehyperthermophilicbacteriumThermotogamaritimaMSB8.AppliedandEnvironmentalMicrobiology，1995，61(5)1810-1815)。多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)具有許多優點，是當前國際上公認的最為理想的外源基因表達系統之一，許多基因已在其細胞中得到高效表達。多形漢遜酵母最適生長溫度為37℃-43℃(其它甲醇酵母為30℃)，生長速度較其它酵母快。由于其內含有特殊的甲醇代謝途徑，此途徑的關鍵酶是甲醇氧化酶(MOX)、甲醛脫氫酶(FMD)、二氫丙酮合成酶(DHAS)等。這些關鍵酶的合成均受甲醇的誘導，當以甲醇為唯一碳源時，這些酶被大量表達。因此這些酶基因的啟動子都是強誘導型啟動子，利用其作為外源基因的啟動子，可使外源基因在漢遜酵母中大量表達。其中MOX、FMD的啟動子已被廣泛應用。漢遜酵母質膜上H+-ATP酶基因(PMA1)的啟動子是近年新發現的漢遜酵母高效組成型啟動子。
發明內容本發明的目的是提供一種可在漢遜酵母中組成型表達外源基因的組成型表達載體。本發明所提供的組成型表達載體，是含有PMA1啟動子序列，多形漢遜酵母rDNA序列和分泌信號肽編碼基因序列的真核細胞表達載體。所述PMA1啟動子是漢遜酵母質膜上H+-ATP酶基因(PMA1)的啟動子。它可具有序列表中序列1的核苷酸序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQID№1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。所述多形漢遜酵母rDNA序列可具有序列表中序列2的核苷酸序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQID№2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。分泌信號肽可為釀酒酵母α因子(α-factor)的前導肽。所述分泌信號肽編碼基因可具有序列表中序列3的核苷酸序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQID№3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。所述高嚴謹條件可為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下雜交并洗膜。所述真核細胞表達載體優選為酵母表達載體，如酵母表達載體pPIC3，pPIC3K，pHIL-D1、pA0804、pA0815、pPSC3K。上述組成型表達載體可按照常規方法構建。本發明的組成型表達載體特別適合于在漢遜酵母中表達耐高溫木聚糖酶XynB。耐高溫木聚糖酶XynB編碼基因mxynB(64)(在GenBank的檢索編號為AY340789)。含有耐高溫木聚糖酶編碼基因mxynB的組成型表達載體為pPMA1-xynB(64)。含有pPMA1-xynB(64)的酵母菌株也屬于本發明的保護范圍。所述酵母菌株優選為多形漢遜酵母菌株，尤其優選為多形漢遜酵母ATCC34438。所述含有pPMA1-xynB(64)的酵母菌株優選為HpA16-pPMA1-xynB(64)9#。本發明的另一個目的是提供一種培養條件簡單，發酵時間短的表達耐高溫木聚糖酶的方法。本發明所提供的表達耐高溫木聚糖酶的方法，包括以下步驟1)將耐高溫木聚糖酶編碼基因插入上述組成型表達載體中得到耐高溫木聚糖酶組成型表達載體；2)將所述耐高溫木聚糖酶組成型表達載體導入多形漢遜酵母中，得到表達耐高溫木聚糖酶的工程菌；3)培養所述工程菌72-80小時，得到耐高溫木聚糖酶。所述耐高溫木聚糖酶組成型表達載體可為pPMA1-xynB(64)；所述工程菌可為含有pPMA1-xynB(64)的多形漢遜酵母ATCC34438株，優選為HpA16-pPMA1-xynB(64)9#；培養所述工程菌的碳源可為甘油。本發明的組成型表達載體由于采用了組成型啟動子PMA1啟動子，在以甘油作為碳源的甲醇酵母中就可以表達外源基因，無需甲醇的誘導；多形漢遜酵母rDNA是多拷貝的重復序列，可以提高轉化質粒在酵母染色體上的拷貝數，從而增加目的基因的拷貝數，更有利于外源基因的表達；利用釀酒酵母α因子(α-factor)的前導肽序列，可引導在多形漢遜酵母中表達的外源蛋白分泌到細胞外，更有利于后續的純化和應用，簡化提取蛋白的工序。利用本發明的組成型表達載體在漢遜酵母中表達外源蛋白，培養條件簡單，發酵時間短，表達產物可分泌到胞外，利于目的產物的提取，適合工業化應用。本發明利用組成型表達載體pPMA1-xynB(64)構建了表達耐高溫木聚糖酶的工程菌。該工程菌在搖瓶上培養，胞外耐高溫木聚糖酶分泌量達15mg/L，胞外耐高溫木聚糖酶活力達800U/L。該耐高溫木聚糖酶的最適反應溫度為90℃，在沸水浴中處理30分鐘后，仍能保持70％酶活力，分解木聚糖活性在90℃下，pH值為6.2-10.0范圍內穩定。本發明的組成型表達載體及其工程菌在耐高溫木聚糖酶的生產中具有廣闊的應用前景。具體實施例方式下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。下述實施例中的百分含量均為質量百分含量。實施例1、重組多形漢遜酵母表達載體pPMA1-xynB(64)的構建(1)漢遜酵母PMA1啟動子的克隆根據質粒pATP7(HelenCox，DavidMead，PeterSudbery，etal.ConstitutiveexpressionofrecombinantproteinsinthemethylotrophicyeastHansenulapolymorphausingthePMA1promoter.2000Yeast161191-1203)上的PMA1啟動子的序列以及表達載體pPIC3.5K(購自Inventrogen公司)上的限制性內切酶酶切位點的特征，設計合成引物FW5’-gtttaaacCAATTGGGTCTGGTTTGCCA-3’(帶下劃線的堿基為PmeI識別序列)REV5’-ggatccCCAATTGAACTGAAAGAAAAAAAGA-3’(帶下劃線的堿基為BamHI識別序列)以質粒pATP7為模板，擴增出PMA1啟動子序列(1976bp)，擴增條件為先預變性94℃5分鐘；再進行25個循環變性94℃30秒、退火56℃30秒、延伸72℃2分鐘；最后72℃延伸10分鐘。擴增產物(1976bp)回收連接到載體pGEM-TEasy上，挑選出含有PMA1啟動子序列的載體pGEM-T-PMA1P的陽性轉化子進行序列測定分析，結果表明pGEM-T-PMA1P中的PMA1啟動子序列正確。pGEM-T-PMA1P經PmeI和BamHI雙酶切后，將PMA1啟動子序列克隆至表達載體pPIC3.5k的PmeI和BanHI識別序列間，得到含有PMA1啟動子序列的表達載體pPIC3.5k-PMA1P。(2)漢遜酵母rDNA序列的克隆以限制性內切酶NotI酶切質粒pATP7，得到漢遜酵母rDNA片段，把該片段連接到以NotI酶切的pPIC3.5k-PMA1P質粒中，得到含有PMA1啟動子序列和漢遜酵母rDNA序列的表達載體pPIC3.5k-PMA1P-rDNA。(3)耐高溫木聚糖酶基因的克隆根據畢赤酵母表達載體pPIC9K-xynB(64)(按照申請號為200310113562.9的中國專利申請制備pPIC9K-xynB(64)的方法得到)基因兩端的序列，設計合成以下引物FW5’-CCCggatccAAACGATGAGATTT-3’(帶下劃線的堿基為BamHI識別序列)REV5’-CCCggatccCGATAAGCTTGCACAAAC-3’(帶下劃線的堿基為BamHI識別序列)引物兩端設計合成BamHI的酶切位點，以畢赤酵母表達載體pPIC9K-xynB(64)作為模板，通過PCR方法擴增出5’端帶有分泌信號肽序列-釀酒酵母α因子前導肽序列，3’端帶有畢赤酵母醇氧化酶(AOX)基因終止序列的耐高溫木聚糖酶(XynB)基因。擴增條件為預變性94℃5分鐘；再進行25個循環變性94℃30秒，退火55℃1分鐘，延伸72℃2分鐘；最后72℃，延伸10分鐘。擴增產物(1705bp)回收連接到載體pGEM-TEasy上，挑選出含有XynB基因的載體pGEM-T-xynB(64)的陽性轉化子進行序列測定分析，結果表明pGEM-T-xynB(64)中的XynB基因序列正確。pGEM-T-xynB(64)經BamHI酶切后，將XynB基因克隆至表達載pPIC3.5k-PMA1P-rDNA的兩個BamHI識別序列之間，得到含有PMA1啟動子序列，漢遜酵母rDNA序列，釀酒酵母α因子前導肽序列，畢赤酵母醇氧化酶(AOX)基因終止序列和耐高溫木聚糖酶(XynB)基因的漢遜酵母表達載體pPMA1-xynB(64)。實施例2、耐高溫木聚糖酶的表達(1)重組漢遜酵母表達載體pPMA1-xynB(64)的轉化及高拷貝數轉化子的篩選重組漢遜酵母表達載體pPMA1-xynB(64)經NotI完全酶切線性化后，電擊法轉化多形漢遜酵母ATCC34438，轉化后在含有0.1mg/mlG418的YPD(1％酵母抽提物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，pH5.8)平板上篩選陽性轉化子。把在含有0.1mg/mlG418的YPD平板上生長的菌落點接在含有0.8mg/ml的G418的YPD平板上，挑選轉化子共30個，進行培養，其中菌株HpA16-pPMA1-xynB(64)9#表達分泌量較高。(2)耐高溫木聚糖酶的表達與提取把菌株HpA16-pPMA1-xynB(64)9#接種于5mlYPD培養基中，37℃搖床培養至OD600為8.0左右，再以10％的接種量轉接到5mlBMGY培養基[1％酵母抽提物，2％蛋白胨，100mmol/l磷酸鉀緩沖液，1.34％YNB(YeastNitrogenBase，酵母氮源)，2％甘油，pH6.0]，連續培養2天，離心，收集上清液和菌體細胞。上清液中含有表達并分泌到胞外的耐高溫木聚糖酶，將上清液在70℃水浴中處理10分鐘，除去雜蛋白，得到胞外粗酶液。收集1ml菌液細胞，用500μl無菌水洗滌兩遍，用100μl50mM的MES緩沖液(pH6.14)懸浮細胞，加入20μl6mg/mLZymolyase溶液，混勻后置37℃反應50-60分鐘，置70℃水浴10分鐘，12,000rpm離心10分鐘，上清液為細胞內粗酶液。該胞外粗酶液和胞內粗酶液經SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達量，電泳結果表明胞外與胞內粗酶液經過處理后都能得到電泳純的耐高溫木聚糖酶XynB，其相對分子量為42kDa，與理論推算的分子量(42.067KDa)相吻合。耐高溫木聚糖酶XynB分泌量可達15mg/L培養液。(3)耐高溫木聚糖酶活性測定以0.25％(w/v)的燕麥木聚糖(oatspeltsxylan，SigmaChemicalSt.Louis，MO.USA)溶液為底物，采用對羥基苯甲酸酰肼法(p-hydroxybenzoicacidhydrazide，PHBAH法)測定耐高溫木聚糖酶活力。具體操作如下1).按順序分別取儲存液0.5mol/L檸檬酸鈉，1mol/L亞硫酸鈉，0.2mol/L氯化鈣，5mol/L氫氧化鈉各10ml，邊攪拌邊加入，用蒸餾水定容到100ml，再加入1.52克PHBAH，不停的攪拌，此溶液必須現用現配；2).稱量1克燕麥木聚糖溶于100ml50mmol/LMES緩沖液(pH6.2)中，經充分攪拌后，離心除去沉淀，上清液為0.25％的耐高溫木聚糖酶反應底物；3).取190μl0.25％的燕麥木聚糖底物步驟2)的上清液于70℃下保溫10min，加入10μl稀釋的步驟(2)耐高溫木聚糖酶溶液，于70℃下準確反應10min，再加入400μlPHBAH溶液，混勻后于沸水浴中保持6min；4).樣品冷卻后，用分光光度計測定吸光度值(OD405)。空白的操作與上述一樣，以10μl水代替合理稀釋的酶溶液。1個酶活力單位(unit)定義為在上述實驗條件下，每分鐘產生1μmol木糖所需的酶量為1個酶活力單位，而OD405＝1時相當于0.067μmol木糖。結果表明耐高溫木聚糖酶XynB酶活為800U/L胞外粗酶液。利用已知的蛋白質化學標準方法測定此耐高溫木聚糖酶的基本特性，測定結果表明該耐高溫木聚糖酶的最適作用溫度為90℃；分解木聚糖活性在90℃，pH值為6.2-8.0的范圍內穩定；在沸水浴中處理30分鐘后，仍能保持70％酶活力。序列表<160>3<210>1<211>1960<212>DNA<213>多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)<400>1caattgggtctggtttgccatggaattaggaagcaacggtgagttgtttgacaagatcga60gcctgatctgggagttgacgaggatgtcgctcaattttatttcaaacagctcataaatgc120agtttcttttattcattccaaaggtgttgcacaccgggatatcaagccagaaaacctagt180tatcgataagagcggaaacctgaagctgacggactttggccttgccagtgtgtttaaaaa240gaaaaacggttccaaaagaatgtgcaccacagcatgcggctctcctccttaccttgctcc300ggaggtggtctctcaaaaatatgatcccgagccctcggacgtgtggtcctgcggcatagt360tttgtttgtgctcctcacagggcagatagcgtgggagatgccacacgaggaagacacaga420cttccgctactacatggagaagaagggagaagtgctgatttccccatggaacaagatccc480tctaggtgcactttccctgctgcggaaggtgctagtcttggagccgtttcgtcgacgcat540cgaagagattaagcagcatccttgggtggccaagaaaaacaagtttgcggaccaaaatga600tatgtgcaaagacccaatgcgtctcaccacgagcctgctggtgaacctttacatcaacct660ttcggacgcagagttcaacaagatcagccagatgtccacccagatcagcaagccggcagc720aggaacgcaacccccaaaatacgtgatggacgatacgcagccggcagagatcctgtcgag780cgacagcacgaggagtggacggagtaaaccagcggcgagtttgggttataagttttcggt840tataggaggataaatggaactgtatgaatagtgaggatcgttatctgtaattaaaaatgc900agaattattagctggcctcggtgcagtgcagtcaggagtagtaatcaccaaatttaccta960attagtgctatgaaacaggaccaccctggatacacgcaaggcaagtctccgagagggtct1020atgtcacatggggcatcaaaaggtacagtactgagggccatgacaacaagactgtcgtga1080tccggggtatcttatttgggtaagcaagtttcccaatagggaacaatgcggtctaaaaac1140agaacacaggcatttttaggcggtggatgcggaatgaataaatggctggaaagatcggct1200cggttttggcaagttgagtgaaaaaaaacctggccgaaaaaacctcaaaagttatgattt1260cgcatataaccggtcttggtccgaaaccggtgcagaaaatatgctcttggccgtagttgt1320agaagctggggatgagttgcaaagaggccatttggcgttgacgggtgagggcggatctcc1380aggaacagtacatggacagaagccagttctagattcgcattttcccgagtttgagctgtc1440cctgtctgggtcctgcgacttttcccctggattgctaaaaaggtaaacaatagcgtacag1500aaagaaacgatagcgtagaaaaggcgggtaagatacacttaataaaacgtctccgcgaaa1560gcagcatccagataaccgggtcagatggaggagctcacggctagattgagtgcagcggtt1620tgctcggcacggtcgagccagtatcggcaatgtcccggtgtccaattttcacgcaaatta1680cgtcttcccggatattccgttgctggaaaacaatagaaatcggttttgttaacgatatcg1740accagtgaaaatacagctaaataactcgttggtcggaaacttaattgtggtttgtgtttc1800ttttttacccttttggtaccgattgttgtttactgaatttggacaaacaaagtcgctcgt1860tgcaaggtgcataatttgcatccacctcttaaaaatgcagtatctttccttcgtttttct1920ccatccaactttatattctttttttctttcagttcaattg1960<210>2<211>2962<212>DNA<213>多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)<400>2gcggccgcaagcttctttcaaaaattggctctgccttacaaactttaatcataaagtttg60acctcaaatcaggtaggattacccgctgaacttaagcatatcaataagcggaggaaaaga120aaccaacagggattgccttagtagcggcgagtgaagcggcaagagctcaaatttgaaatc180tggtaccttcggtgcccgagttgtaatttgaagaaagctatcttggaggtggcctttgtc240tatgttccttggaacaggacgtcatggagggtgagaatcccgtgtgatgaggtgtccatt300tccgtgtaagatgctttcgaagagtcgagttgtttgggaatgcagctcaaagtgggtggt360aaattccatctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtactgtgaagga420aagatgaaaagaactttgaaaagagagtgaaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagg480gtatttgatcagacttggtatttagctatcatcgctccttgtgggtggtgctctagcttt540ttactgggccagcatcagttttggtggcaagataatgacagttgaatgtggctcctcgga600gtgttatagcttctgttgatgttgcctaccgagactgaggtctgcggcttttgcctagga660tgctggcgtaatgatccaataccgcccgtcttgaaacatggaccaaggagtctaacgtct720atgcgagtgtttgggtgtaaaacccgtacgcgtaatgaaagtgaacgtaggtcagggccc780gcaagggtgcatgatcgaccgatcctgatgttctcggatggatttgagtaagagcatagc840tgttgggacccgaaagatggtgaactatgcctgaatagggtgaagccagaggaaactctg900gtggaggctcgtagcggttctgacgtgcaaatcgatcgtcgaatttgggtataggggcga960aagactaatcgaaccatctagtagctggttcctgccgaagtttccctcaggatagcagaa1020gctcgtatcagttttatgaggtaaagcgaatgattagaggtcttggggtcgaaatgacct1080tagcctattctcaaactttaaatatgtaagaagtccttgttgcttaattgaacgtggaca1140tttgaatgaagagcttttagtgggccatttttggtaagcagaactggcgatgcgggatga1200accgaacgtgaagttaaggtgccggaatgcacgctcatcagacaccacaaaaggtgttag1260ttcatctagacagccggacggtggccatggaagtcggaatccgctaaggagtgtgtaaca1320actcaccggccgaatgaactagccctgaaaatggatggcgctcaagcgtgttacctatac1380ttcaccgtcatggtttttatgatgccatgacgagtaggcaggcgtggaggtcagtgacga1440agcctttggtgtgaacctgggtagaacggcctctagtgcagatcttggtggtagtagcaa1500atattcaaatgagatctttgaagactgaagtggggaaaggttccacatcaacagcagttg1560gatgtgggttagtcgatcctaagagatggggaagctccgtttcaaagtgcttgatttttc1620aagccaccatcgaaagggaatccggttaatattccggaacttggatatggattcttcacg1680gtaacgtaactgaatgtggagacgtcggcatgagccctgggaggagttatcttttcttct1740taacagcttatcaccctggaattggtttatccggagatagggtcttatggctggaagagc1800gtaatatctttgttacgtccggtgcgctcatgacggcccttgaaaatccacaggaaggaa1860tagttttcatgccaagtcgtactcataaccgcagcaggtctccaaggttaacagcctcta1920gttgatagaataatgtagataagggaagtcggcaaaatagatccgtaacttcgggataag1980gattggctctaagggtcgggtgtcttgggcctttttcagacgccattccgcattgggatc2040tgctttcgggtggatctctttgtggtttggttgacgaatttggtaggtcttcatggccgt2100ccggggcacaattaacgaccaacttagaactggtacggacaaggggaatctgactgtcta2160attaaaacatagcattgcgatggtcataaaatgatgttgacgcaatgtgatttctgccca2220gtgctctgaatgtcaaagtgaagaaattcaaccaagcgcgggtaaacggcgggagtaact2280atgactctcttaaggtagccaaatgcctcgtcatctaattagtgacgcgcatgaatggat2340taacgagattcccactgtccctatctactatctagcgaaaccacagccaagggaacgggc2400ttggcagaatcagcggggaaagaagaccctgttgagcttgactctagtttgacattgtga2460aaagacatagagggtgtagaataagtgggagcttcggcgccagtgaaataccactacctt2520tatcgtttttttacttattcaattaagcggagctggacttcaccgtccacgttctagatt2580taaggtctcttgtaggctgatccgggttgaagacattgtcaggtggggagtttggctggg2640gcggcacatctgttaaacgataacgcaggtgtcctaagggggactcatggagaacagaaa2700tctccagtagaacaaaagggtaaaagtccccttgattttgattttcagtgtgaatacaaa2760ccatgaaagtgtggcctatcgatcctttagtccctcggaatttgaggctagaggtgccag2820aaaagttaccacagggataactggcttgtggcagtcaagcgttcatagcgacattgcttt2880ttgattcttcgatgtcggctcttcctatcataccgaagcagaattctagagtcgacctgc2940aggcatgcaagcttgcggccgc2962<210>3<211>293<212>DNA<213>釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)<400>3atgagatttccttcaatttttactgcagttttattcgcagcatcctccgcattagctgct60ccagtcaacactacaacagaagatgaaacggcacaaattccggctgaagctgtcatcggt120tactcagatttagaaggggatttcgatgttgctgttttgccattttccaacagcacaaat180aacgggttattgtttataaatactactattgccagcattgctgctaaagaagaaggggta240tctctcgagaaaagagaggctgaagcttacgtagaattccctagggcggccgc29權利要求1.一種組成型表達載體，是含有PMA1啟動子序列，多形漢遜酵母rDNA序列和分泌信號肽編碼基因序列的真核細胞表達載體。2.根據權利要求1所述的組成型表達載體，其特征在于所述PMA1啟動子具有序列表中序列1的核苷酸序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQID№1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；所述多形漢遜酵母rDNA序列具有序列表中序列2的核苷酸序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQID№2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；所述分泌信號肽編碼基因具有序列表中序列3的核苷酸序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQID№3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。3.根據權利要求1或2所述的組成型表達載體，其特征在于所述真核細胞表達載體為酵母表達載體。4.根據權利要求3所述的組成型表達載體，其特征在于所述組成型表達載體為pPMA1-xynB(64)。5.含有pPMA1-xynB(64)的酵母菌株。6.根據權利要求5所述的酵母菌株，其特征在于所述酵母菌株為多形漢遜酵母菌株。7.根據權利要求6所述的酵母菌株，其特征在于所述多形漢遜酵母菌株為多形漢遜酵母ATCC34438。8.根據權利要求5所述的酵母菌株，其特征在于所述含有pPMA1-xynB(64)的酵母菌株為HpA16-pPMA1-xynB(64)9#。9.一種表達耐高溫木聚糖酶的方法，包括以下步驟1)將耐高溫木聚糖酶編碼基因插入權利要求1、2或3所述的組成型表達載體中，得到耐高溫木聚糖酶組成型表達載體；2)將所述耐高溫木聚糖酶組成型表達載體導入多形漢遜酵母中，得到表達耐高溫木聚糖酶的工程菌；3)培養所述工程菌72-80小時，得到耐高溫木聚糖酶。10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于所述耐高溫木聚糖酶組成型表達載體為pPMA1-xynB(64)；所述工程菌為含有pPMA1-xynB(64)的多形漢遜酵母ATCC34438，優選為HpA16-pPMA1-xynB(64)9#；培養所述工程菌的碳源為甘油。全文摘要本發明公開了一種組成型表達載體及其應用。其目的是提供一種可在漢遜酵母中組成型表達外源基因的組成型表達載體及利用該組成型表達載體表達耐高溫木聚糖酶的方法。該組成型表達載體是含有PMA1啟動子序列，多形漢遜酵母rDNA序列和分泌信號肽編碼基因序列的真核細胞表達載體。表達耐高溫木聚糖酶的方法，包括以下步驟1)將耐高溫木聚糖酶編碼基因插入權利要求1、2或3所述的組成型表達載體中，得到耐高溫木聚糖酶組成型表達載體；2)將所述耐高溫木聚糖酶組成型表達載體導入多形漢遜酵母中，得到表達耐高溫木聚糖酶的工程菌；3)培養所述工程菌72－80小時，得到耐高溫木聚糖酶。文檔編號C12P21/02GK1724672SQ20051008299公開日2006年1月25日申請日期2005年7月8日優先權日2005年7月8日發明者李穎,楊夢華,關國華,江正強申請人:中國農業大學