專利名稱：一種同時檢測a、b、c三組人輪狀病毒的玻璃基因芯片及制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種基因微陣列的生物芯片及其制備方法與應用，尤其涉及一種同時檢測A、B、C三組人輪狀病毒的玻璃基因芯片及制備方法與應用，屬生物芯片和診斷試劑
背景技術：
基因芯片是指將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規律的排列固定于固相支持物上，然后與待測的標記的核酸樣品按堿基配對原理進行雜交，再經過一定的檢測系統對雜交信號進行檢測，并配以計算機系統對每一雜交信號進行數據分析和處理，從而迅速得出所要的信息。與傳統的雜交技術相比，該技術具有微型化，高靈敏性，高度平行性，和高速性的顯著特點。其發展速度和其中所運用的技術令人矚目。迄今為止，已在基因表達檢測，基因突變檢測，單核苷酸多態性和DNA序列測定等方面展開了廣泛的研究和應用。
輪狀病毒(Rotavirus，RV)是全世界人和動物急性腹瀉的最主要病原，危害巨大。按其結構蛋白VP6的抗原性差異，輪狀病毒被分成A～G共七個組，能感染人類的僅有A、B、C三組。在發展中國家，輪狀病毒每年引起87.3萬5歲以下兒童死亡，在兒童死因中居第二位；腹瀉在我國兒童死因中也居第二位，秋冬季兒童腹瀉50％是由輪狀病毒引起，直接威脅國家的公共安全、社會穩定、經濟發展以及人口素質。
目前對于輪狀病毒的檢測，主要是針對糞便中的病毒抗原或基因，已經建立的技術可歸納為以下3類1.病毒分離與形態觀察但是用于形態觀察的電子顯微鏡價格昂貴，且對于已降解病毒的檢測靈敏度下降，不適合大量的標本，也不適合基層使用。
2.免疫學技術目前最為多用，主要包括酶免疫技術[EIA，包括酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和膜免疫試驗(MEIA)]、乳膠凝集試驗(LA)和膠體金試紙等技術，國外均有商品化試劑盒提供，國內還未商品化。免疫學技術具有靈敏性較高，特異性較好和簡便快速的特點。但被檢樣品很受限制，固體待檢物幾乎不可能用這種方法檢測。
3.病毒核酸檢測主要包括聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)和RT-PCR等方法。前者可根據PAGE膠中的核酸帶型直接檢測輪狀病毒，但靈敏度不高。相比于免疫學技術和PAGE膠技術，PCR技術不僅有著更高的靈敏度，而且幾乎適用于所有的食物樣品。另外，此法為不能用血清學方法進行分型的標本提供了一種簡便可靠的替代方法。但是擴增的靈敏性高，同時帶來了假陽性問題，不通過雜交反應則無法對擴增產物的正確性進行驗證。
此外，上述檢測方法還存在一個共同的缺點通量低，即一次檢測反應僅能檢出一種組別或型別的輪狀病毒，而對于一次即能檢出所有能導致人感染的多組輪狀病毒卻無能為力。
經檢索，有關利用熒光標記的PCR產物和玻璃基因芯片雜交來同時檢測多組輪狀病毒的基因芯片，至今未見報道。
發明內容
針對現有技術的不足，本發明要解決的技術問題之一是提供一種同時檢測A、B、C三組人輪狀病毒的玻璃基因芯片，以克服現有技術存在的不能一次檢測導致人腹瀉的三組輪狀病毒和檢測靈敏度低的缺陷，滿足食品衛生監測，疾病預防控制和臨床醫療領域的需要；本發明要解決的技術問題之二是結合熒光標記技術，以玻璃片為基片，提供一種對所述同時檢測A、B、C三組人輪狀病毒的玻璃基因芯片的制備方法；本發明要解決的技術問題之三是公開所述同時檢測A、B、C三組人輪狀病毒的玻璃基因芯片在制備臨床診斷試劑中的應用。
本發明涉及的同時檢測A、B、C三組人輪狀病毒的玻璃基因芯片，包括玻璃基片和陣列式分布的寡核苷酸探針與對照及空白的點涂層，其特征在于，所述的玻璃基片是經醛基化處理的玻璃片；所述的寡核苷酸探針與對照及空白的點涂層分布于玻璃基片上，包括6條不同組別的人輪狀病毒組特異性檢測探針，1條陽性對照探針，4條陰性對照探針以及空白點樣液對照，其中，所述的6條人輪狀病毒組特異性檢測探針的基因序列是ProbeA15′-ATTTATTGAATGCTTCGATAT-3′ProbeA25′-ACTGGTGAGTGGATTGTTTGA-3′ProbeB15′-ATCCCATTTGAGTAAATTCAG-3′ProbeB25′-ATGATAATTCAGCCAAGCC-3′ProbeC15′-CTGTATTAGCTACATGACCGT-3′ProbeC25′-AGCTATTGGAGTTTGGTAGTT-3′所述1條陽性對照探針的基因序列是PbP5′-ATTTATTGAATGCTTCGATAT-3′所述4條陰性對照探針的基因序列分別是PbEC5′-GATGAGAATGTGCCTTCGGGAA-3′PbSA5′-GAACATATGTGTAAGTAACTGTGC-3′PbHBV5′-AGAAAGACCTTTAACCTA-3′PbPSE5′-TAGGTGGTTCAGCAAGTTGGAT-3′上述的人輪狀病毒組特異性檢測探針，陽性對照探針和陰性對照探針以poly(dT)15作為連接臂，并在探針5′端加入帶氨基的六碳基團，其中，所述陽性對照探針在其3′端帶熒光標記；上述每種探針與對照及空白的點涂層以2×2方式在玻璃基片表面點制4個平行點，各點的直徑為0.15mm，同種探針或對照或空白點間距為0.4mm；不同探針或對照點間距為0.5mm，點涂層微陣列的大小為3.5mm×3.5mm。
在上述的同時檢測A、B、C三組人輪狀病毒的玻璃基因芯片中，所述陽性對照探針在其3′端帶有的熒光標記是Tamra熒光，且所述陽性對照探針分布位于點涂層陣列的四角。
上述的同時檢測A、B、C三組人輪狀病毒的玻璃基因芯片中，所述經醛基化處理的玻璃片是指將未經任何化學修飾的玻璃片裸片以體積百分比濃度為5％-10％戊二醛水溶液浸泡處理制得的玻璃片。
本發明所述的同時檢測A、B、C三組人輪狀病毒的玻璃基因芯片的制備方法，其步驟如下(1)玻片處理取未經任何化學修飾的常規玻璃片裸片以體積百分比濃度為5％-10％戊二醛水溶液浸泡0.5～1.5hr，得到醛基化的玻璃片作為芯片的基片；(2)確定探針根據A、B、C三組人輪狀病毒基因序列，選擇確定了6條人輪狀病毒組特異性檢測探針，其基因序列是ProbeA15′-ATTTATTGAATGCTTCGATAT-3′ProbeA25′-ACTGGTGAGTGGATTGTTTGA-3′ProbeB15′-ATCCCATTTGAGTAAATTCAG-3′ProbeB25′-ATGATAATTCAGCCAAGCC-3′ProbeC15′-CTGTATTAGCTACATGACCGT-3′ProbeC25′-AGCTATTGGAGTTTGGTAGTT-3′1條陽性對照探針，其基因序列是PbP5′-ATTTATTGAATGCTTCGATAT-3′4條陰性對照探針，其基因序列分別是PbEC5′-GATGAGAATGTGCCTTCGGGAA-3′PbSA5′-GAACATATGTGTAAGTAACTGTGC-3′PbHBV5′-AGAAAGACCTTTAACCTA-3′PbPSE5′-TAGGTGGTTCAGCAAGTTGGAT-3′(3)芯片制備將上述選擇的人輪狀病毒組特異性檢測探針，陽性對照探針和陰性對照探針，以poly(dT)15作為連接臂，并在探針5′端加入帶氨基的六碳基團；以3×SSC作為稀釋液將上述探針分別稀釋為10μM，以點樣液為空白對照，以生物芯片點樣儀Pixsys5500配以SMP3點樣針接觸式點制在所述醛基化玻璃基片上，取樣板中液面高度是4-6mm，針在取樣孔中停留時間是20ms，點樣時，針在玻片上的停留時間是50ms，每種探針與對照及空白的點涂層以2×2方式在玻璃基片表面點制4個平行點，其中，陽性對照探針在其3′端帶上熒光標記，且所述陽性對照探針分布位于點涂層陣列的四角，各點的直徑為0.15mm，同種探針或對照或空白點間距為0.4mm；不同探針或對照點間距為0.5mm，點涂層微陣列的大小為3.5mm×3.5mm；將點制后的芯片平放于紫外交聯儀內，4500J/cm2下交聯3min，即得所述同時檢測A、B、C三組人輪狀病毒的玻璃基因芯片。
在上述的同時檢測A、B、C三組人輪狀病毒的玻璃基因芯片的制備方法中，所述人輪狀病毒組特異性檢測探針的選擇原則是根據A、B、C三組人輪狀病毒基因序列，設計針對每組人輪狀病毒的特異性寡核苷酸探針，使每條探針的解鏈溫度相近，且每條探針的解鏈溫度在±3℃以內，以避免發夾和二聚體結構的形成。
在上述的同時檢測A、B、C三組人輪狀病毒的玻璃基因芯片的制備方法中，所述的陽性對照探針在其3′端帶上的是以常規方法標記的Tamra熒光。
本發明所述的同時檢測A、B、C三組人輪狀病毒的玻璃基因芯片在制備臨床診斷試劑中的應用。利用本發明所述的芯片可對A組人輪狀病毒，B組人輪狀病毒，C組人輪狀病毒或同時對A、B、C三組人輪狀病毒進行檢測；例如臨床上應用本發明所述的同時檢測A、B、C三組人輪狀病毒的玻璃基因芯片可以對疑似A組RV感染的嬰幼兒腹瀉標本進行檢測并作出快速診斷。
在上述的同時檢測A、B、C三組人輪狀病毒的玻璃基因芯片在制備臨床診斷試劑中的應用中，樣品以如下方式制備以Trizol試劑(美國OMEGA公司)按使用說明提取輪狀病毒基因組RNA，并以應用量的高壓處理過的0.5‰DEPC(焦磷酸二乙酯)溶解RNA；針對A、B、C三組人輪狀病毒分別設計的各組特異性上下游引物的序列是A組人輪狀病毒上游引物5′-AACGAACAGTATGTTTCATCA-3′下游引物5′-TTGAAGGTCGTGATTGTGTTG-3′B組人輪狀病毒上游引物5′-TGGAACATACGAAGTTACAG-3′下游引物5′-TACATCATAGTCTCGATAAAATA-3′C組人輪狀病毒上游序列5′-GAAGAGTAGCATCAGGGAC-3′下游引物5′-TAAACGTAAATCATTGATTT-3′上述引物的特征在于解鏈溫度為53-55℃，GC％為40-60％，并避免了發夾結構和二聚體結構。
在上述的同時檢測A、B、C三組人輪狀病毒的玻璃基因芯片在制備臨床診斷試劑中的應用中，用于標記人輪狀病毒組特異性上游引物的熒光標記物是Tamra熒光。
以Tamra熒光標記上述上游引物，在同時含有上述A、B、C三組人輪狀病毒上下游引物的PCR擴增體系中，以多重RT-PCR擴增方式，實現對單組人輪狀病毒或多組人輪狀病毒的同時擴增。
對RNA進行逆轉錄反應按照Takara公司生產的RNA PCR(AMV)VER 2.1試劑盒說明書操作。然后建立PCR體系25μl反應體系中含1.5μl MgCl2，2.5μl 10×PCR緩沖液(不含Mg-2)，2.0μldNTP(2.5mmol/L)，16.4μl滅菌雙蒸水，0.125μlTaq酶(5U/μl)，1.0μl引物混合物(Tamra-PAu，PAd，Tamra-PBu，PBd，Tamra-PCu，PCd各10μmol/L)，0.5μl模板。
PCR程序為94℃預變性2min，然后按94℃45sec，52℃45sec，72℃1min為一個循環，30個循環后，再72℃延伸5min。
PCR擴增產物與多組人輪狀病毒檢測基因芯片的雜交取適量擴增產物與雜交液等體積混合，雜交液為10×Denhardt′s/0.1％Tween20/10×SSPE。將雜交混合液變性65℃30sec；98℃10min。然后迅速置于冰水浴中。剪下大小合適的HYBRI-Slips雜交蓋片(美國Sigma公司)，將雜交混合液吹打混勻并滴在蓋片上，反扣于玻片上點制的陣列上，在48-55℃的雜交溫度下雜交20-120min。雜交后洗片和信號的掃描以終濃度為2×SSC，0.2％SDS溶液洗片，120rpm，1.5min×2次。再換用2×SSC洗片1min。離心機內將玻片甩干，800rpm，離心5min。由ScanArray 4000基因芯片掃描儀掃片，參數選擇FluorophoreTAMRA；Laser Power 80；PFT 80，采集熒光信號后，以分析軟件進行熒光定量分析。
本發明所述的同時檢測A、B、C三組人輪狀病毒的玻璃基因芯片具有如下優點與效果(1)本發明所采用的Tamra熒光標記的上游引物對待檢病毒核酸實現擴增和標記，并結合玻璃載片，可以通過使用特定的儀器和軟件對雜交信號進行定量分析，提供精確而嚴謹的數據。
(2)本發明的多組人輪狀病毒檢測基因芯片使用多重PCR擴增，即在PCR擴增體系中同時加入三組人輪狀病毒的上下游引物，能夠實現對一組人輪狀病毒的檢測，也能夠實現對兩組和三組人輪狀病毒的同時擴增檢測。
(3)本發明所采用的人輪狀病毒組特異性檢測探針，能夠實現對人輪狀病毒的檢測和分組鑒定。
(4)本發明所采用的將所有能導致人類腹瀉的人輪狀病毒A、B、C三組的特異性探針點制在同一個檢測微陣列上，能夠實現對這三組人輪狀病毒的同時檢測。
總之，本發明涉及的芯片采用多重PCR擴增方式，可同時用于對多組人輪狀病毒的基因檢測和組別鑒定，具有廣闊的應用前景，有望滿足食品衛生監測，疾病預防控制和臨床醫療領域對人輪狀病毒檢測的需要。
圖1本發明所述同時檢測A、B、C三組人輪狀病毒的玻璃基因芯片的探針排布圖，其中所述探針排布為a1，a2，b1，b2N-PbP(10μmol/L)；a3，a4，b3，b43×SSC；a5，a6，b5，b6N-PbEC(10μmol/L)；a7，a8，b7，b8N-PbP(10μmol/L)；c1，c2，d1，d2N-PbA1(10μmol/L)；c3，c4，d3，d4N-PbA2(10μmol/L)；c5，c6，d5，d6N-PbB1(10μmol/L)；c7，c8，d7，d8N-PbB2(10μmol/L)；e1，e2，f1，f2N-PbC1(10μmol/L)；e3，e4，f3，f4N-PbC2(10μmol/L)；e5，e6，f5，f6N-PbSA(10μmol/L)；e7，e8，f7，f8N-PbHBV(10μmol/L)；g1，g2，h1，h2N-PbP(10μmol/L)；g3，g4，h3，h43×SSC；g5，g6，h5，h6N-PbPSE(10μmol/L)；g7，g8，h7，h8N-PbP(10μmol/L)。
圖2瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物其中所述各泳道是泳道M為核酸分子marker DL2000；泳道1為實施例2中所述對A組人輪狀病毒的PCR擴增；泳道2為實施例3中所述對B組人輪狀病毒的PCR擴增；泳道3為實施例4中所述對C組人輪狀病毒的PCR擴增；泳道4為實施例5中所述對A、B、C三組人輪狀病毒的PCR擴增。
圖3A組人輪狀病毒PCR擴增產物同基因芯片的雜交掃描結果結果顯示，A組人輪狀病毒PCR擴增產物同芯片上檢測A組人輪狀病毒的特異性探針雜交后出現陽性結果，同芯片上檢測B、C組人輪狀病毒的特異性探針雜交則出現陰性結果。陽性對照點的位置上也出現了陽性信號，陰性對照和空白對照點的位置上均出現陰性結果。
圖4B組人輪狀病毒PCR擴增產物同基因芯片的雜交掃描結果結果顯示，B組人輪狀病毒PCR擴增產物同芯片上檢測B組人輪狀病毒的特異性探針雜交后出現陽性結果，同芯片上檢測A、C組人輪狀病毒的特異性探針雜交則出現陰性結果。陽性對照點的位置上也出現了陽性信號，陰性對照和空白對照點的位置上均出現陰性結果。
圖5C組人輪狀病毒PCR擴增產物同基因芯片的雜交掃描結果結果顯示，C組人輪狀病毒PCR擴增產物同芯片上檢測C組人輪狀病毒的特異性探針雜交后出現陽性結果，同芯片上檢測A、B組人輪狀病毒的特異性探針雜交則出現陰性結果。陽性對照點的位置上也出現了陽性信號，陰性對照和空白對照點的位置上均出現陰性結果。
圖6A、B、C三組人輪狀病毒PCR擴增產物同基因芯片的雜交掃描結果結果顯示，A、B、C三組人輪狀病毒PCR擴增產物同芯片上檢測A、B、C三組人輪狀病毒的特異性探針雜交后均出現陽性結果。陽性對照點的位置上也出現了陽性信號，陰性對照和空白對照點的位置上均出現陰性結果。
具體實施例方式
下面結合實施例對發明的內容作進一步闡述實施例1本發明所述同時檢測A、B、C三組人輪狀病毒的玻璃基因芯片的制備(1)玻片處理取未經任何化學修飾的常規玻璃片裸片以體積百分比濃度為10％戊二醛水溶液浸泡1hr，得到醛基化的玻璃片作為芯片的基片；(2)確定探針根據A、B、C三組人輪狀病毒基因序列，選擇確定了6條人輪狀病毒組特異性檢測探針，其基因序列是ProbeA15′-ATTTATTGAATGCTTCGATAT-3′ProbeA25′-ACTGGTGAGTGGATTGTTTGA-3′ProbeB15′-ATCCCATTTGAGTAAATTCAG-3′ProbeB25′-ATGATAATTCAGCCAAGCC-3′ProbeC15′-CTGTATTAGCTACATGACCGT-3′ProbeC25′-AGCTATTGGAGTTTGGTAGTT-3′1條陽性對照探針，其基因序列是PbP5′-ATTTATTGAATGCTTCGATAT-3′4條陰性對照探針，其基因序列分別是PbEC5′-GATGAGAATGTGCCTTCGGGAA-3′PbSA5′-GAACATATGTGTAAGTAACTGTGC-3′
PbHBV5′-AGAAAGACCTTTAACCTA-3′PbPSE5′-TAGGTGGTTCAGCAAGTTGGAT-3′(3)芯片制備為了減少雜交時的空間位阻，將上述選擇的人輪狀病毒組特異性檢測探針，陽性對照探針和陰性對照探針，以poly(dT)15作為連接臂，并在探針5′端加入帶氨基的六碳基團；得人輪狀病毒組特異性檢測探針如下N-PbA15′-NH2-(CH2)6-(T)15-ATTTATTGAATGCTTCGATAT-3′N-PbA25′-NH2-(CH2)6-(T)15-ACTGGTGAGTGGATTGTTTGA-3′N-PbB15′-NH2-(CH2)6-(T)15-ATCCCATTTGAGTAAATTCAG-3′N-PbB25′-NH2-(CH2)6-(T)15-ATGATAATTCAGCCAAGCC-3′N-PbC15′-NH2-(CH2)6-(T)15-CTGTATTAGCTACATGACCGT-3′N-PbC25′-NH2-(CH2)6-(T)15-AGCTATTGGAGTTTGGTAGTT-3′以3×SSC作為稀釋液將上述探針分別稀釋為10μM，以3×SSC為空白對照，以5′-NH2-(CH2)6-(T)15-PbA1-Tamra-3′作為陽性對照(記為N-PbP)，以大腸桿菌特異性探針(記為N-PbEC)，金黃色葡萄球菌特異性探針(記為N-PbSA)，HBV乙肝病毒特異性探針(記為N-PbHBV)，銅綠假單胞菌特異性探針(記為N-PbPSE)作為陰性對照，以生物芯片點樣儀Pixsys5500配以SMP3點樣針接觸式點制在所述醛基化玻璃基片上，取樣板中液面高度是5mm，針在取樣孔中停留時間是20ms，點樣時，針在玻片上的停留時間是50ms，每種探針與對照及空白的點涂層以2×2方式在玻璃基片表面點制4個平行點，其中，陽性對照探針以常規方法在其3′端帶上熒光標記，且所述陽性對照探針分布位于點涂層陣列的四角，各點的直徑為0.15mm，同種探針或對照或空白點間距為0.4mm；不同探針或對照點間距為0.5mm，點涂層微陣列的大小為3.5mm×3.5mm(詳見圖1所示)；將點制后的芯片平放于紫外交聯儀內，4500J/cm2下交聯3min，即得所述同時檢測A、B、C三組人輪狀病毒的玻璃基因芯片。
實施例2利用本發明所述同時檢測A、B、C三組人輪狀病毒的玻璃基因芯片檢測A組人輪狀病毒(1)對人A組人輪狀病毒標準毒株RV5和Wa株進行細胞培養，提取培養液上清中的病毒RNA，用Takara公司RNA PCR(AMV)VER 2.1試劑盒說明書操作對RNA進行逆轉錄反應。然后建立PCR體系25μl反應體系中含1.5μl MgCl2，2.5μl 10×PCR緩沖液(不含Mg-2)，2.0μldNTP(2.5mmol/L)，16.4μl滅菌雙蒸水，0.125μlTaq酶(5U/μl)，1.0μl引物混合物(Tamra-PAu，PAd，Tamra-PBu，PBd，Tamra-PCu，PCd各10μmol/L)，0.5μl RT產物。
(2)PCR擴增產物的電泳檢測取PCR產物5μl，用含有溴乙錠的1％瓊脂糖凝膠進行電泳后觀察結果，見圖2。
(3)PCR擴增產物同檢測多組人輪狀病毒的玻璃基因芯片雜交取5μl PCR擴增產物與等體積的10×Denhardt’s/0.1％Tween20/10×SSPE雜交液混合后進行變性65℃30sec；98℃10min。然后迅速置于冰水浴中。剪HYBRI-Slips雜交蓋片，約7mm×7mm。將雜交混合液吹打混勻，取5μl于蓋片上，反扣于玻片上點制的陣列上。于雜交盒內50℃水浴雜交1hr。
(4)雜交后洗片和信號的掃描以2×SSC，0.2％SDS溶液洗片，120rpm，1.5min×2次。再換用2×SSC洗片1min。離心機內將玻片甩干，800rpm，離心5min。ScanArray 4000基因芯片掃描儀掃片，參數選擇FluorophoreTAMRA；Laser Power 80；PFT 80并存儲圖像(見圖3)。
結果顯示，A組人輪狀病毒PCR擴增產物同芯片上檢測A組人輪狀病毒的特異性探針雜交后出現陽性結果，同芯片上檢測B、C組人輪狀病毒的特異性探針雜交則出現陰性結果。陽性對照點的位置上也出現了陽性信號，陰性對照和空白對照點的位置上均出現陰性結果。
實施例3利用本發明所述同時檢測A、B、C三組人輪狀病毒的玻璃基因芯片檢測B組人輪狀病毒(1)對人B組人輪狀病毒靶核酸序列建立PCR擴增體系25μl反應體系中含1.5μl MgCl2，2.5μl 10×PCR緩沖液(不含Mg-2)，2.0μldNTP(2.5mmol/L)，16.4μl滅菌雙蒸水，0.125μlTaq酶(5U/μl)，1.0μl引物混合物(Tamra-PAu，PAd，Tamra-PBu，PBd，Tamra-PCu，PCd各10μmol/L)，0.5μl模板。
PCR程序為94。℃預變性2min，然后按94℃45sec，52℃45sec，72℃1min為一個循環，30個循環后，再72℃延伸5min。
(2)PCR擴增產物的電泳檢測取PCR產物5μl，用含有溴乙錠的1％瓊脂糖凝膠進行電泳后觀察結果，見圖2。
(3)PCR擴增產物同檢測多組人輪狀病毒的玻璃基因芯片雜交取5μlPCR擴增產物與等體積的10×Denhardt’s/0.1％Tween20/10×SSPE雜交液混合后進行變性65℃30sec；98℃10min。然后迅速置于冰水浴中。剪HYBRI-Slips雜交蓋片，約7mm×7mm。將雜交混合液吹打混勻，取5μl于蓋片上，反扣于玻片上點制的陣列上。于雜交盒內50℃水浴雜交1hr。
(4)雜交后洗片和信號的掃描以2×SSC，0.2％SDS溶液洗片，120rpm，1.5min×2次。再換用2×SSC洗片1min。離心機內將玻片甩干，800rpm，離心5min。ScanArray 4000基因芯片掃描儀掃片，參數選擇FluorophoreTAMRA；Laser Power 80；PFT 80并存儲圖像(見圖4)。
結果顯示，B組人輪狀病毒PCR擴增產物同芯片上檢測B組人輪狀病毒的特異性探針雜交后出現陽性結果，同芯片上檢測A、C組人輪狀病毒的特異性探針雜交則出現陰性結果。陽性對照點的位置上也出現了陽性信號，陰性對照和空白對照點的位置上均出現陰性結果。
實施例4利用本發明所述同時檢測A、B、C三組人輪狀病毒的玻璃基因芯片檢測C組人輪狀病毒(1)對人C組人輪狀病毒靶核酸序列建立PCR擴增體系25μl反應體系中含1.5μl MgCl2，2.5μl 10×PCR緩沖液(不含Mg-2)，2.0μldNTP(2.5mmol/L)，16.4μl滅菌雙蒸水，0.125μlTaq酶(5U/μl)，1.0μl引物混合物(Tamra-PAu，PAd，Tamra-PBu，PBd，Tamra-PCu，PCd各10μmol/L)，0.5μl模板。
PCR程序為94℃預變性2min，然后按94℃45sec，52℃45sec，72℃1min為一個循環，30個循環后，再72℃延伸5min。
(2)電泳檢測PCR擴增產物取PCR產物5μl，用含有溴乙錠的1％瓊脂糖凝膠進行電泳后觀察結果，見圖2。
(3)PCR擴增產物同檢測多組人輪狀病毒的玻璃基因芯片雜交取5μl PCR擴增產物與等體積的10×Denhardt’s/0.1％Tween20/10×SSPE雜交液混合后進行變性65℃30sec；98℃10min。然后迅速置于冰水浴中。剪HYBRI-Slips雜交蓋片，約7mm×7mm。將雜交混合液吹打混勻，取5μl于蓋片上，反扣于玻片上點制的陣列上。于雜交盒內50℃水浴雜交1hr。
(4)雜交后洗片和信號的掃描以2×SSC，0.2％SDS溶液洗片，120rpm，1.5min×2次。再換用2×SSC洗片1min。離心機內將玻片甩干，800rpm，離心5min。ScanArray 4000基因芯片掃描儀掃片，參數選擇FluorophoreTAMRA；Laser Power 80；PFT 80并存儲圖像(見圖5)。
結果顯示，C組人輪狀病毒PCR擴增產物同芯片上檢測C組人輪狀病毒的特異性探針雜交后出現陽性結果，同芯片上檢測A、B組人輪狀病毒的特異性探針雜交則出現陰性結果。陽性對照點的位置上也出現了陽性信號，陰性對照和空白對照點的位置上均出現陰性結果。
實施例5利用本發明所述同時檢測A、B、C三組人輪狀病毒的玻璃基因芯片檢測對A、B、C組人輪狀病毒(1)對A、B、C三組人輪狀病毒靶核酸序列建立多重PCR擴增體系25μl反應體系中含1.5μl MgCl2，2.μl 10×PCR緩沖液(不含Mg-2)，2.0μldNTP(2.5mmol/L)，15.4μl滅菌雙蒸水，0.125μlTaq酶(5U/μl)，1.0μl引物混合物(Tamra-PAu，PAd，Tamra-PBu，PBd，Tamra-PCu，PCd各10μmol/L)，三組模板各0.5μl。
PCR程序為94℃預變性2min，然后按94℃45sec，52℃45sec，72℃1min為一個循環，30個循環后，再72℃延伸5min。
(2)電泳檢測三組人輪狀病毒的多重PCR擴增產物取PCR產物5μl，用含有溴乙錠的1％瓊脂糖凝膠進行電泳后觀察結果，見圖2。
(3)PCR擴增產物同檢測多組人輪狀病毒的玻璃基因芯片雜交取5μl PCR擴增產物與等體積的10×Denhardt’s/0.1％Tween20/10×SSPE雜交液混合后進行變性65℃30sec；98℃10min。然后迅速置于冰水浴中。剪HYBRI-Slips雜交蓋片，約7mm×7mm。將雜交混合液吹打混勻，取5μl于蓋片上，反扣于玻片上點制的陣列上。于雜交盒內50℃水浴雜交1hr。
(4)雜交后洗片和信號的掃描以2×SSC，0.2％SDS溶液洗片，120rpm，1.5min×2次。再換用2×SSC洗片1min。離心機內將玻片甩干，800rpm，離心5min。ScanArray 4000基因芯片掃描儀掃片，參數選擇FluorophoreTAMRA；Laser Power 80；PFT 80并存儲圖像(見圖6)。
結果顯示，A、B、C三組人輪狀病毒PCR擴增產物同芯片上檢測A、B、C三組人輪狀病毒的特異性探針雜交后均出現陽性結果。陽性對照點的位置上也出現了陽性信號，陰性對照和空白對照點的位置上均出現陰性結果。
實施例6利用本發明所述同時檢測A、B、C三組人輪狀病毒的玻璃基因芯片檢測92例臨床疑似A組RV感染的嬰幼兒腹瀉標本(1)嬰幼兒腹瀉標本中RNA的提取以1×PBS將糞便樣本稀釋10倍，10000rpm離心2min；取300μl上清，加入30μl 10％SDS，56℃保溫30min；加入800μl Trizol試劑，室溫放置5min；加入200μl氯仿，渦旋震蕩15sec后，室溫靜置10min；4℃離心，12000rpm離心10min；小心吸取上層液至1.5ml離心管中，加500μl異丙醇，室溫下放置10min；4℃離心，12000rpm離心10min；小心吸棄上清，加1ml 75％乙醇(高壓滅菌后的0.5‰DEPC水配制)，4℃離心，7500rpm離心5min；棄乙醇，干燥后加20μl 0.5‰DEPC水(已高壓滅菌)溶解，-80℃貯存。
(2)PCR擴增用Takara公司RNA PCR(AMV)VER 2.1試劑盒說明書操作對RNA進行逆轉錄反應。然后建立PCR體系25μl反應體系中含1.5μl MgCl2，2.5μl 10×PCR緩沖液(不含Mg-2)，2.0μldNTP(2.5mmol/L)，15.4μl滅菌雙蒸水，0.125μlTaq酶(5U/μl)，1.0μl引物混合物(Tamra-PAu，PAd，Tamra-PBu，PBd，Tamra-PCu，PCd各10μmol/L)，0.5μl RT產物。
PCR程序為94℃預變性2min，然后按94℃45sec，52℃45sec，72℃1min為一個循環，30個循環后，再72℃延伸5min。
(3)PCR擴增產物的電泳檢測取PCR產物5μl，用含有溴乙錠的1％瓊脂糖凝膠進行電泳后觀察結果。
(4)PCR擴增產物同檢測多組人輪狀病毒的玻璃基因芯片雜交取5μl PCR擴增產物與等體積的10×Denhardt’s/0.1％Tween20/10×SSPE雜交液混合后進行變性65℃30sec；98℃10min。然后迅速置于冰水浴中。剪HYBRI-Slips雜交蓋片，約7mm×7mm。將雜交混合液吹打混勻，取5μl于蓋片上，反扣于玻片上點制的陣列上。于雜交盒內50℃水浴雜交1hr。
(5)雜交后洗片和信號的掃描以2×SSC，0.2％SDS溶液洗片，120rpm，1.5min×2次。再換用2×SSC洗片1min。離心機內將玻片甩干，800rpm，離心5min。ScanArray 4000基因芯片掃描儀掃片，參數選擇FluorophoreTAMRA；Laser Power 80；PFT 80并存儲圖像。
經上述本發明所建立的同時檢測A、B、C三組人輪狀病毒的玻璃基因芯片雜交后，檢測結果顯示A組人輪狀病毒檢測陽性的有88例，陰性的有4例。
(6)同時對相同的92例臨床疑似A組RV感染的嬰幼兒腹瀉標本進行ELISA試劑盒(深圳安群生物工程公司，生產批號20050115)抗原檢測。
檢測結果顯示78例為ELISA試劑盒抗原檢測陽性，14例為陰性。
證明我們所建立的檢測多組人輪狀病毒的玻璃基因芯片的檢測靈敏度高于現在臨床上普遍使用的輪狀病毒抗原檢測試劑盒。
權利要求
1.一種同時檢測A、B、C三組人輪狀病毒的玻璃基因芯片，包括玻璃基片和陣列式分布的寡核苷酸探針與對照及空白的點涂層，其特征在于，所述的玻璃基片是經醛基化處理的玻璃片；所述的寡核苷酸探針與對照及空白的點涂層分布于玻璃基片上，包括6條不同組別的人輪狀病毒組特異性檢測探針，1條陽性對照探針，4條陰性對照探針以及空白點樣液對照，其中，所述的6條人輪狀病毒組特異性檢測探針的基因序列是ProbeA15′-ATTTATTGAATGCTTCGATAT-3′ProbeA25′-ACTGGTGAGTGGATTGTTTGA-3′ProbeB15′-ATCCCATTTGAGTAAATTCAG-3′ProbeB25′-ATGATAATTCAGCCAAGCC-3′ProbeC15′-CTGTATTAGCTACATGACCGT-3′ProbeC25′-AGCTATTGGAGTTTGGTAGTT-3′所述1條陽性對照探針的基因序列是PbP5′-ATTTATTGAATGCTTCGATAT-3′所述4條陰性對照探針的基因序列分別是PbEC5′-GATGAGAATGTGCCTTCGGGAA-3′PbSA5′-GAACATATGTGTAAGTAACTGTGC-3′PbHBV5′-AGAAAGACCTTTAACCTA-3′PbPSE5′-TAGGTGGTTCAGCAAGTTGGAT-3′上述的人輪狀病毒組特異性檢測探針，陽性對照探針和陰性對照探針以poly(dT)15作為連接臂，并在探針5′端加入帶氨基的六碳基團，其中，所述陽性對照探針在其3′端帶熒光標記；上述每種探針與對照及空白的點涂層以2×2方式在玻璃基片表面點制4個平行點，各點的直徑為0.15mm，同種探針或對照或空白點間距為0.4mm；不同探針或對照點間距為0.5mm，點涂層微陣列的大小為3.5mm×3.5mm。
2.如權利要求1所述的同時檢測A、B、C三組人輪狀病毒的玻璃基因芯片，其特征在于，所述陽性對照探針在其3′端帶有的熒光標記是Tamra熒光，且所述陽性對照探針分布位于點涂層陣列的四角。
3.如權利要求1所述的同時檢測A、B、C三組人輪狀病毒的玻璃基因芯片，其特征在于，所述經醛基化處理的玻璃片是指將未經任何化學修飾的玻璃片裸片以體積百分比濃度為5％-10％戊二醛水溶液浸泡處理制得的玻璃片。
4.權利要求1所述的同時檢測A、B、C三組人輪狀病毒的玻璃基因芯片的制備方法，其步驟如下(1)玻片處理取未經任何化學修飾的常規玻璃片裸片以體積百分比濃度為5％-10％戊二醛水溶液浸泡0.5～1.5hr，得到醛基化的玻璃片作為芯片的基片；(2)確定探針根據A、B、C三組人輪狀病毒基因序列，選擇確定了6條人輪狀病毒組特異性檢測探針，其基因序列是ProbeA15′-ATTTATTGAATGCTTCGATAT-3′ProbeA25′-ACTGGTGAGTGGATTGTTTGA-3′ProbeB15′-ATCCCATTTGAGTAAATTCAG-3′ProbeB25′-ATGATAATTCAGCCAAGCC-3′ProbeC15′-CTGTATTAGCTACATGACCGT-3′ProbeC25′-AGCTATTGGAGTTTGGTAGTT-3′1條陽性對照探針，其基因序列是PbP5′-ATTTATTGAATGCTTCGATAT-3′4條陰性對照探針，其基因序列分別是PbEC5′-GATGAGAATGTGCCTTCGGGAA-3′PbSA5′-GAACATATGTGTAAGTAACTGTGC-3′PbHBV5′-AGAAAGACCTTTAACCTA-3′PbPSE5′-TAGGTGGTTCAGCAAGTTGGAT-3′(3)芯片制備將上述選擇的人輪狀病毒組特異性檢測探針，陽性對照探針和陰性對照探針，以poly(dT)15作為連接臂，并在探針5′端加入帶氨基的六碳基團；以3×SSC作為稀釋液將上述探針分別稀釋為10μM，以點樣液為空白對照，以生物芯片點樣儀Pixsys5500配以SMP3點樣針接觸式點制在所述醛基化玻璃基片上，取樣板中液面高度是4-6mm，針在取樣孔中停留時間是20ms，點樣時，針在玻片上的停留時間是50ms，每種探針與對照及空白的點涂層以2×2方式在玻璃基片表面點制4個平行點，其中，陽性對照探針在其3′端帶上熒光標記，且所述陽性對照探針分布位于點涂層陣列的四角，各點的直徑為0.15mm，同種探針或對照或空白點間距為0.4mm；不同探針或對照點間距為0.5mm，點涂層微陣列的大小為3.5mm×3.5mm；將點制后的芯片平放于紫外交聯儀內，4500J/cm2下交聯3min，即得所述同時檢測A、B、C三組人輪狀病毒的玻璃基因芯片。
5.如權利要求4所述的同時檢測A、B、C三組人輪狀病毒的玻璃基因芯片的制備方法，其特征在于，所述人輪狀病毒組特異性檢測探針的選擇原則是每條探針的解鏈溫度在±3℃以內，以避免發夾和二聚體結構的形成。
6.如權利要求4所述的同時檢測A、B、C三組人輪狀病毒的玻璃基因芯片的制備方法，其特征在于，所述陽性對照探針在其3′端帶上的是以常規方法標記的Tamra熒光。
7.權利要求1所述的同時檢測A、B、C三組人輪狀病毒的玻璃基因芯片在制備臨床診斷試劑中的應用。
8.如權利要求7所述的同時檢測A、B、C三組人輪狀病毒的玻璃基因芯片在制備臨床診斷試劑中的應用，其特征在于，針對A、B、C三組人輪狀病毒分別設計的各組特異性上下游引物的序列是A組人輪狀病毒上游引物5′-AACGAACAGTATGTTTCATCA-3′下游引物5′-TTGAAGGTCGTGATTGTGTTG-3′B組人輪狀病毒上游引物5′-TGGAACATACGAAGTTACAG-3′下游引物5′-TACATCATAGTCTCGATAAAATA-3′C組人輪狀病毒上游序列5′-GAAGAGTAGCATCAGGGAC-3′下游引物5′-TAAACGTAAATCATTGATTT-3′
9.如權利要求7或8所述的同時檢測A、B、C三組人輪狀病毒的玻璃基因芯片在制備臨床診斷試劑中的應用，其特征在于，PCR反應中用于標記人輪狀病毒組特異性上游引物的熒光標記物是Tamra熒光。
10.如權利要求7或8所述的同時檢測A、B、C三組人輪狀病毒的玻璃基因芯片在制備臨床診斷試劑中的應用，其特征在于，雜交中所使用的雜交液為10×Denhardt’s/0.1％Tween20/10×SSPE。
全文摘要
本發明公開了一種同時檢測A、B、C三組人輪狀病毒的玻璃基因芯片，包括經醛基化處理的玻璃片和陣列式分布于玻璃基片上的寡核苷酸探針、對照和空白的點涂層，所述點涂層是6條不同組別的人輪狀病毒組特異性檢測探針，1條陽性對照探針，4條陰性對照探針以及空白點樣液對照，并且所述檢測探針與對照探針以poly(dT)15作為連接臂，并在探針5′端加入帶氨基的六碳基團。本發明還公開了所述芯片的制備方法與該芯片在制備臨床診斷試劑中的應用。本發明的芯片采用多重PCR擴增方式，可同時用于對多組人輪狀病毒的基因檢測和組別鑒定，具有廣闊的應用前景，有望滿足食品衛生監測，疾病預防控制和臨床醫療領域對人輪狀病毒檢測的需要。
文檔編號C12Q1/68GK1772924SQ200510104339
公開日2006年5月17日 申請日期2005年10月26日 優先權日2005年10月26日
發明者黃海燕, 韓金祥, 王健偉 申請人:山東省醫藥生物技術研究中心