專利名稱：角毛藻的檢測探針及檢測方法
技術領域：
本發明屬于利用分子生物學方法檢測海洋環境中微型生物的技術領域。具體地說，涉及一種可用于檢測角毛藻的核苷酸序列和以此序列為基礎設計的核酸分子探針以及利用該分子探針檢測角毛藻的方法。
背景技術：
角毛藻屬(Chaetcoers)是最常見、最重要的一類浮游植物，也是我國近海很重要的一類硅藻；分布于熱帶、亞熱帶、溫帶甚至寒帶的廣大海域，在我國的各個海域均有分布。目前全世界記錄到的角毛藻大約有175種，我國近海已發現約50種。在這些角毛藻中，有的是重要的赤潮生物，在適宜的條件下可大量增殖形成赤潮，通過附著在魚類的鰓上，引起魚鰓發炎、分泌大量粘液使魚呼吸困難、窒息死亡，給養殖業帶來嚴重的經濟損失；有的卻是對養殖業非常有益的餌料生物，可作為多種海產養殖動物幼體的活體餌料。因此，及時、準確、快速地檢測角毛藻，了解其在養殖區的動態變化具有重要意義。
在分類學上，角毛藻屬隸屬于硅藻門(Bacillariophyta)，中心硅藻綱(Coscinodiscophyceae)，角毛藻科(Chaetocerotaceae)。區分角毛屬內各個種的依據包括角毛內有無色素體、色素體的形態和數目、細胞、角毛、細胞間隙以及休止孢子的形態等。雖然傳統的從形態學上區分角毛藻并不十分困難，但由于這種方法操作煩瑣，費時、費力，當樣品量多時工作量極大。因此，采用新方法新技術快速識別角毛藻極具現實意義。但是，國際國內目前并沒有針對該藻從這方面進行研究。
發明內容
本發明的目的是提供一種角毛藻分子生物學檢測的遺傳標記和方法，它可以從遺傳本質上客觀、準確地對該藻進行檢測。具體包括1.提供用于角毛藻檢測的基因片段；2.提供基于前述基因片段的角毛藻的專一性遺傳標記，即核酸分子探針；3.提供利用這些遺傳標記進行快速檢測角毛藻的方法；4.提供利用這些遺傳標記同時進行快速檢測和定量計數角毛藻的方法。
本發明的最主要理論基礎是核糖體基因及其轉錄間隔區的序列多態性以及5’核酸酶檢測法。本發明的發明人首先測定了一株分離自膠州灣的角毛藻的rDNA及ITS區總長約3000個堿基對的序列，通過與國際互聯網(Genbank)中所有已經公開的rDNA及ITS區序列比較發現，如序列表中SEQ ID NO.1所示的角毛藻rDNA和ITS序列與其它生物的相應區域的序列有很大差別。為此發明人以該序列為基礎設計出如序列表中SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的總共三個核酸分子探針。用這三個探針，發明人建立了快速、準確檢測和定量計數角毛藻的分子生物學方法。
本發明所提供的用于角毛藻檢測的核苷酸序列(C.sp Seq1.)涵蓋了如圖1所示的ITS區域和rDNA的部分區域。其序列及結構特征如序列表中SEQ ID NO.1所示。該序列(C.sp Seq1)可用如實施例1的方法得到；或者按該序列的核苷酸組成和順序，在商業化的DNA自動合成儀上按常規方法合成得到。
本發明所述的其中兩個角毛藻專一性核酸分子探針是以上述序列(C.sp Seq1)為基礎，通過Internet(因特網)與國際分子生物學數據庫中的其它所有藻類的相應序列比較后，用常規的引物設計軟件設計而成的。它們的序列組成及其結構特征分別如序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，它們在序列(C.sp Seq1)中的位置如圖2所示。SEQ ID NO.2所示的核酸探針(C.sp primer1)是序列(C.sp Seq1)的28S區域中的一段由22個核苷酸組成的寡核苷酸序列或其互補序列，或者是由其再經修飾、變化，且核苷酸變化量不超過總核苷酸數的20％的序列。SEQ ID NO.3所示的核酸探針(C.sp primer2)是序列(C.sp Seq1)的28S區域中的一段由22個核苷酸組成的寡核苷酸序列或其互補序列，或者是由其再經修飾、變化，且核苷酸變化量不超過總核苷酸數的20％的序列。
本發明所述的兩個角毛藻專一性核酸分子探針(C.sp primer1和C.sp primer2)可按照本發明已描述過的序列，通過常規的DNA合成方法合成而得(例如可以用商業化的DNA自動合成儀合成)。這兩個探針可以用放射性同位素、生物素、酶、熒光素或其他化學發光物質進行標記。
本發明所述的兩個角毛藻專一性核酸分子探針具有較好的種特異性。以它們為一對引物進行常規PCR反應，結果只能從含有角毛藻的材料的DNA提取物中擴增出大小為205bp的PCR產物。因此，以這兩個核酸分子探針為引物進行常規PCR反應，通過判斷相應大小PCR產物的有無可以準確、快速地檢測角毛藻，而且所需的樣品量很少。
以C.sp Seq1的序列為基礎，通過Internet(因特網)與國際分子生物學數據庫中的其它所有藻類的相應序列比較后，本發明的發明人還設計出了另一個角毛藻專一性核酸分子探針，其序列組成和結構特征如序列表中SEQ ID NO.4所示(名稱為C.sp TaqMan Probe)；其在序列(C.sp Seq1)中的位置如圖2所示。它是序列(C.spSeq1)的ITS1區域中的一段由26個核苷酸組成的寡核苷酸序列或其互補序列，或者是由其再經修飾、變化，且核苷酸變化量不超過總核苷酸數的20％的序列。該探針可以用放射性同位素、生物素、酶、熒光素或其他化學發光物質進行標記。將該序列的5’端用報告熒光基團如羧基熒光素(Carboxyfluorescein，FAM)等標記，3’端用淬滅熒光基團如TAMRA或Dabcyl等標記后即可用于對角毛藻進行定性和定量分析的實時熒光定量PCR(RQ-PCR)反應。
以C.sp primer1和C.sp primer2兩個角毛藻專一性核酸分子探針作為引物，以標記好的C.sp TaqMan Probe(5’端用報告熒光基團如FAM等標記，3’端用淬滅熒光基團如TAMRA或Dabcyl等標記)為TaqMan探針，本發明的發明人發明了一種可同時對角毛藻進行檢測和定量計數分析方法，即RQ-PCR反應。這種分析方法不僅克服了常規定量PCR方法中的誤差，而且分析所需的樣品量少，檢出極限低，靈敏度高。
圖1為角毛藻核糖體DNA(rDNA)及轉錄單元間隔區(ITS)在染色體上的排列順序。其中18s rDNA區域為本發明所涉及的核苷酸序列存在的區域。圖中，SSU為小亞基，LSU為大亞基，ITS為轉錄單元間隔區。
圖2為PCR結果。其中，所用引物為c.sp primer1和c.sp primer2。各電泳道所對應的藻種為Lane2.旋鏈角毛藻；Lane3.柔弱角毛藻；Lane4.纖細角毛藻；Lane5.微型角毛藻；Lane6.尖刺偽菱形藻；Lane7.米氏裸甲藻；Lane8.裸甲藻；Lane9.赤潮異灣藻；Lane10.塔瑪亞歷山大藻；Lane11.圓海鏈藻；Lane12.新月菱形藻；Lane13.中肋骨條藻；Lane14.膜質周形藻；Lane15.直鏈藻；Lane16.H2O；Lane1，17.DNA標記DL2,000(從上到下各條帶大小依次為2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)。
圖3為各稀釋度DNA溶液熒光信號曲線。圖中橫座標為Cycle Number，縱座標為Delta Rn，與橫座標平行的雙箭頭粗線為Threshold.從左至右各曲線對應的角毛藻細胞濃度(個細胞/μlDNA)依次為2.28×106、2.28×105、2.28×104、2.28×103、2.28×102。
圖4為定量計數角毛藻的標準曲線。
具體實施例方式
以下通過具體實施例進一步說明本發明。
實施例1.角毛藻的培養及其DNA樣品的制備本發明所用的角毛藻分離自膠州灣天然海水樣品。通過反復在顯微鏡下挑取單個藻細胞獲得純培養物。所用的培養基是常規的F/2培養基，培養條件為光照/黑暗周期為12h/12h，光照強度為4000Lx，培養溫度為22℃~25℃。
用0.45μm的微孔濾膜或10000r/min離心收集處于對數生長期的角毛藻藻細胞，用200μl TE buffer(10mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0)洗下約20mg藻體，加入2倍體積的預熱至55℃的抽提緩沖液(3％(w/v)CTAB，1％(w/v)sarkosyl，20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，0.1mol/L Tris-HCl pH8.0，1％(v/v)2-mercaptoethanol)，55℃處理1小時，其間每10分鐘顛倒混勻一次；取出于4℃冰箱靜置3分鐘，加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，顛倒混勻至呈乳濁狀，10000r/min，4℃離心10分鐘，取上相；向上相中加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，重復上步一次；之后的操作同常規的DNA提取。最后提取的DNA用50μl TE buffer溶解。
取提取的DNA溶液1μl加入49μl的PCR反應液中(在50μl的反應體系中包括50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH8.3)，1.5mM MgCl2，0.2mM dNTPs，0.5U polymerase，正反向引物各3μM)進行第一輪PCR。其中正向引物的序列是5’-GCTCGNMWYWARGRTTAAGCCATGC-3’，反向引物的序列為5’-CCTTGGTCCGTGTTTCAAGA-3’。混勻后，放入有熱蓋的PCR儀中。PCR程序為94℃3分鐘；94℃30秒，50℃30秒，72℃1分鐘，共30個循環；72℃5分鐘。將所得的PCR產物用Watson公司的PCR產物純化試劑盒純化后，取1μl加入如上所述的PCR反應體系中進行第二輪PCR。此輪PCR所用的引物分別是5’-CCTTTGTACACACCGCCC-3’(正向)，5’-CACGGTACTTGTWYRCTATCGGT-3’(反向)。PCR程序為94℃3分鐘；94℃30秒，55℃30秒，72℃1分鐘，共30個循環；72℃5分鐘。第二輪的PCR產物于1％的瓊脂糖凝膠上電泳后，割膠切下最亮的條帶克隆入pMD18-T載體，于XL1-Blue大腸桿菌中無性繁殖后，用M13/pUC(-20和M13/pUC(-48)引物對在商用的自動測序儀上測序，從測出的序列中即可獲得如SEQ ID NO.1所示的核苷酸組成和排列。
實施例2.C.sp primerl和C.sp primer2的設計和合成通過與Genbank中所有已知的其它真核生物、原核生物的相應區域的序列做比較，發現如SEQ ID NO.1所示的序列與其他生物的相應序列有很大差別，為此發明人以該序列為基礎設計出如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的兩個核酸分子探針。根據這兩個探針或其互補序列的核苷酸組成和排列，在商業化的DNA合成儀上即可獲得上述核苷酸序列。
實施例3.用常規PCR法檢測角毛藻本實施例選用了本實驗室藻種庫的幾株優勢浮游植物作為參照藻，它們是分離自膠州灣的旋鏈角毛藻(Chaetoceros curvisetus)、柔弱角毛藻(C.debilis)、纖細角毛藻(C.gracilis)、微型角毛藻(C.minimum)、中肋骨條藻(Skeletonema costatum)、裸甲藻(Gymnodinium sp.)、米氏裸甲藻(G.mikimotoi)、尖刺偽菱形藻(Pseudonitzschia pungens)、新月菱形藻(Nitzschia closterium)、諾氏海鏈藻(Thalassiosira nordenskioeldii)、膜質舟形藻(Navicula membranacea)、直鏈藻(Melosira sp.)，分離自大鵬灣的塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarens)、分離自大連灣的赤潮異灣藻(Heterosigma akashiwo)、它們均反復在顯微鏡下挑取單個藻細胞獲得純培養物。按實施例1所述的方法培養這些藻和提取這些藻及角毛藻的DNA。
取各種藻的DNA提取物1μl，按實施例1所述的PCR反應體系進行PCR，以序列表2(C.sp primer1)和序列表3(C.sp primer2)所述的核苷酸序列作為正反向引物。PCR程序為94℃3分鐘；94℃30秒，57℃30秒，72℃30秒，共35個循環；72℃10分鐘。PCR產物于1％的瓊脂糖凝膠上電泳后拍照，得到如圖3所示的結果。從圖3中可知，從角毛藻DNA模板中擴增出一條大小為205bp的PCR產物；從其它藻的DNA模板基本未見到特異性擴增。
因此，對于某待檢樣品，以其DNA提取物為模板，以C.sp primer1和C.spprimer2為引物，以本實施例所述的PCR程序進行PCR反應，如果PCR產物中有大小為205bp的條帶，即可判定該樣品中有角毛藻的存在；如果該樣品為純培養物，則可判定該純培養物為角毛藻。
本方法的優點由于本方法使用的是角毛藻的專一性引物并通過PCR反應對待測樣品進行了擴增，因此該方法能非常準確地檢測樣品中是否存在角毛藻，只要有相應大小的PCR產物出現，即可判定待檢樣品中有角毛藻存在，而且根據PCR產物量的多少，還可初步估計樣品中角毛藻的多少。同時本方法靈敏度很高，只要有很少的待檢材料即可進行準確檢測。
實施例4.RQ-PCR中所用的TaqMan探針的制備根據序列表中SEQ ID NO.4所示序列，用FAM熒光物質標記其5’端，用TAMRA標記其3’端。整個合成和標記過程可在商用的探針合成和標記儀上即可一次性完成。
實施例5.中肋骨條藻的RQ-PCR檢測和定量計數取處于對數生長期(培養了1周)的角毛藻培養物計數，其細胞濃度為5.7×105個/ml，收集200ml培養物，于4℃10000r/min離心10分鐘，小心吸棄上清，沉淀用TE buffer溶解，再加入400μl預熱至55℃的抽提緩沖液(配方見實施例1)，55℃處理1小時，其間每10分鐘顛倒混勻一次；取出于4℃冰箱靜置3分鐘，加入800μl氯仿∶異戊醇(24∶1)，顛倒混勻至呈乳濁狀，10000r/min，4℃離心10分鐘；取550μl上相，向其中加入550μl氯仿∶異戊醇(24∶1)，顛倒混勻至呈乳濁狀，10000r/min，4℃離心10分鐘；之后的操作完全按照Watson公司的植物葉DNA提取試劑盒的有關操作進行，只是最后一步用50μl T1液從吸附柱上洗下DNA(每1μlDNA溶液對應2.28×106個細胞)。
取上述提取的DNA，按1∶10倍比稀釋，共5個稀釋度(各稀釋度對應的細胞濃度依次為2.28×106個/μl、2.28×105個/μl、2.28×104個/μl、2.28×103個/μl、2.28×102個/μl)。然后分別取1μl DNA溶液加入49μlRQ-PCR反應體系(10×ExTaq Buffer5μl；25mmol/L MgCl23μl；dNTP mixture(各2.5mmol/L)4μl；20mmol/L C.sp primerl 1μl；20mmol/L C.sp primer2 1μl；20mmol/L C.sp Probe 0.4μl，0.5U/μl Ex Taq 0.5μl，)，于商用的ABI 7000型RQ-PCR儀中，按PCR程序(95℃2分鐘；95℃15秒60℃1分鐘45個循環)反應，并實時記錄熒光信號，得到如圖4所示結果。該圖顯示了各DNA溶液在PCR過程中的熒光信號隨著循環數增加的變化曲線。根據RQ-PCR的原理，臨界線(Threshold)與各DNA溶液熒光信號曲線的交點所對應的循環數即為該DNA溶液的CT值。從圖4可獲得各稀釋度DNA溶液的CT值。結合各DNA溶液的稀釋度、各向稀釋度對應的細胞濃度和CT值，得到如表1所示的數據。
表1.各DNA溶液的稀釋度及其對應的細胞濃度和CT值、實際用于RQ-PCR的細胞數
以用于RQ-PCR的實際細胞數的對數值為橫座標，以相應的CT值為縱座標，即可繪制出如圖5所示的標準曲線。該曲線的方程式為y＝-3.1423x+34.2109，其回歸系數為R2＝0.9954。
對于某一待測樣品，先按上述方法提取其DNA并做RQ-PCR，測出其CT值。以其CT值即可在圖5的標準曲線上算出該待測樣品的細胞數，進而推算出其中角毛藻的細胞濃度。
本方法最大的優點是能同時進行定量和定性檢測，通過該方法既可知道待檢樣品中是否有角毛藻存在，還可同時知道有多少該藻種存在。
本方法另一個明顯的優點是定量準確，這是由實時熒光定量PCR方法本身以及本方法擴增的針對的靶片段所決定的。對于某一物種來說，核糖體基因在染色體上的拷貝數是恒定的，不會隨著細胞的生理狀態、生活環境的不同而改變，也就是說樣品中細胞的數量與樣品中染色體DNA上核糖體基因的數量是呈線性相關的，由于本方法擴增的靶片段是染色體DNA上的核糖體基因，因此擴增信號的強弱直接反映了待檢樣品中細胞數量的多少。
另外本方法操作過程簡單、省時，整個過程4個小時內即可全部完成，可以實現海區中角毛藻動態的跟蹤監測。
序列表<110>中國海洋大學<120>角毛藻的檢測探針及檢測方法<160>4<210>1<211>1323<212>DNA<213>角毛藻(Chaetoceros.sp)<400>1cctttgtaca caccgcccgt cgcacctacc gattgagtgg tccggtgaag tctcgggatt 60gtggcaatct cctttactgg agtttgtctg cgagaacttg cctaaacctt atcacttaga 120ggaaggtgaa gtcgtaacaa ggtttccgta ggtgaacctg cggaaggatc attaacacac 180cgatctaaga tctcaactcc cgagaaggag cagtgcctgc agttgtgacc tcttggccag 240tccagtaggc acggcagcga gtcagacact gcgactatgt ttacataata accctggcaa 300cggagacaaa ctggtacttt ccagtgagtc tctcctgcca aaaacacaaa agcgaagagg 360atgaggcaca atgtgccacc gtccgcttcc ttccatacaa aactaacata cctataacct 420gaaatgaaag tggggcatga cacgatcgtg ccccatatca tactatcaac aatgtaaata 480caactttcag cgatggatgt ctaggctccc acaacgatga agaacgcagc gaaatgcgat 540acgtaatgcg aattgcagga cttcgtgaat catcaaaatt ttgaacgcac attgcgcttc 600cggggaatgc ccggtagcat gcctggttga gtgttcgtgg accccccttg gccgccatgc 660cacttacgag agtaagttag cagccggcga gccagagtat ggactggtat gcgatgtaga 720ttgcatgcct ggccaaagtg agcatttgcc gccagtcctc tggatggcat tttgcgagtg 780gatctgcaga atgtcttgtg cctgaggaga caatggtctg tgcatctggt aactctgcgc 840cgaatgcgtg cgtgtgttag tagaggtaga tgtctgtcgt ctctgagcag gatgctcgag 900cagtttgtcc aatcaccgtg aagaggaggg aggcgagtcc tctctcatct ttgtccattc 960caatttcgaa tctcagcttg gtagggatac ccgctgaatt taagcatata attaagcgga 1020ggaaaagaaa ataaccatga ttccctcagt aagggcgact gaagcgggaa gagctcattc 1080tgtgaatctg caccctgtgg tgccgagttg tggaatggag aagcacgtca gctgcagacc 1140ccggtccaag tcttctggaa aggagcgctt gaaagggtga cagccccgta tctggctggg 1200tgtctgtggc attagcatgt gccttcgacg agtcgagttg cttgggattg cagctctaag 1260tgggtggtaa attccatcta aagctaaata tcggtgggag accgatagta aacaagtacc 1320gtg 1323<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸
<400>2agcgggaaga gctcattctg tg 22<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>3ccacccactt agagctgcaa tc 22<210>4<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>4ttgtggaatg gagaagcacg tcagct 2權利要求
1.一種角毛藻的檢測探針，其特征是該探針來源于如SEQ ID NO.1所示的角毛藻rDNA核苷酸序列中的兩段寡核苷酸序列或其互補序列。
2.根據權利要求1所述的檢測探針，其特征是這兩個探針可以用放射性同位素、生物素、酶、熒光素或其他化學發光物質進行標記。
3.根據權利要求1所述的檢測探針，其特征是其核苷酸如SEQ ID NO.2所示，序列為5’agcgggaagagctcattctgtg，或其互補序列5’ccaactgcttcggcggacgggatg。
4.根據權利要求1所述的檢測探針，其特征是其核苷酸如SEQ ID NO.3所示，序列為5’ccacccacttagagctgcaatc，或其互補序列5’gattgcagctctaagtgggtgg。
5.一種角毛藻的分子檢測方法，其特征是采用PCR方法，以SEQ ID NO.2和3兩個核酸分子探針為一對PCR引物進行PCR反應，通過判斷相應大小PCR產物的有無來檢測赤潮異灣藻。
6.一種角毛藻的快速檢測和定量計數方法，其特征是采用熒光定量PCR方法，以SEQ IDNO.2和3兩個核酸分子探針為PCR引物，以一條用熒光標記的寡核苷酸序列為TaqMan探針進行實時熒光定量PCR。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征是所述的寡核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示5’-ttgtggaatggagaagcacgtcagct，或其互補序列5’-agctgacgtgcttctccattccacaa。
8.按照權利要求7所述的用熒光標記的寡核苷酸序列，其特征是其5’端用報告熒光基團標記，3’端用淬滅熒光基團標記。
全文摘要
本發明屬于利用分子生物學方法檢測環境微生物的技術領域。本發明公開了角毛藻核糖體DNA(rDNA)和轉錄單元間隔區(ITS)核苷酸序列，以及以該序列為基礎設計的寡核苷酸探針，以該核酸分子探針為一對引物進行PCR反應，通過判斷相應大小PCR產物的有無可以準確、快速地檢測角毛藻。本發明還公開了用這些探針采用熒光定量PCR技術來快速、準確地檢測和定量計數角毛藻的方法。
文檔編號C12N15/11GK1772923SQ200510104329
公開日2006年5月17日 申請日期2005年10月24日 優先權日2005年10月24日
發明者于志剛, 李榮秀, 何閃英, 米鐵柱, 蔡青松, 甄毓 申請人:中國海洋大學