專利名稱：一種特異靶向線粒體的真核表達載體，其構建方法及用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種真核表達載體，具體地說涉及一種特異靶向線粒體的真核表達載體，還涉及其構建方法及用途。
背景技術：
人線粒體DNA是哺乳動物核基因組外唯一有自主復制能力的細胞器，它通過氧化磷酸化過程產生機體所需的能量。1988年Wallace等第一次提出Leber遺傳性視神經眼病是由線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)突變引起。此后的研究發現約有上百種疾病與mtDNA突變有關，包括Leler遺傳性視神經眼病、線粒體腦肌病、乳酸中毒、糖尿病、神經退行性疾病、腫瘤以及人類老化等。到目前為止，對于mtDNA突變相關疾病的治療尚無有效的措施。由于線粒體疾病的根本原因為mtDNA的突變以及突變的mtDNA在細胞內的蓄積，因此一般的生化手段起不到相應的作用。治療線粒體疾病，只有通過基因治療的手段，輸入正確的線粒體的基因去置換或修正突變的線粒體基因，從而根本上糾正線粒體疾病。
線粒體疾病的基因治療，最關鍵是使其表達的基因或蛋白進入線粒體內部而發揮活性。De-Grey(Trends Biotechnol.2000，18394-9)認為，線粒體疾病治療途徑大致可以分為直接輸入核表達的蛋白或RNA到線粒體內、直接置換線粒體內的一個基因以及在一定范圍內限制突變的mtDNA的復制或轉錄等。然而目前仍沒有合適的載體能將DNA特別是mtDNA直接導入線粒體內部。
大多數線粒體多肽是在胞漿中合成，然后導入線粒體，在線粒體內正確的位置組裝成最后的蛋白。這是通過位于外膜、膜內腔、內膜以及基質上若干元件組成的線粒體導入機制完成的。典型的靶向線粒體基質的蛋白的N端有20個～30個氨基酸的靶向信號肽，此信號肽形成含有大量負電荷的α螺旋。當其在胞漿內翻譯后，此蛋白具有導入能力，并在胞漿分子“伴娘”的作用下維持非折疊狀態，其靶序列與線粒體外膜受體結合，然后此蛋白在線粒體外膜轉位酶機制的作用下穿過外膜上的親水孔道，此時被拉成線狀。在線粒體基質中，信號序列常被肽酶切掉，而多肽則被組裝到最后的蛋白質中。利用這一短的信號肽足以將附著其上的多肽導向線粒體。在進行線粒體基因缺失疾病的治療方法的體外細胞研究中，導入的正確編碼基因的表達產物的N端連以信號序列，可成功地將其靶向導入線粒體。
利用蛋白質導入機制，Partikian等(J Cell Biol.1998，140821-829)構建了含有COX8前導序列的真核表達的靶向載體，并將綠色熒光蛋白轉染到線粒體內部。Owen等(Hum Gene Ther.2000；112067-78)把前導序列插入到重組的腺相關病毒(rAAV)載體中，也成功將外源性綠色熒光蛋白導入到線粒體內部。Guy等(Annals of Neurology 2002；52535-542)結合異位表達技術，構建了線粒體靶向的病毒載體，將人的mtDNA的ND4基因定點突變為核編碼的基因，由信號肽引導成功進入線粒體內部，為糾正由ND4突變引起的疾病開辟了新的途徑。
但目前的靶向線粒體的真核表達載體同樣面臨著像普通的基因治療所用的真核表達載體的問題，那就是如何高效地將外源基因導入到細胞內部。病毒型載體盡管轉染效率高，但其制備復雜，有免疫原性，不能體內反復應用，存在安全性隱患，因此必須進一步改善。而非病毒載體最大的問題是轉染效率低，表達時間短暫，且插入的外源基因與選擇標記基因由于采用各自獨立的表達盒，選擇壓力施加在抗藥基因的表達上，篩選出克隆的目的基因的表達往往不高，甚至檢測不到。目前尚未見到將內部核糖體進入位點(IRES)的序列引入靶向載體中，建立允許插入基因與篩選基因同時表達的靶向線粒體的真核表達載體。
發明內容
本發明目的是構建特異靶向真核細胞線粒體的真核表達載體，為線粒體疾病的實驗研究提供一種有用的工具。本發明公開了一種線粒體靶向的真核表達載體，該載體含有COX8的前導信號肽作為引導線粒體特異的信號肽，并提供了CMV立早增強子和啟動子，多克隆位點和polyA信號，和RFP熒光指示信號。本發明的載體還包括內源性核糖進入位點IRES序列。
本發明的載體可以將一個外源性的蛋白、或線粒體蛋白通過異位表達，在胞漿轉錄后，與信號肽形成融合蛋白，在信號肽的引導下，進入線粒體內部而發揮效應。含有的IRES序列允許G418與目的蛋白共表達。利用本發明的載體，將外源性的紅色熒光蛋白pDsREDnl中熒光蛋白基因序列克隆至構建的載體的多克隆位點，導入到腫瘤細胞內的線粒體中獲得穩定表達。
本發明構建的pIRESmito和pmito-IRES-RFP載體質粒用于將外源性的由核表達的線粒體基因，或是由線粒體表達的線粒體基因通過異位表達輸送至線粒體內部；本發明構建的pIRESmito和pmito-IRES-RFP載體質粒，含有IRES序列，允許COX8與外源性插入基因構成融合的蛋白與neo基因共同表達，提高克隆篩選效率。
本發明還公開了上述靶向線粒體的真核表達載體的制備方法，該方法包括如下步驟1.pcDNAmito及pcDNAmito-RFP的構建首先選取COX8的前29個氨基酸作為前導序列，設計擴增其全長的PCR引物，通過RT-PCR方法，從人胚肺成纖維細胞中擴增全長靶向序列，插入到pcDNA3.1A中，構建pcDNAmito。然后將從pDsREDnl上切下來的RFP克隆至pcDNAmito，構建pcDNAmito-RFP。
2.pIRESmito及pIRESmito-RFP載體的構建從pcDNAmito及pcDNAmito-RFP中獲取COX8及COX8-RFP，分別插入pIRESneo載體，構建pIRESmito及pIRESmito-RFP。
3.pmito-IRES-RFP載體構建將COX8克隆至pDsREDnl中，構建pmito-RFP。從pIRESneo中獲取IRES片段，克隆至pmito-RFP中，構建pmito-IRES-RFP。
本發明還公開了上述靶向線粒體的真核表達載體在攜帶、表達外源基因，提高克隆篩選效率中的應用。
本發明利用蛋白質導入機制，構建了靶向線粒體的真核表達載體，它包含了來源于小RNA病毒科腦心肌炎病毒RNA 5’端的一段非翻譯區的IRES序列。IRES序列具有內部核糖體進入位點的功能，即能在內部起始位點獨立啟動不依賴帽子的翻譯，其優點在于將IRES與多個非相關基因連接在一起，可同時轉錄成一條單鏈RNA，但翻譯又是各自獨立的，這樣就可保證用IRES序列連接的非相關基因各自獨立的表達。利用這一特性，可以使前導信號與RFP形成的融合基因與篩選抗性基因共同表達，提高靶向載體轉染克隆效率。
圖1為本發明所用的基本質粒載體pcDNAmito的構建2為本發明構建pIRESmito的過程圖3為本發明構建pmito-IRES-RFP的過程圖4激光共聚焦顯微鏡鑒定結果。其中a為羅丹明123激發綠光熒光，b為RFP激發紅色熒光，c為重合圖。
具體實施例方式
實施例1 靶向線粒體載體的構建一、材料pDsREDl-nl、pIRESneo載體為CLONTECH公司產品。RT-PCR及連接試劑盒購于MBI公司。pcDNA3.1/myc-HisA購自Invitrogen公司。宿主菌DH5α、限制性內切酶、DNA聚合酶klenow片段購自Takara公司。pGEM-T-Easy載體為Promega公司產品。質粒DNA純化、凝膠回收試劑盒為上海申能博彩公司產品。
二、方法與結果1.pcDNAmito及pcDNAmito-RFP的構建(1)用PCR擴增COX8信號肽序列根據線粒體蛋白細胞色素C氧化亞單位VIII(COX8)的信號肽序列(Genebank GI1311703)，選取COX8的前29個氨基酸作為前導序列，其cDNA序列如序列表中序列1所示，設計擴增COX8前導序列全長的PCR引物，并在其5’端加上KpN I內切酶酶切位點，3’端加上EcoR I內切酶酶切位點，分別如序列表中序列2和序列3所示。
從人胚肺成纖維細胞中純化總RNA，反轉錄成cDNA，用特異引物進行PCR擴增。PCR擴增條件94℃變性5min，94℃40s，57℃40s，72℃40s，30循環，72℃5min。瓊脂糖凝膠電泳鑒定，出現100bp左右的擴增帶，符合設計長度。將PCR產物用無水乙醇沉淀后，溶于TE中。
(2)連接PCR產物到pGEM-T-Easy載體中將PCR產物在T4DNA連接酶的作用下，克隆至pGEM-T-Easy載體中，經X-gal/IPTG篩選，獲得陽性克隆，經酶切鑒定符合大小。
(3)構建重組的pcDNAmito及pcDNAmito-RFP從構建的含COX8的pGEM-T-Easy載體中用KpNI及EcoR工雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收COX8序列，插入到pcDNA3.1A中的KpN I，EcoR I位點，獲得重組質粒pcDNAmito，經內切酶、DNA序列分析證實插入片段正確(圖1)。然后將從pDsREDnl(Clontech公司)上用Not I及EcoR I雙酶切切下來的RFP克隆至pcDNAmito，構建pcDNAmito-RFP。
2.構建pIRES-mito及pIRESmito-RFP重組質粒首先，KpN I酶切pcDNAmito及pcDNAmito-RFP質粒，再用DNA聚合酶Klenow片段補平粘末端后，用Not I酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收COX8及COX8-RFP片段，分別插入到pIRESneo的EcoR V，Not I酶切位點，克隆篩選，獲得pIRESmito及pIRESmito-RFP質粒，經酶切、PCR鑒定符合(圖2)。
本發明所構建的載體的特征是，包含線粒體特異的靶向信號肽序列，可以將克隆于多克隆位點的目的基因形成融合蛋白而進入線粒體內部。含有IRES序列，可以使目的基因與G418基因實現共同表達，提高克隆篩選的效率。
3.pmito-IRES-RFP的構建及特征(1)構建pmito-RFP將pcDNAmito載體用HindIII及EcoR I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收含COX8片段，在T4連接酶作用下，克隆至pDsREDnl中，構建pmito-RFP。
(2)構建pmito-IRES-RFP用Sam I及EcoR I酶切pIRESneo，瓊脂糖凝膠電泳回收IRES片段，同時用Sam I及EcoR I酶切pmito-RFP，將IRES片段插入到pmito-RFP中的Sam I，EcoR I酶點，構建pmito-IRES-RFP(圖3)(3)特征本發明構建的線粒體特異的真核載體pmito-IRES-RFP，具有能特異導向真核細胞線粒體的靶向信號序列，并含有紅色熒光的指示信號。含有IRES序列，允許插入片段與紅色熒光蛋白同時穩定表達，且紅色熒光蛋白定位于胞漿中減少外源性蛋白進入線粒體的不利因素。
實施例2 pIRES-mito及pIRES-mito-RFP在腫瘤細胞系Hela中的表達一、材料lipofectamine2000脂質體購自Invitrgene公司，DMEM購自Gibco BRL公司，羅丹明123，G418為Sigma公司產品，Radiance2000型激光共聚焦顯微鏡(LSCM)系美國Bio-Rad公司產品。
二、方法1.采用SDS堿裂解-聚乙二醇沉淀法純化pIRESmito-RFP，pcDNAmito-RFP及pDsREDnl質粒DNA。
2.轉染Hela細胞按6×104個細胞/孔將Hela細胞接種24孔扳上，待細胞長至50％融合時用于轉染。pIRESmito-RFP及pDsREDnl分別按1∶3加lipofectamin2000脂質體，混勻并置室溫下孵育30min后，加于培養板中，置37℃，30％CO2孵箱培養5h，棄含質粒DNA/脂質體的培養基，加入10％小牛血清DMEM，繼續培養。
3.瞬時轉染在16、24、48、72h于熒光顯微鏡下觀察紅色熒光蛋白的表達；穩定表達在72h時按1∶8-1∶10傳代，加入200μg/ml的G418壓力篩選，至克隆出現，挑取克隆繼續用100μg/ml的G418維持。
4.激光共聚焦顯微鏡進一步鑒定將克隆細胞傳代至6孔板內，內含有小蓋玻片，至50％單層時，棄培養基并用PBS沖洗細胞，加1mg/ml羅丹明123，37℃避光溫育15min，吸去標記液，用PBS沖洗后封片，激光共聚焦顯微鏡觀測。羅丹明123在激發波長504nm激發綠光，作為線粒體的示蹤劑，RFP在激發波長558nm激發紅色熒光。
5.G418篩選陽性率轉染的Hela細胞經G418篩選，20天后培養板中清晰可見克隆形成。在倒置熒光顯微鏡下分別用普通光和熒光記數克隆數和產生熒光的克隆數，結果pIRES-mito-RFP轉染的Hela細胞中共獲得11個克隆，獲得8個紅色熒光克隆，而轉染pcDNAmito-RFP的Hela細胞孔中共有9個克隆，只有2個克隆中有紅色熒光。pIRES-mito-RFP的轉染的形成克隆的基因表達率明顯高于pcDNAmito-RFP。
三、結果1.表達蛋白的檢測在熒光顯微鏡下，pIRES-mito-RFP在16h觀察到散在的紅色熒光，熒光定位于胞漿呈散在顆粒，至72h時熒光最強，熒光信號彌散于整個胞漿，胞核沒有熒光出現；而對照質粒pDsREDnl產生的紅色熒光均勻充滿整個細胞。
2.激光共聚焦顯微鏡鑒定結果紅色熒光蛋白的散在顆粒的位置與羅丹明123激發的綠色熒光的位置相同，證明在信號肽的引導下，信號肽與RFP產生的融合蛋白特異進入線粒體內內部(圖4)。
3.G418篩選陽性率在倒置熒光顯微鏡下分別用普通光和熒光記數克隆數和產生熒光的克隆數，結果pIRES-mito-RFP轉染的Hela細胞中共獲得11個克隆，獲得8個紅色熒光克隆，而轉染pcDNAmito-RFP的Hela細胞孔中共有9個克隆，只有2個克隆中有紅色熒光。pIRES-mito-RFP的轉染的形成克隆的基因表達率明顯高于pcDNAmito-RFP。
實施例3 pmito-IRES-RFP在腫瘤細胞系Hela中的表達一、材料lipofectamine2000脂質體購自Invitrgene公司，DMEM購自Gibco BRL公司，羅丹明123、G418為Sigma公司產品，Radiance2000型激光共聚焦顯微鏡(LSCM)系美國Bio-Rad公司產品。
二、方法1.采用SDS堿裂解-聚乙二醇沉淀法純化pmito-IRES-RFP，pmito-RFP質粒DNA。
2.轉染Hela細胞按6×104個細胞/孔將Hela細胞接種24孔扳上，待細胞長至50％融合時用于轉染。Pmito-IRES-RFP及pmito-RFP分別按1∶3加lipofectamin2000脂質體，混勻并置室溫下孵育30min后，加于培養板中，置37℃，3％CO2孵箱培養5h，棄含質粒DNA/月旨質體的培養基，加入10％小牛血清DMEM，繼續培養。
3.瞬時轉染在16、24、48、72h于熒光顯微鏡下觀察紅色熒光蛋白的表達；穩定表達在72h時按1∶8-1∶10傳代，加入200μg/ml的G418壓力篩選，至克隆出現，挑取克隆繼續用100μg/ml的G418維持。
4.G418篩選陽性率轉染的Hela細胞經G418篩選，20天后培養板中清晰可見克隆形成。在倒置熒光顯微鏡下分別用普通光和熒光記數克隆數和產生熒光的克隆數。
三、結果1.表達蛋白的檢測在熒光顯微鏡下，24h觀察到散在的紅色熒光，pmito-RFP熒光定位于胞漿呈散在顆粒，至72h時熒光最強，熒光信號彌散于整個胞漿，胞核沒有熒光出現；而pmito-IRES-RFP在24h只有個別的熒光產生，至72h時熒光信號最強，紅色熒光均勻分布整個細胞。
3.G418篩選陽性率轉染的Hela細胞經G418篩選，20天后培養板中清晰可見克隆形成。在倒置熒光顯微鏡下分別用普通光和熒光記數克隆數和產生熒光的克隆數，結果pmito-IRES-RFP轉染的Hela細胞中共獲得8個克隆，獲得6個紅色熒光克隆，而轉染pmito-RFP的Hela細胞孔中共有15個克隆，只有4個克隆中有紅色熒光。Pmito-IRES-RFP的轉染的形成克隆的基因表達率明顯高于pmito-RFP。
序列表<110>中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所<120>一種特異靶向線粒體的真核表達載體，其構建方法及用途<130>
<160>3<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>87<212>DNA<213>
<400>1atgtccgtcc tgacgccgct gctgctgcgg ggcttgacag gctcggcccg gcggctccca60gtgccgcgcg ccaagatcca ttcgttg 87<210>2<211>27<212>DNA<213>
<400>2cggggtacca tgtccgtcct gacgccg 27<210>3<211>29<212>DNA<213>
<400>3ggccttaagc aacgaatgga tcttggcgc 29
權利要求
1.一種特異靶向線粒體的真核表達載體，其特征在于含有COX8的前導信號肽、HCMV增強子和啟動子、多克隆位點和polyA信號，以及RFP紅色熒光指示信號。
2.根據權利要求1所述真核表達載體，其特征在于含有內源性核糖進入位點IRES序列。
3.權利要求1或2所述真核表達載體的制備方法，包括如下步驟(1)將COX8的前導序列插入到pcDNA3.1A中，構建pcDNAmito載體；(2)從pDsREDn1中制備RFP，克隆至pcDNAmito，制備pcDNAmito-RFP；(3)從上述制備的兩載體中制備COX8及COX8-RFP，分別克隆至pIRESneo中，制備pIRESmito及pIRESmito-RFP載體；(4)將COX8克隆至pDsREDn1中制備pmito-RFP，從pIRESneo中制備IRES片段，將其克隆至pmito-RFP中，制備pmito-IRES-RFP。
4.權利要求1或2所述pIRESmito及pmito-IRES-RFP載體在攜帶、表達外源基因，提高克隆篩選效率中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種靶向線粒體表達載體，還公開了其制備方法及用途。本發明的載體，含有COX的前導信號肽序列、HCMV增強子和啟動子、多克隆位點和polyA信號、以及RFP紅色熒光指示信號。本發明載體的制備方法包括pcDNAmito的制備、pcDNAmito－RFP的制備、pIRESmito及pIRESmito－RFP制備，及pmito－IRES－RFP的制備等步驟。本發明的載體可以將外源基因插入到載體多克隆位點，用于將外源基因輸送至線粒體內部；還可用于將外源性插入基因與COX8、neo基因共表達，提高克隆篩選效率。
文檔編號C12N15/65GK1847401SQ20051012379
公開日2006年10月18日 申請日期2005年11月24日 優先權日2005年3月30日
發明者陸應麟, 郝好杰, 徐元基, 王妍, 杜芝燕 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所