專利名稱：酶活性測定方法及酶活性測定用柱的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種酶、特別是周期素依賴性激酶的活性測定方法及測定酶活性用柱。
背景技術：
酶活性的測定歷來是通過分析酶和基質反應引起基質減少的數量或生成物增加的數量來進行的。在如生物試樣那樣除待測定酶外還夾雜著各種抑制酶等雜物的試樣中，要想測定特定的酶的活性，就需要加一道提純待測酶的步驟，以排除抑制酶等雜物對目標酶反應的影響。這一步驟為，比如采用免疫沉降法使對待測酶有特異性的抗體固定于不溶于水的底物，然后將該底物同含待測酶的試樣混合，從而從試樣中分離出目標酶。
這種免疫沉降之后再進行酶反應的酶活性測定方法，已公開(專利文獻1)的方法有測定被稱為周期素依賴性激酶(CDK)的磷酸化酶群的活性的方法，這種周期素依賴性激酶是調節細胞增殖的細胞周期調節因子。
CDK通常作為非活性型單體存在于細胞內，CDK本身被磷酸化等激活移動到細胞核內。在核內，CDK與存在于核內的周期素分子結合，生成CDK/周期素復合體(以下稱為活性型CDK)，在細胞周期的各個階段調節細胞周期沿正確的軌道進行。如此，周期素和CDK有著密切的關系，但是，眾所周知，周期素基因的表達亢進與各種癌的進行度和惡性度相關(非專利文獻1)，因此，人們往往期待，一旦測定各種CDK的活性，其能夠成為診斷與細胞周期控制有關的疾患的種類和惡性度的優良指標。
專利文獻1中的CDK活性測定方法是將生物試樣、抗CDK抗體和朊A凝膠混合進行免疫沉降后，在CDK存在的情況下催化作為CDK基質的基質蛋白質和硫代三磷酸腺苷(ATP-γS)反應，向基質蛋白質加入一硫代磷酸基，使標記熒光物或標記酶與加入的一硫代磷酸基的硫磺原子結合，標記基質蛋白質，測定標記的基質蛋白質的數量，從而測定CDK活性。
其他測定酶活性的方法還有諸如向填有使煙酰胺腺嘌呤二核甘酸(NAD)固定于不溶于水的底物中的酶活性測定用填充劑的柱內加入NAD要求性酶及其酶的基質，定量所得生成物，從而測定酶的活性(專利文獻2)；向填充有固定基質的填充劑的柱內加入試樣，通過酶和基質的反應分解基質，定量柱內流出的液體中的基質分解生成物，從而達到測定酶的活性的目的(專利文獻3)；在裝有通過生物素—抗生朊的結合而固定基質的底物的酶活性測定用柱內加入待測定活性的酶，定量所得基質分解物，從而測定酶的活性(專利文獻4)。
專利文獻1美國專利申請公開第2002/0164673號說明書專利文獻2特開平5-328996號公報專利文獻3美國專利第5654152號說明書專利文獻4特許第2810138號公報非專利文獻1Wataru Yasui，2000，希森美康期刊國際版(Sysmex Journal International)，Vol.10，No.2；85-9
發明內容
發明要解決的課題過去的CDK活性測定方法測定費時，很難對大量檢體進行檢測，因此，人們希望有能夠在更短時間內簡便地測定CDK活性的酶活性測定方法。
解決課題的手段本發明是由以下幾個步驟組成的酶活性測定方法(1)在填充有由不溶于水的底物和固定于該底物中、能識別待測酶的抗體構成的填充劑的柱內，加入含待測酶的試樣，用上述抗體捕捉酶；(2)在上述柱內加入上述酶的基質，催化被上述抗體捕捉的酶與上述基質反應，以及(3)檢測上述反應所得生成物。
本發明還是由以下步驟構成的酶活性測定方法(1)在填充有不溶于水的底物的柱內加入識別待測酶的抗體，以此將上述抗體固定于上述底物中；(2)在上述柱內加入含有待測定酶的試樣，讓上述抗體捕捉該酶；(3)在上述柱內加入上述酶的基質，使其與上述抗體捕捉到的酶反應；以及(4)檢測上述反應的生成物。
本發明還涉及酶活性測定用柱，該柱內填充有由不溶于水的底物和固定在該底物、能識別磷酸化酶的抗體構成的填充劑。
發明效果本發明的酶活性測定方法是將由上述底物和抗體構成的填充劑填入柱內，讓該抗體捕捉待測定酶，因此，試樣中的目標酶即使很少，也能捕捉，而且在該柱內加入了基質，從而可以很簡便、有效地進行酶反應。
用本發明的酶活性測定方法測定CDK活性，比用過去的免疫沉降法大大縮短了反應時間，使檢測更加快捷。
圖1為可使用本發明的酶活性測定方法的柱的理想形態。
圖1-1為將圖1的柱分為蓄液器、柱體和底部的圖。
圖2為從實施例1和比較例1獲得的CDK2活性比較圖。
圖3為用柱測定酶活性方法所測定的試樣中CDK2對蛋白質量的比較圖。
圖4為使用過去的免疫沉降測定酶活性方法所測定的試樣中CDK2對蛋白質量的比較圖。
圖5為使用柱測定酶活性法測定含20μg蛋白質的試樣中CDK活性的結果。
符號說明1蓄液器2柱體3底部4連接部5連接部
具體實施例方式作為本發明酶活性測定方法可以測定的酶可以舉出諸如周期素依賴性激酶(CDK)、絲氨酸/蘇氨酸激酶(如PKB、PKC等)、酪氨酸激酶(如Src，Abl等)等磷酸化酶；諸如MMP(基質金屬蛋白酶)、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)那樣的蛋白酶等。本發明的酶活性測定方法特別是能夠快捷地測定磷酸化酶，而該磷酸化酶優選CDK。
所謂CDK包括CDK1、CDK2、CDK4、CDK5、CDK6及CDK7。
識別上述酶的抗體既可以是單克隆抗體或多克隆抗體，也可以是基因重組技術得到的物質。
本發明的酶活性測定方法使用層析柱進行測定。層析柱的形狀可以適當選擇，以便提高酶的反應效率。即，最好根據裝填在柱內的填充劑與加入柱內的試樣中分子的碰撞效率，再考慮柱的加工性和對使用本柱的系統的適用性等因素，決定柱的形狀(粗細、長短等)。根據以上幾點，柱徑可以是0.3～30mm，優選0.5～20mm，最好是0.5～15mm。柱長可以是5～100mm之間，優選10～80mm，最好為10～50mm。
柱的材質只要在待測定酶的活性測定條件下不易分解、沒有強度和蛋白質吸附問題、不會給酶反應造成不良影響即可，可以使用氯乙烯(PVC)、聚丙烯(PP)等。從柱的強度高、易加工、導熱性低能使柱內保持一定溫度這幾點看，優選PVC制柱。在低蛋白質吸附這一點上PP制的層析柱略勝一籌。
在本發明中可以使用的柱的優選形態如圖1和圖1-1所示。柱如圖1-1所示，最好是柱體2的上部有可以儲蓄試樣的蓄液器1，柱體2的下部有防止填充劑外漏的底部3。將這些部分組裝起來即可以作為圖1所示層析柱來使用。
蓄液器1和柱體2的連接部4、及柱體2和底部3的連接部5分別可以使用濾膜。濾膜的材質只要是蛋白質吸附率低、具有向柱內加入液體時不會破損的強度即可，可以使用聚偏氟乙烯(PVDF)、尼龍、玻璃纖維膜等。其中以PVDF為最好，PVDF膜可以用市場銷售品，比如微孔濾膜(Durapore)(密理博公司生產)。
根據本發明的酶活性測定方法，填充劑裝填到柱體2。在本說明書中，“填充劑”這一用語指固定于不溶于水的底物中能識別待測定酶的抗體。
本發明的酶活性測定方法所用底物一般只要不溶于水、在待測酶的活性測定條件下不易分解、且不對酶反應產生不良影響即可，比如可以使用纖維素、瓊脂糖、葡聚糖等多糖類和硅膠等。其中，以瓊脂糖為最好。
作為上述底物的形態，只要是可以填充到所用柱中即可，但如后所述，當讓固定在填充劑中的抗體捕捉試樣中的酶時，抗體與試樣的接觸面積會增大，因此，推薦使用粒子或多孔的底物。粒子的粒徑推薦0.01～0.5mm，優選0.05～0.4mm，最好為0.05～0.2mm。
作為多孔的底物，可根據柱體的形狀比如使用圓筒形的。其材質可以使用單體式硅等。
在本發明的酶活性測定方法中，也可將能與抗體結合的物質(以下稱抗體結合物)固定在底物中，在此讓其與抗體結合，作為填充劑使用。抗體結合物可舉出識別抗原結合片段(Fab段)、可結晶片段(Fc段)、K鏈等抗體的一部分并與之結合的物質，作為這種物質，有朊A、朊G、朊L和朊LA等，其中以朊A或朊G為優選。朊A和朊G可以使用天然材料、轉基因技術生產的東西或修飾它們所得的物質。作為該修飾，比如有除去白朊結合領域、除去細胞壁結合領域等提高對抗體識別的特異性的修飾。
作為將抗體結合物固定于底物的方法，可采用使用反應性化合物的方法。可用p-硝基苯氯甲酸酯、溴化氰、N-羥琥珀酰亞胺和環氧化物類等作為反應性化合物。此時，反應性化合物與底物結合，抗體結合物與該反應性化合物結合，從而使抗體結合物得以固定于底物。
與抗體結合物結合的底物也可以用市場出售產品，但當上述可與抗體結合的物質為朊A時，可以使用朊A瓊脂糖凝膠FF、朊A瓊脂糖凝膠HP(Amersham公司產品)等，當可與抗體結合的物質為朊G時，可使用朊G瓊脂糖凝膠HP(Amersham公司產品)等。
關于本發明的酶活性測定法的優選實施方式，首先向層析柱裝填填充劑，該填充劑由識別待測酶的抗體和底物構成。作為得到填充劑的方法，可以在由適當的緩沖劑中加入抗體構成的溶液中加入底物，進行培養。另外，也可預先將抗體結合物固定于底物中。培養的溫度可以是2～10℃，優選4～6℃。培養時間為20～90分鐘之間，最好在40～70分鐘之間。
還可以對如此得到的填充劑進行洗滌，以去除未固定的抗體。洗滌用的洗滌劑只要能去除未固定的抗體即可，也可含有少量白朊和表面活性劑。進行這種清洗后，即可將該填料懸浮于合適的緩沖劑中，裝入層析柱。
固定于底物的抗體的數量可根據底物的抗體結合容量、待測定酶的種類等因素適當選擇。一般為0.1～100μg，推薦0.5～50μg，最好是0.7～20μg。
作為向上述層析柱填料的方法，只要填充劑裝入后可以提高其與加入柱內的試樣中的分子的碰撞效率即可，比如可以采用將粒子狀填充劑懸浮于適當的緩沖液中、以一定的流速向柱內裝填的方法。裝填粒子狀填充劑時的流速可以根據填充劑的種類適當選擇，推薦10～1000μl/分，優選20～700μl/分，最好是50～500μl/分。
填充到柱內的填充劑的量優選10μl～15ml，最好是15μl～15ml。
本發明的酶活性測定方法的其他優選實施方式，是將底物填充到層析柱。以與上述向層析柱裝填填充劑同樣的流速向柱內裝填底物后，將識別待測定酶的抗體加入柱內。如此將識別待測定酶的抗體加入柱內，而作為使抗體固定于該底物的方法，可以將該抗體溶于合適的緩沖液中，以一定量的抗體可被固定于底物的流速向柱內灌注。抗體溶液的流速推薦5～500μl/分，優選10～350μl/分，最好是25～250μl/分。
裝入柱內的底物數量優選10μl～15ml，最好是15μl～15ml。
將抗體固定于底物后，也可以用上述洗滌劑洗滌，以去除殘留于柱內的未固定的抗體。洗滌劑的流速為5～500μl/分，優選10～200μl/分。
如此得到的酶活性測定用柱即是本發明之一，它裝填有填充劑，該填充劑由不溶于水的底物和固定于該底物、能識別磷酸化酶的抗體組成。此酶活性測定用柱可在2～10℃條件下保存，使用時通過以下步驟，即可用于測定酶活性。
向通過上述操作得到的柱內加入含待測定酶的試樣，讓上述抗體捕捉該酶。
含待測定酶的試樣可以是只含目標酶的提純的單一樣品或粗提純產品，也可以是生物試樣。如果使用生物試樣，也可以用色層分離法預先進行粗提純。當待測定酶為CDK時，可以對生物試樣中的生物細胞進行化學或物理處理，破碎其細胞膜和核膜來制備試樣。作為該處理方法，比如可以在含有表面活性劑、蛋白質水解酶抑制劑和脫磷酸化酶抑制劑的緩沖液中進行諸如韋林氏攪切器(Waring blender)那種電動均化器處理，或用注射器抽吸，或進行超聲波處理。
向柱內進樣時的流速可以在5～500μl/分之間，優選10～350μl/分之間，最好是25～250μl/分之間。
當向柱內進樣、捕捉到酶后，為了除去殘存在柱內的末捕捉的酶和試樣中所含其他雜物，最好進行清洗。如果測定對象是CDK，則洗滌劑可以是含氯化鎂的清洗劑，以提高與后述基質的反應性，還可以含二硫蘇糖醇(DTT)以作為酶的穩定劑。
洗滌劑的流速可以在5～500μl/分之間，優選10～200μl/分之間。
清洗時間可在3～30分鐘、最好在5～15分鐘之間，以免殘留在柱內的未被抗體捕捉到的游離的酶和雜物對后述酶反應造成不良影響。
向上述捕捉到酶的柱內加入該酶的基質進行酶反應。所謂基質只要與待測定酶接觸可產生反應生成物即可。該基質可以是一種，也可以是二種以上，如果是二種以上，則可以將其同時加入層析柱，也可以分別加入。
上述酶反應可通過將由基質溶于適量緩沖液配制的基質溶液加入層析柱進行。基質溶液的流速可根據測定的酶、使用的基質和柱的尺寸等因素適當選擇，但一般為0.1～200μl/分，優選0.5～150μl/分，最好是1～100μl/分。
基質溶液的pH值和進行酶反應的溫度可根據待測定酶和所用基質選擇最適宜待測定酶的反應條件的。比如以CDK作為該測定酶時的pH值為6.5～8.5，最好為7.0～7.4。反應溫度可在25～40℃之間，最好為37℃。
在以CDK為測定酶的情況下，基質推薦使用基質蛋白質和硫代三磷酸腺苷(ATP-γS)。
如上所述，CDK與周期素結合而成的活性型CDK，通常會向基質蛋白質的絲氨酸或蘇氨酸殘基中導入來源于ATP的單磷酸基，如果用ATP-γS取代ATP，則一硫代磷酸基取代單磷酸基導入到基質蛋白質的絲氨酸或蘇氨酸殘基中。然后，可通過用標記熒光物或標記酶做標記，檢測導入到基質蛋白質的一硫代磷酸基的硫原子，從而測定CDK活性。
因此，基質蛋白質只要含有絲氨酸或蘇氨酸殘基即可。測定CDK1和CDK2時，推薦使用組朊H1，測定CDK4和CDK6時推薦使用Rb(成視網膜細胞瘤蛋白、Retinoblastoma protein)等。
關于本來分子內含有半胱氨酸殘基的基質蛋白質、如Rb，一般使用將其殘基置換為不含丙氨酸等硫醇基的氨基酸殘基的基質蛋白質。這是為了防止當用標記熒光物或標記酶對在活性型CDK的作用下引入了來源于ATP-γS的硫代磷酸基的基質蛋白質中的硫代磷酸的硫原子做標記時，本來存在于基質蛋白質內的半胱氨酸殘基的硫醇基同時被標記，產生測定誤差。作為獲得置換了氨基酸殘基的基質蛋白質的方法，使用普通的基因工程的手法即可，美國專利申請公報第2002/0164673號說明書上記載的方法特別適用。
回收從如上注入柱內的基質溶液中析出的流出液，檢測流出液中的反應生成物。
反應生成物可以使用以往酶反應測定法中通用的方法進行檢測。比如，反應生成物如果為過氧化氫等，可以通過測定電化學的變化檢測，如果為對硝基苯酚、核甙酸、低聚肽(Oligopeptide)等，可通過測定紫外線吸收、熒光、折射率的變化來檢測。
如果所測定的酶是CDK，則反應生成物的檢測可以用美國專利申請公報第2002/0164673號說明書上記載的方法。
在上述各步驟中，向層析柱添加各種溶液和懸浮液的工作可以用注射器手動操作，最好用泵按一定流速操作。
根據本發明的酶活性測定方法，只要是可以得到其抗體的酶，都可測定，即使試樣中的酶濃度很低，抗體也可以捕捉酶，并在微小的空間內進行酶反應，因此反應效率高。而且，通過使用向層析柱加入液體的手法，簡化了過去多道工序的酶反應步驟。又因為可以使用容量很小的層析柱，從而實現了在柱內溫度分布小而均勻的條件下進行酶反應。
具體實施例下面通過實例，對本發明進行更詳細的闡述。但是這些實施例并不限定本發明。
實施例1使用層析柱測定CDK1和2的活性(1)試樣的制備在1×107細胞/5ml的條件下，在增溶劑(0.1w/v％NP-40(表面活性劑乙基苯基聚乙二醇)、50mM Tris-HCl、pH7.4、5mM EDTA、50mM氟化鈉、1mM正釩酸鈉、100μg/ml蛋白酶抑制劑混合物(SIGMA公司產品))中，用帶有23G針的5ml注射器在冰浴中吸排來源于慢性骨髓性白血病的細胞株K-562，反復吸排10次，增溶溶解細胞。再以15000rpm轉速4℃離心5分鐘，除去不溶物質，即制備出試樣。使用DC蛋白質盒(BIO-RAD公司產品)以牛IgG為標準測定上清中所含全蛋白質的量。
(2)層析柱的制備在500μl緩沖液1(0.1％NP-40、50mM Tris-HCl、pH7.4)中加入20μl朊A瓊脂糖凝膠FF(Amersham公司產品；瓊脂糖凝膠作為抗體結合物與朊A結合的產物)作為底物，用泵以100μl/分的流速向內徑1.13mm、長度20mm的柱內(容積20.05mm3)裝填底物。此時，層析柱僅在圖1顯示的底部3的連接部5裝有濾膜(微孔濾膜(密理博公司生產))，填充完成后在畜液器1的連接部4安裝同樣的濾膜。將畜液器1和底部3裝到柱體2后柱全長為31.5mm。
(3)酶反應以50μl/分的流速向層析柱加入用緩沖液1稀釋為含2μg蛋白質的多克隆抗CDK1或2抗體(Santa Cruz Biotechnology公司產品)溶液100μl，使抗體分別固定于底物。固定所需時間約6分鐘。
將(1)中制備的含50μg蛋白質的試樣100μl以50μl/分的流速注入層析柱，讓抗體捕捉試樣中的CDK。這一階段所需時間約6分鐘。
接著，以50μl/分的流速添加400μl清洗劑(100mM Tris-HCl、100mMNaCl、pH7.4)，清洗層析柱。清洗所需時間約13分鐘。
以10μl/分的流速向此柱注入100μl基質混合液(10μg組朊H1、5mMATP-γS、20mM MgCl、0.1％TritonX-100、50mM Tris-HCl、pH7.4)，回收流出液。此階段所需時間約8分鐘。
(4)反應生成物的檢測在36μl流出液中加入含150mM三羥甲基氨基甲烷-HCl、pH9.2、5mMEDTA的結合緩沖液30μl，再添加50mM PEO-碘乙酰生物素(Pierce公司)、20μl溶液(50mM磷酸緩沖液pH6.0)后，在暗處室溫下培養90分鐘。然后，加入等量(86μl)的SDS-上樣緩沖液(0.125mM三羥甲基氨基甲烷-HCl、pH6.8、4％SDS、10％β-巰基乙醇、25％丙三醇、溴酚藍)，100℃處理5分鐘。
用所得樣品在20μl/rain的條件下進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(第一化學藥品、預制凝膠、4～20％梯度、10mm×10mm)。SDS-PAGE的條件按照第一化學藥品的指示(60mA、40分)。SDS-PAGE后，將在凝膠內展開的蛋白質電轉印到PVDF膜(10V、30分、免疫印跡法)。將所得薄膜用4w/v％的BSA封閉30分鐘，再用TBS-T洗滌5分鐘。然后在抗生朊FITC(Pierce公司)(用TBS-T稀釋1000倍)溶液中37℃反應30分鐘。反應后，將薄膜用TBS-T洗滌2次、水洗滌1次，干燥。用MolecularImager(伯樂生命醫學產品有限公司(Bio-Rad公司)產品)使熒光帶顯像，以條帶的強度為RFU(相對熒光單位)進行測定。
比較例1使用免疫沉降法測定CDK1和2的活性(1)試樣的制備與實施例1的(1)同樣制備試樣。
(2)免疫沉降反應在(1)中制備的含50μg蛋白質的試樣100μl中加入2μg多克隆抗CDK1或2抗體(Santa Cruz Biotechnology公司產品)和20μl朊A瓊脂糖凝膠FF(Amersham公司產品)，在4℃下免疫沉降60分鐘。
然后，將瓊脂糖凝膠用緩沖液1洗滌2次、洗滌劑1次、緩沖液2(100mM Tris-HCl、pH7.4)1次，共洗滌4次。洗滌所要時間為10分鐘。
(3)酶反應添加基質混合液50μl，在37℃下振蕩10分鐘進行酶反應。
(4)反應生成物的檢測與實施例1(4)同樣測定酶活性。
圖2顯示了用實施例1和比較例1的方法測定所得CDK2活性值的比較圖。從圖2中可以看出，使用層析柱的本發明酶活性測定法檢測出的CDK2酶活性與使用免疫沉降法的酶活性測定法檢測出的CDK2活性大致相同。如以下表1所示，使用層析柱的酶活性測定法比使用免疫沉降法的酶活性測定法所花時間縮短了一半以上。
實施例2和比較例2將實施例1的(1)制備的試樣分別稀釋為蛋白質含量為10μg、20μg和50μg，然后，用與實施例1同樣的方法測定CDK1和2的活性(實施例2)。將該試樣稀釋為蛋白質含量為10μg、20μg、50μg和100μg，用與比較例1同樣的方法測定CDK1和2的活性(比較例2)。
從實施例2和比較例2獲得的相對于各蛋白質含量的CDK2活性如圖3和圖4所示。
從圖3和圖4可以看出，使用層析柱的酶活性測定法與過去使用免疫沉降法的酶活性測定法同樣具有定量性。
另外，關于蛋白質含量為20μg的試樣，用與實施例1同樣的方法測定的CDK1和2的活性如圖5所示。
因蛋白質含量為20μg的試樣其CDK1活性低于檢測界限，用與比較例1同樣的方法無法測定，而如圖5所示，使用層析柱的酶活性測定法則可以檢測，從而測定CDK1活性的檢測下限得以提高。
實施例3使用層析柱測定CDK1和2的活性在實施例1(2)的柱制備階段，預先在軟管內將底物朊A瓊脂糖凝膠FF(Amersham公司產品)和多克隆抗CDK1或2抗體(Santa CruzBiotechnology公司產品)溶液混合培養，制成填充劑后，填充到層析柱，其他操作與實施例1相同，測定CDK1和2的活性。
本實施例也與實施例1一樣，可以縮短酶活性測定所需時間。測定本實施例所得CDK2活性的值，可以得出與在圖2所得的值基本相同的結果。
本申請是根據日本國專利申請第2004-163367號(2004年6月1日申請)申請要求優先權，本專利權利要求的范圍、說明書、附圖和摘要的全部內容均作為參考，列入本說明書中。
產業上的實用性本發明的酶活性測定法是能夠快速有效地測定酶活性的方法。以此方法測定CDK活性，可以診斷胃癌、腸癌、乳癌、肺癌、食道癌、前列腺癌、肝癌、腎癌、膀胱癌、皮膚癌、子宮癌、腦瘤、骨肉瘤和骨髓瘤等癌癥。
權利要求
1.一種酶活性測定方法，包括以下步驟(1)在填充有由不溶于水的底物和固定于該底物中、能識別待測酶的抗體構成的填充劑的柱內，加入含待測酶的試樣，用上述抗體捕捉酶；(2)在上述柱內加入上述酶的基質，使被上述抗體捕捉的酶與上述基質反應，以及(3)檢測上述反應所得生成物。
2.一種酶活性測定方法，包括以下步驟(1)在填充有不溶于水的底物的柱內加入識別待測酶的抗體，將上述抗體固定于上述底物中；(2)在上述柱內加入含有待測酶的試樣，以上述抗體捕捉該酶；(3)在上述柱內加入上述酶的基質，使其與上述抗體捕捉的酶發生反應；以及(4)檢測上述反應的生成物。
3.如權利要求1或2所述的酶活性測定方法，其特征在于底物是粒子。
4.如權利要求1～3的其中1項所述的酶活性測定方法，其特征在于待測酶為磷酸化酶。
5.如權利要求4所述酶活性測定方法，其特征在于磷酸化酶為周期素依賴性激酶。
6.一種填充了填充劑的酶活性測定用柱，該填充劑由不溶于水的底物和固定于上述底物、能識別磷酸化酶的抗體構成。
7.如權利要求6所述的酶活性測定用柱，其特征在于所述磷酸化酶為周期素依賴性激酶。
8.如權利要求6或7所述的酶活性測定用柱，其特征在于直徑為0.3～30mm，全長為5～100mm。
全文摘要
一種酶活性測定方法，包括以下步驟(1)在填充有由不溶于水的底物和固定于該底物中、能識別待測酶的抗體構成的填充劑的柱內，加入含待測酶的試樣，用上述抗體捕捉酶；(2)在上述柱內加入上述酶的基質，使被上述抗體捕捉的酶與上述基質反應，以及(3)檢測上述反應所得生成物。上述方法可以通過良好的反應效率沒有延遲地測定酶活性。
文檔編號C12M1/34GK1961077SQ20058001750
公開日2007年5月9日 申請日期2005年5月27日 優先權日2004年6月1日
發明者中山智, 長岡加奈子, 小林弘典, 石原英干 申請人:希森美康株式會社