一種尿嘧啶-dna糖基化酶活性測定方法
【專利摘要】本發明公開了一種尿嘧啶-DNA糖基化酶活性測定方法，所述方法包括如下步驟：首先是PCR擴增反應：以雙鏈DNA為模板，在dU/A/G/CTP混合物和引物存在下，利用聚合酶進行聚合反應，進行擴增，生成含有dU的擴增產物UDNA雙鏈；其次是尿嘧啶-DNA糖基化酶反應：擴增產物經受尿嘧啶-DNA糖基化酶作用，形成大量堿基缺失的DNA鏈；最后測定反應體系中單鏈DNA產物或UDNA雙鏈的相對量，并根據測定結果推導出尿嘧啶-DNA糖基化酶活性程度，其中尿嘧啶-DNA糖基化酶活性程度與反應體系中UDNA雙鏈的量成反比，而與單鏈DNA產物的量成正比。本發明方法無放射性污染，操作簡單便捷，靈敏度高，可以定量檢測，并且穩定。
【專利說明】一種尿嘧啶-DNA糖基化酶活性測定方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生化【技術領域】，具體來說涉及一種尿嘧啶-DNA糖基化酶活性測定方 法。
【背景技術】
[0002] UDG酶，即尿嘧啶-DNA糖基化酶（Uracil-DNA GlycocasylaseXUDG的作用原理是 選擇性水解斷裂含有dU的雙鏈或單鏈DNA中的尿嘧啶糖苷鍵，形成有缺失堿基的DNA鏈， 在堿性介質以及高溫下會進一步水解斷裂，從而被消除。UDG是細胞內DNA損傷修復系統中 一種重要的組分，在自然界廣泛存在，包括細菌、真核生物、人細胞中都有M)G酶表達。
[0003] UDG在PCR防污染方面具有非常重要的作用。PCR反應最常見，最重要的污染物是 PCR擴增產物污染。因為PCR靈敏度非常高，可到單拷貝。因此如果即使痕量的擴增產物污 染了模板，也會導致假陽性出現。目前常用的做法是在PCR反應體系中加入UDG，并以dUTP 取代dTTP，這樣PCR產物都是含有dU的DNA鏈。在PCR開始前增加一步較低溫度的孵育步 驟，UDG酶即可將反應體系中可能存在的上一輪的含有U-DNA的擴增產物中的尿嘧啶堿基 降解，并在隨后變性這步的條件下DNA鏈斷裂，消除由于污染DNA產生的擴增，從而保證擴 增結果的特異性，準確性。同時UDG酶被滅活，不會再降解新擴增的產物U-DNA。
[0004] 尿嘧啶DNA糖苷酶（UDG)活性測定通常采用20世紀80年代初建立的同位素法， 其原理大致為：UDG可將同位素標記的尿嘧啶從DNA或寡核苷酸上切下.當DNA或寡核苷 酸用三氯醋酸沉淀時，切下的尿嘧啶仍然留在溶液中，用液閃計數。這種方法易產生放射性 污染，且步驟多、周期長，難以實現高通量、自動化。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是建立一種簡便、快速、非放射性的尿嘧啶DNA糖苷酶（UDG)測活方 法。本發明原理如圖1所示。
[0006] 具體來說，本發明采用如下技術方案： 一種尿嘧啶-DNA糖基化酶活性測定方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：首先 是PCR擴增反應：以雙鏈DNA為模板，在dU/A/G/CTP混合物和引物存在下，利用聚合酶進行 聚合反應，進行擴增，生成含有dU的擴增產物UDNA雙鏈；其次是尿嘧啶-DNA糖基化酶反 應：擴增產物經受尿嘧啶-DNA糖基化酶作用，形成大量堿基缺失的DNA鏈；最后測定反應 體系中單鏈DNA產物或UDNA雙鏈的相對量，并根據測定結果推導出尿嘧啶-DNA糖基化酶 活性程度，其中尿嘧啶-DNA糖基化酶活性程度與反應體系中UDNA雙鏈的量成反比，而與單 鏈DNA產物的量成正比。
[0007] 優選地，雙鏈UDNA或單鏈DNA的相對量是利用熒光染料，通過熒光法測得的，并且 雙鏈UDNA或單鏈DNA的相對量是以熒光強度表示的。更優選，所采用的熒光染料是雙鏈 DNA特異性突光染料，例如可在市面上商購獲得的picogreen染料。
[0008] 優選地，所采用的雙鏈DNA模板是λ DNA，以便建立標準測定方法。
[0009] 本發明的優點： 1. 無放射性污染； 2. 操作步驟簡單快速，無需TCA沉淀、洗滌、干燥、洗脫步驟；可實現高通量、自動化的 活性測定。
[0010] 3.靈敏度高，可以定量檢測UDG酶的活性，并且穩定。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011] 圖1是本發明測定方法的原理圖。
[0012] 圖2是本發明測定方法獲得的酶活-熒光曲線圖。
【具體實施方式】
[0013] 本發明的目的是建立一種簡便、快速、非放射性的尿嘧啶DNA糖苷酶（UDG)測活方 法。本發明原理如圖1所示。
[0014] 如圖1所示，入〇嫩可以在肋/^/6/0^存在的條件下被了&9酶聚合生成耶嫩， UDG酶可以水解斷裂含有dU的UDNA中的尿嘧啶糖苷鍵，形成有大量缺失堿基的DNA鏈， picogreen染料不能結合這種產物，從而不能產生突光；但是不經過UDG酶作用的UDNA鏈， 則還是保持UDNA雙鏈結構，它可以被picogreen染料結合，產生突光。
[0015] UDG酶的活性在一定范圍內與單鏈DNA產物的量成正比，因此其活性就可以用 Picogreen熒光強度來進行測定。
[0016] 本發明的測定方法包含以下方面： I. UDNA的制備 弓I物 F :5' -cggatcgccacactcacaacaat-S' ; 弓I物 R :5，-aaaggccgggaaatacccagcc-3，; PCR 模板：λ DNA PCR反應： _
【權利要求】
1. 一種尿嘧啶-DNA糖基化酶活性測定方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：首 先是PCR擴增反應：以雙鏈DNA為模板，在dU/A/G/CTP混合物和引物存在下，利用聚合酶進 行聚合反應，進行擴增，生成含有dU的擴增產物UDNA雙鏈；其次是尿嘧啶-DNA糖基化酶反 應：擴增產物經受尿嘧啶-DNA糖基化酶作用，形成大量堿基缺失的DNA鏈；最后測定反應 體系中單鏈DNA產物或UDNA雙鏈的相對量，并根據測定結果推導出尿嘧啶-DNA糖基化酶 活性程度，其中尿嘧啶-DNA糖基化酶活性程度與反應體系中UDNA雙鏈的量成反比，而與單 鏈DNA產物的量成正比。
2. 如權利要求1所述的尿嘧啶-DNA糖基化酶活性測定方法，其特征在于，雙鏈UDNA 或單鏈DNA的相對量是利用熒光染料，通過熒光法測得的，并且雙鏈UDNA或單鏈DNA的相 對量是以熒光強度表示的。
3. 如權利要求2所述的尿嘧啶-DNA糖基化酶活性測定方法，其特征在于，所采用的熒 光染料是雙鏈DNA特異性熒光染料。
4. 如權利要求3所述的尿嘧啶-DNA糖基化酶活性測定方法，其特征在于，所采用的染 料是pi cogreen染料。
5. 如權利要求1所述的尿嘧啶-DNA糖基化酶活性測定方法，其特征在于，所采用的雙 鏈DNA模板是λ DNA。
【文檔編號】C12Q1/34GK104293927SQ201410502151
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月28日 優先權日:2014年9月28日
【發明者】徐曉昱, 劉來花, 王靜 申請人:南京諾唯贊生物科技有限公司