脂肪酶抑制劑的制作方法

專利名稱：脂肪酶抑制劑的制作方法
技術領域：
本發明提供含有來自茶的黃烷-3-醇單體類或其酰基化物的脂肪酶抑制劑。
背景技術：
近年來，隨著日本人生活方式的歐美化，對高脂肪食物的攝取也向著增加的方向發展。根據平成11年日本國國民營養調查的報告顯示，盡管對能量的攝取量在逐年減少，但其脂質能量比超過適合比率的25％、中性脂肪值和膽固醇值高的人的比例，60歲以上的占5～6成[日本國厚生勞動省平成11年國民營養調查結果的概要 臨床營養2001；98(5)577-588](日語原名；厚生労働省平成11年國民栄養調查結果の概要臨床栄養2001；98(5)577-588)。
肥胖是現今社會最重大的疾病之一，其主要原因是脂肪攝取過剩。且脂肪攝取過剩不僅會造成肥胖，還可由肥胖引發糖尿病、高脂血癥、高血壓、動脈硬化等。針對此肥胖的治療藥物，在日本國內唯一被認可的是食欲抑制劑馬吲哚(Mazindol)(日本注冊商標「マジンド一ル」)，但有報告指出其具有口渴、便秘、胃部不適感、惡心嘔吐等的副作用[臨床評價1985；13(2)419-459、臨床評價1985；13(2)461-515](日語原名；臨床評価1985；13(2)419-459、日語原名；臨床評価1985；13(2)461-515)。另外，在海外，通過抑制脂肪酶活性而具有抑制腸道吸收脂肪作用的賽尼可(Xenical)(日本注冊商標「ゼニカル」)也作為肥胖改善藥于市場銷售，但還是有脂肪便、排便次數增加、軟便、腹瀉、腹痛等的副作用，所以很難說是安全的(Lancet 1998；35267-172)。
為預防肥胖，雖然控制膳食減少攝取的熱量是有效的手段，但必須接受嚴格的營養指導，所以在日常生活中的實行多數比較困難。因此，安全、健康地抑制來自膳食的脂肪被體內吸收，是治療肥胖及其相關疾病或增進健康的現實而有效的方法。
在此背景下，被證明是既安全又對人體有效的指定保健食品的開發非常引人注目。至今為止，作為抑制餐后血清中性脂肪值上升的食品原料，已被銷售的有通過抑制胰脂肪酶抑制脂肪吸收的珠蛋白水解物[J.Nutr.1988；12856-60，日本臨床·食糧學會志1999；52(2)71-77健康·營養食品研究2002；5(3)131-144](J.Nutr.1988；12856-60、日語原名；日本臨床·食糧學會誌1999；52(2)71-77、日語原名；健康·栄養食品研究2002；5(3)131-144)、具有不同于甘油三酯的消化吸收特性的甘油二酯[J.Am.Coll.Nutr.2000；19(6)789-796 Clin.Chim.Acta.2001；11(2)109-117]、由魚油提煉的二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等的日本指定保健食品。
最近來自植物的抑制脂肪酶活性的物質也受到注目，特別是關于具有抑制脂肪酶活性的多酚類，已報到的有來自植物樹皮的單寧(日本國特公昭60-11912)；豆科植物豆茶決明中含有的單寧類、類黃酮類及其糖苷(日本國特開平8-259557)；配合了綠茶中的主要成分表沒食子兒茶素沒食子酸酯及表兒茶素沒食子酸酯的抑制脂質吸收的食品(日本國特開平3-228664)；含有青椒、叢生口蘑、南瓜、灰樹花、羊棲菜、綠茶、烏龍茶等的水提取物的脂肪酶抑制劑(日本國特開平3-219872)；黃酮及黃酮醇類(日本國特開平7-61927)羥基安息香酸類(沒食子酸)(日本國特開平1-102022)；三萜類化合物及其衍生物(日本國特開平9-40689)；羅望子的以原花青素為有效成分的抗肥胖劑(日本國特開平9-291039)等。且還已知葡萄籽提取物的脂肪酶抑制作用[Nutrition 2003；19(10)876-879]；來自五層龍的多酚的脂肪酶抑制作用和對大鼠的抗肥胖作用(J.Nutr.2002；1321819-1824)；烏龍茶提取物對小鼠的抗肥胖作用(Int.J.Obes.1999；2398-105)等。
但是，如上所示已報導的來自植物的脂肪酶抑制劑還不能說效果十分顯著。例如，某些植物的提取物即使有效果，但因其中含有的活性成分的量還不明確，且是起源于天然物質，所以很難維持穩定的脂肪酶抑制活性。而且來自嗜好性低的植物的抑制劑作為飲料食品利用時，還存在著影響其香味的問題。例如，在顯示烏龍茶改善脂質的效果的報道中，報道了每日1330ml、飲用6星期市售的烏龍茶后，血液中中性脂肪值顯著降低的結果[日本營養·食糧學會志1991；44(4)251-259](日語原名；日本栄養·食糧學會誌1991；44(4)251-259)；還有以單純性肥胖癥的男性女性102名為對象，連續6星期經口攝取烏龍茶(2g×4/日)，其結果67％的被驗者體重減少了1kg以上，而且血液中中性脂肪值呈高值的被驗者在攝取烏龍茶后表現出了顯著的改善效果[日本臨床營養學會雜志1998；20(1)83-90] (日語原名；日本臨床栄養學會雑誌1998；20(1)83-90)。如此大量飲用烏龍茶雖有效果，但在日常生活中很難持續。并且，即使提供單純濃縮的烏龍茶，也會因苦味、澀味過強，咖啡因量增加而成為不現實的方法。
專利文獻1日本國特公昭60-1191專利文獻2日本國特開平8-25955專利文獻3日本國特開平3-2286專利文獻4日本國特開平3-2198專利文獻5日本國特開平7-6192專利文獻6日本國特開平1-10202專利文獻7

日本國特開平9-40689專利文獻8日本國特開平9-291039非專利文獻1日本國厚生勞動省“平成11年國民營養調查結果”的概要(日語原名；厚生労働省[平成11年國民栄養調查結果」的概要)非專利文獻2臨床營養2001；98(5)577-588(日語原名；臨床栄養2001；98(5)577-588)非專利文獻3臨床評價1985；13(2)419-459、臨床評價1985；13(2)461-515(日語原名；臨床評価1985；13(2)419-459、日語原名；臨床評価1985；13(2)461-515)非專利文獻4Lancet 1998；35267-1非專利文獻5J.Nutr.1988；12856-60，1988非專利文獻6日本臨床·糧食學會志[日語原名；日本臨床·食糧學會誌1999；52(2)71-77]非專利文獻7健康·營養食品研究2002；5(3)131-144[日語原名；健康·栄養食品研究2002；5(3)131-144]非專利文獻8J.Am.Coll.Nutr.2000；19(6)789-79非專利文獻9Clin.Chim.Acta.2001；11(2)109-117
非專利文獻10Nutrition 2003；19(10)876-879非專利文獻11J.Nutr.2002；1321819-182非專利文獻12Int.J.Obes.1999；2398-10非專利文獻13日本營養·糧食學會志1991；44(4)251-259[日語原名；日本栄養·食糧學會誌1991；44(4)251-259]非專利文獻14日本臨床營養學會雜志1998；20(1)83-90[日語原名；日本臨床栄養學會雑誌1998；20(1)83-90]非專利文獻15Chem.Pharm.Bull 1987；35(2)611-61非專利文獻16Chem.Pharm.Bull 1989；37(12)3255-356
發明內容本發明著眼于嗜好性高的茶中含有的成分，提供含有發源于茶的黃烷-3-醇單體類或其酰基化物中至少一種的脂肪酶抑制劑。
本發明還提供添加了上述脂肪酶抑制劑，嗜好性高且可降低血液中中性脂肪、增進健康的飲料食品。
本發明進一步提供含有上述脂肪酶抑制劑，抑制來自膳食的脂肪的吸收，抑制血液中中性脂肪上升的醫藥組合物。
作為解決上述課題的手段，從茶中尋找抑制脂肪吸收時必需的胰脂肪酶的成分，評價其中存在的種種多酚的脂肪酶抑制活性，并證實了黃烷-3-醇單體類或其酰基化物具有強的脂肪酶抑制活性。
更具體地說，本發明脂肪酶抑制劑的特征在于，含有用下式化學式1
或 (式中，R1及R3分別獨立，是H或OH，R2是H，R4是H、G、3MeG或p-cou，R5是H或G，R4’及R5’分別獨立，是H或G，R4”是H或G，且G、3MeG及p-Cou分別是下式化學式2
的基團)表示的黃烷-3-醇單體類或其酰基化物中的至少一種。
優選的黃烷-3-醇單體類或其酰基化物，從含有(-)-表阿夫兒茶精3-O-沒食子酸酯((-)-epiafzelechin 3-O-gallate)(化合物1)、(-)-表兒茶素3-O-沒食子酸酯((-)-epicatechin 3-O-gallate)(化合物3)、(-)-表兒茶素3-O-(3’-O-甲基)-沒食子酸酯((-)-epicatechin 3-O-(3’-O-methyl)-gallate)(化合物4)、(-)-表沒食子兒茶素3-O-沒食子酸酯((-)-epigallocatechin 3-O-gallate)(化合物6)、(-)-表沒食子兒茶素3，5-二-O-沒食子酸酯((-)-epigallocatechin 3，5-di-O-gallate)(化合物7)、(-)-表沒食子兒茶素3-O-p-coumaroate((-)-epigallocatechin 3-O-p-coumaroate)(化合物8)、(-)-兒茶素3-O-沒食子酸酯((-)-catechin 3-O-gallate)(化合物10)、(-)-沒食子兒茶素3-O-沒食子酸酯((-)-gallocatechin 3-O-gallate)(化合物12)、沒食子兒茶素3，5-二-O-沒食子酸酯(gallocatechin 3，5-di-O-gallate)(化合物13)、8-C-抗壞血酸-(-)-表沒食子兒茶素(8-C-ascorbyl-(-)-epigallocatechin)(化合物14)、及8-C-抗壞血酸-(-)-表沒食子兒茶素3-O-沒食子酸酯(8-C-ascorbyl-(-)-epigallocatechin 3-O-gallate)(化合物15)的群中選擇。根據脂肪酶抑制活性的強度特別優選(-)-epigallocatechin3，5-di-O-gallate(化合物7)。
本發明的黃烷-3-醇單體類或其酰基化物有市售商品，也可從市售的綠茶、紅茶、烏龍茶等天然材料中提取獲得。例如，如Chem.Pharm.Bull1987；35(2)611-616、Chem.Pharm.Bull 1989；37(12)3255-3563中的報道，從烏龍茶茶葉中精制黃烷-3-醇(flavan-3-ol)成分，確認了兒茶素和其酰基化物的存在。gallocatechin3，5-di-O-gallate可根據本說明書實施例2中所述的方法獲得。
脂肪酶抑制劑本發明的黃烷-3-醇單體類或其酰基化物，可不包含其他成分單獨作為脂肪酶抑制劑使用，或也可與溶劑、固體載體同時作為脂肪酶抑制劑使用。考慮到溶劑或載體作為下述飲料食品及/或醫藥品使用，所以優選可安全地作為食品或醫藥品使用的物質。本發明的脂肪酶抑制劑具有種種用途，例如用于試驗研究，用作預防中性脂肪積累的食品、醫藥品的有效成分。
脂肪酶抑制活性的測定方法本發明的脂肪酶抑制劑對脂肪酶、特別是胰脂肪酶有強抑制作用。其抑制活性可按照實施例1中具體記載的方法測定。
含有脂肪酶抑制劑的飲料食品將含有本發明的黃烷-3-醇單體類或其酰基化物的脂肪酶活性抑制劑作為抑制脂肪酶活性的成分添加于飲料食品中，可防止伴隨進餐時脂肪成分的攝取使血液中中性脂肪產生不期望的上升，及/或可降低已上升了的血液中的中性脂肪。飲料食品的優選例為日常攝取的飲料食品，例如綠茶、麥茶、烏龍茶、紅茶、咖啡、運動飲料、飲料水、調料、調味汁。但飲料食品只要是通常食用的飲料食品即可，可為清涼飲料、雞尾酒、啤酒、威士忌、燒酒、葡萄酒、清酒、調料、調味汁、調味米、加工食品、方便食品、軟罐頭食品、巧克力、鮮奶油、西式糕點、乳制品、健康食品、營養補助食品等。
飲料食品中本發明脂肪酶活性抑制劑的添加量，每餐黃烷-3-醇單體類或其酰基化物的攝取量為0.1mg～10g。但因本發明的黃烷-3-醇單體類或其酰基化物來自食品，安全性非常高，所以在飲料食品中的添加量實際上無上限。
含有脂肪酶活性抑制劑的醫藥品含有本發明黃烷-3-醇單體類或其酰基化物的脂肪酶抑制劑，可抑制來自膳食的脂肪的吸收，可用作防止不期望的血液中中性脂肪上升及/或使其降低的藥劑的有效成分。優選的藥劑為經口投藥的藥劑，例如保健飲料、片劑、膠囊、顆粒劑、散劑、糖果、滴丸劑等。藥劑中含有的本發明化合物的量，1次服用量為0.1mg～10g。
因本發明醫藥品的脂肪酶活性抑制成分安全性高，所以長期服用也很安全。因此，為防止或消除生活習慣病所引起的肥胖，可日常服用。
本發明可提供添加含有來自茶葉的黃烷-3-醇單體類或其酰基化物中至少一種的脂肪酶抑制劑后，既不損壞香味，嗜好性高，又可降低中性脂肪、增進健康的飲料食品。為抑制食用脂肪的吸收，優選與膳食同時攝取，所以強化了從茶中獲得的有效成分的飲料具有重大意義。特別是通過增強這些成分，可開發能降低中性脂肪的茶。


圖1表示實施例3中用于評價脂肪酶抑制活性的化合物的化學結構式。
實施例實施例1脂肪酶抑制活性的測定脂肪酶活性的測定使用底物中熒光性的4-甲基傘形酮的油酸酯(4-UMO)，通過測定由反應生成的4-甲基傘形酮的熒光進行。
測定時，緩沖液使用含有150mM NaCl、1.36mM CaCl2的13mM Tris-HCl(pH值為8.0)。將底物4-UMO(Sigma公司制)，其為將配制的0.1M的DMSO溶液用上述緩沖液稀釋1000倍的產物，和脂肪酶，其為將豬胰脂肪酶(Sigma公司制)同樣用上述緩沖液制成400U/ml溶液的產物用于酶測定。
酶反應在25℃條件下，在96孔酶標板中添加、混合50μl的4-UMO緩沖液溶液和25μl的蒸餾水(或試樣水溶液)后，由添加25μl的脂肪酶緩沖液溶液使反應開始。反應進行30分鐘后，添加100μl的0.1M檸檬酸緩沖液(pH值為4.2)使反應停止，將反應生成的4-甲基傘形酮的熒光(激發波長355nm、發射波長460nm)用熒光分析儀(Labsystems公司制Fluoroskan Asent CF)測定。
被測試樣的抑制活性，相對于對照(蒸餾水)的活性，以抑制50％的試樣量作為IC50(μM)求出。
測定樣品(-)-epicatechin(化合物2)、(-)-epicatechin 3-O-gallate(化合物3)、(-)-epigallocatechin(化合物5)、(-)-epigallocatechin 3-O-gallate(化合物6)、(+)-catechin(化合物9)、(-)-catechin 3-O-gallate(化合物10)、(+)-gallocatechin(化合物11)、(-)-gallocatechin 3-O-gallate(化合物12)由和光純藥工業株式會社購入。
(-)-epiafzelechin 3-O-gallate(化合物1)、(-)-epicatechin 3-O-(3’-O-methyl)-gallate(化合物4)、(-)-epigallocatechin 3，5-di-O-gallate(化合物7)、(-)-epigallocatechin 3-O-p-coumaroate(化合物8)、按照Chem.Pharm.Bull 35(2)，611-616(1987)分離，8-C-ascorbyl-(-)-epigallocatechin(化合物14)、8-C-ascorbyl-(-)-epigallocatechin 3-O-gallate(化合物15)按照論文Chem.Pharm.Bull 37(12)，3255-3563(1989)分離。gallocatechin 3，5-di-O-gallate(化合物13)用實施例2的方法精制。
實施例2將可可茶(Camellia ptilophylla)的葉片(干燥物)100g用2000ml熱水(90℃)提取4分鐘，使用上述凍干品進行以下精制。將凍干粉末的1％水溶液吸附于Sep-Pak C18 Cartridge(5ml，Waters制)，用水洗滌后，將由乙腈洗脫的組分冷凍干燥。將此組分250mg注入Develosil C30-UG-5(20mm×250mm、野村化學株式會社制)，在0.05％TFA存在下，用5-30％乙腈的直線梯度(5ml/min、180min)洗脫，邊監控A280nm的吸收邊進行分離。將所得到的組分再注入YMC-Pak ODS(20×250mm、YMC株式會社制)，在0.1％TFA存在下，用20-25％乙腈的直線梯度(6ml/mim、60min)洗脫精制，獲得gallocatechin 3，5-di-O-gallate(13)。
實施例3兒茶素類的脂肪酶抑制活性兒茶素類及酰基化兒茶素類的脂肪酶抑制活性如表1所示。圖1記載了用于評價的化合物的化學結構式。
表1各種多酚的脂肪酶抑制活性

茶中存在的主要兒茶素類(2，3，5，6，9，10，11，12的8種)中，顯示了脂肪酶抑制活性的是沒食子酸形成酯鍵的flavan-3-ol類、3，6，10，12的4種。特別是茶葉中含量最多的(-)-epigallocatechin 3-O-gallate(EGCG6)在這些兒茶素類中顯示了最強的活性。EGCG中另1分子沒食子酸結合的(-)-epigallocatechin 3，5-di-O-gallate(7)顯示了EGCG的約3.5倍的活性，(-)-gallocatechin 3-O-gallate(GCG12)又1分子的沒食子酸結合的gallocatechin 3，5-di-O-gallate(13)顯示了GCG的約2倍的活性。分子內不具有如(+)-catechin的沒食子酸酯基團的物質不顯示脂肪酶抑制活性，而且沒食子酸酯基團越多活性越強，由上可表明表達活性時分子內沒食子酸酯基團的存在是非常必要的。
權利要求
1.脂肪酶抑制劑，其含有用下式化學式1
或 (式中，R1及R3分別獨立，是H或OH，R2是H，R4是H、G、3MeG或p-cou，R5是H或G，R4’及R5’分別獨立，是H或G，R4’’是H或G，且G、3MeG及p-Cou分別是下式化學式2
的基團)表示的黃烷-3-醇單體類或其酰基化物的至少一種。
2.權利要求1中所述的脂肪酶抑制劑，其中，黃烷-3-醇單體類或其酰基化物從含有(-)-表阿夫兒茶精3-O-沒食子酸酯((-)-epiafzelechin 3-O-gallate)、(-)-表兒茶素3-O-沒食子酸酯((-)-epicatechin 3-O-gallate)、(-)-表兒茶素3-O-(3’-O-甲基)-沒食子酸酯((-)-epicatechin 3-O-(3’-O-methyl)-gallate)、(-)-表沒食子兒茶素3-O-沒食子酸酯((-)-epigallocatechin 3-O-gallate)、(-)-表沒食子兒茶素3，5-二-O-沒食子酸酯((-)-epigallocatechin 3，5-di-O-gallate)、(-)-表沒食子兒茶素3-O-p-coumaroate((-)-epigallocatechin 3-O-p-coumaroate)、(-)-兒茶素3-O-沒食子酸酯((-)-catechin 3-O-gallate)、(-)-沒食子兒茶素3-O-沒食子酸酯((-)-gallocatechin 3-O-gallate)、沒食子兒茶素3，5-二-O-沒食子酸酯(gallocatechin 3，5-di-O-gallate)、8-C-抗壞血酸-(-)-表沒食子兒茶素(8-C-ascorbyl-(-)-epigallocatechin)、及8-C-抗壞血酸-(-)-表沒食子兒茶素3-O-沒食子酸酯(8-C-ascorbyl-(-)-epigallocatechin 3-O-gallate)的群中選擇。
3.權利要求2中所述的脂肪酶抑制劑，其中，黃烷-3-醇單體類的酰基化物是表沒食子兒茶素3，5-二-O-沒食子酸酯(epigallocatechin 3，5-di-O-gallate)。
4.飲料食品，其添加了權利要求1～3中任一項所述的脂肪酶抑制劑。
5.權利要求4中所述的飲料食品，其中，飲料食品從含有茶飲料、清涼飲料及健康食品的群中選擇。
6.醫藥組合物，其含有權利要求1～3中任一項所述的脂肪酶抑制劑。
7.權利要求6中所述的醫藥組合物，其用于抑制來自膳食的脂肪的吸收。
全文摘要
本發明提供含有發源于茶的黃烷－3－醇單體類或其酰基化物的脂肪酶抑制劑及添加該抑制劑的飲料食品、醫藥品。更具體地說，本發明是含有用化學式1
(式中，R
文檔編號A23L1/30GK1980655SQ20058002227
公開日2007年6月13日 申請日期2005年7月5日 優先權日2004年7月5日
發明者中井正晃, 福井祐子, 淺見純生, 橋本文雄 申請人:三得利株式會社