使用微孔芯片的篩選方法及篩選裝置的制作方法

專利名稱：使用微孔芯片的篩選方法及篩選裝置的制作方法
技術領域：
本發明涉及使用微孔芯片，篩選具有酶活性的蛋白質或產生具有酶活性蛋白質的微生物的方法及用于此種微生物篩選的裝置。本發明還涉及確認微生物在細胞膜表層表達具有酶活性的蛋白質或分泌表達具有酶活性的蛋白質的方法及裝置。
背景技術：
以往，關于篩選具有有用功能的微生物(例如產生有用蛋白質的微生物)的技術，通常的方法是將微生物涂在瓊脂培養皿上，加以某種選擇壓，以確認其是否增殖，或添加基質，例如確認是否形成暈圈等的方法。通過此種方法篩選目的微生物。但是，此種方法具有如下問題，需要大量的瓊脂培養皿，制作瓊脂培養皿、播種菌株需要很多勞力、時間和成本。
近來，用基因組學或蛋白組學分析大量基因、蛋白質的功能時，需要使用微量樣品進行高速分析。為適應此需求，正在推進對微量且高速分析用的DNA芯片和蛋白芯片等的開發。由于微細加工技術的進步，制備極微小的孔(chamber)(well)已成為可能。并且利用CCD照相機及計算機處理，可進行定性、半定量的分析。
非專利文獻1中報道了如下技術，實際使用此種微孔芯片技術，進行1細胞PCR、或進行無細胞系蛋白合成、或檢測加入細胞的熒光發色細胞等。且此非專利文獻1中也報道了，將改變了的基因全部導入大腸桿菌或酵母，可對表達了的蛋白的功能進行分析。
伴隨此種技術的進步，可一次性篩選多數基因或蛋白質、可短時間間進行功能分析的高通量篩選法已為人矚目。現在的高通量篩選法是將大量化合物使用96孔或384孔的板、使用自動化裝置進行篩選的方法。非專利文獻2中報道了使用無細胞蛋白質合成系統合成蛋白質的高通量篩選技術。
非專利文獻1《特集組合生物工程》，生物產業，2001年，18卷，6月號，7～17頁，56～72頁(日語原名「特集コンビナトリアル バイオエンヅニアリング」、バイオインダストリ一、2001年、18卷、6月號、7～17頁、56～72頁)非專利文獻2Nippon Nogeikagaku Kaishi，Vol.78，No.5，27～30(2004年5月1日發行)發明內容此96孔或384孔板中存在的各孔的容量，96孔板約為300μl，384孔板約為100μl。使用此種板進行篩選時，至少需要各孔容量的3分之1左右的溶劑，同時需要與其相應量的試劑等。篩選的次數增多時，僅此部分成本就會上升。
并且最近越來越需要從更大量的文庫中微量、短時間且廉價地篩選具有脂肪酶活性等酶活性的蛋白質、微生物。如果使用上述瓊脂培養皿進行篩選，必須花費巨大的勞力和成本，所以適應此種需要非常困難。實際中進行的是使用96孔或384孔板進行酶反應，進行抑制劑的高通量篩選，但在更大量處理時會產生包含成本在內的很多問題。
另外，例如只要是內徑為100μm左右，深度為10μm左右的微孔，其容量即為約80pl，僅用上述96孔或384孔板上設置的孔的10萬分之1的容量即可。如果是具有上述容量的微孔，1cm2面積的板上即可配置5000～100000個左右。因此，使用微孔配置成陣列狀的板進行微生物、蛋白質的篩選，即可期待實現高速且低成本的功能分析。
雖然在微孔內可進行種種反應，但目前的現狀是還未有過通過酶反應進行的高通量的篩選。
也就是說，至今為止使用96孔、384孔板的目的是醫藥用途的酶抑制劑的篩選。因酶抑制劑是低分子化合物，所以化學文庫即使多也不過100萬個左右，對微孔芯片的需要并不太高。但是，最近伴隨對從更大量的文庫中進行篩選的需求性，期望使用微孔芯片進行篩選。
因此，本發明提供使用上述微孔芯片、篩選具有有用功能的微生物、蛋白質的方法及裝置。本發明還提供通過基因重組，可確認出在酵母等的微生物、細胞的細胞膜表層表達或分泌表達具有酶活性的蛋白質的方法及裝置。
為解決上述課題，本發明所涉及的篩選方法，其特征在于，包括在具有配置成陣列狀的多數微孔的基板上，添加通過分解可發生熒光的熒光底物的工序；和將含有蛋白質或微生物的樣品滴在上述基板上的工序；和通過檢測通過蛋白質或微生物與上述熒光底物的酶反應所發生的熒光，檢測上述微孔內存在的具有酶活性的蛋白質或產生其蛋白質的微生物的工序。
本發明的蛋白質或微生物的篩選方法是使用具有配置成陣列狀的多數微孔的基板，對具有某種酶活性的蛋白質或產生其蛋白質的微生物進行篩選的方法。
根據此篩選方法，可通過使用具有其容量為pl單位的非常小的微孔的基板，從包含大量文庫的樣品中短時間且廉價地篩選。因各微孔非常小，所以可從樣品中微量取出含有目的蛋白質或微生物的溶液。其結果，為微生物的情況下可從中取出1個～多個，也可使其增殖。由此，可在篩選的下一階段實施的、例如功能分析等中，以其本身的狀態或使其增殖的狀態使用。在此，文庫是指樣品中含有的全蛋白質或全微生物(也包括目的蛋白質或目的微生物以外的蛋白質或微生物)。
“包含蛋白質或微生物的樣品”也包括可能含有具有某種特定酶活性的蛋白質或微生物的樣品。也就是說，上述樣品是指成為目的蛋白質或微生物的篩選對象的樣品。上述樣品的具體例子，可以是從土壤或海洋等自然環境中采集的樣品，也可以是通過以往公知的基因工程技術根據轉化法制備的包含突變蛋白質或微生物的突變體的樣品等。
作為上述樣品，使用從土壤或海洋等自然環境中采集的樣品進行本發明的篩選時，可從自然界中篩選具有特定酶活性的有用的微生物。且上述樣品使用包含突變蛋白質或微生物的突變體的樣品，可從龐大的文庫中容易地分離出所制備的突變蛋白質或突變體。
在本發明的篩選方法中，上述蛋白質是在微生物的細胞膜表層表達的蛋白質，上述的檢測工序中，優選通過檢測上述多數的微孔中發生熒光的微孔，檢測在細胞膜表層表達具有酶活性的蛋白質的微生物。
也就是說，上述篩選方法中，成為篩選對象的蛋白質是在酵母等微生物的細胞膜表層表達的蛋白質。此時，篩選對象中也包括在細胞膜表層表達具有酶活性的蛋白質的微生物自身。
將含有在此細胞膜表層表達蛋白質的微生物的樣品滴在基板上時，上述微生物在基板上所形成的多數微孔的一些中分散存在。根據通過上述篩選方法，通過檢測哪些微孔內發生熒光，即可確認哪些微孔內含有目的蛋白質。
且在本發明的篩選方法中，如將底物導入細胞內進行酶反應，不僅可篩選在細胞外分泌表達或在細胞膜表層表達的蛋白質，也可篩選在細胞內表達的蛋白質。
本發明的篩選方法中，上述微孔的內徑優選5～500μm。
如上所述，如微孔的內徑在5～500μm的范圍內，微孔的容量即可為pl單位的非常小的容量。
本發明的篩選方法中，優選進一步包括在上述的檢測工序后取出含有上述蛋白質的微孔內的內容物的工序。
通過包括上述取出工序，可獲得含有目的蛋白質或微生物的微量溶液。由于此溶液非常微量且確實含有目的蛋白質或微生物，所以可在篩選之后進行的功能分析等中直接增殖利用。
為解決上述課題，本發明所涉及的篩選裝置是從樣品中篩選具有酶活性的蛋白質或產生其蛋白質的微生物的裝置，其特征在于，具有配置成陣列狀的多數微孔的基板，和具備檢測上述基板上發生的熒光的熒光檢測器，上述熒光檢測器通過檢測通過具有酶活性的蛋白質與熒光底物的酶反應所發生的熒光，檢測上述微孔內存在的具有酶活性的蛋白質或產生其蛋白質的微生物。
上述蛋白質或微生物的篩選裝置使用具有配置成陣列狀的多數微孔的基板(微孔芯片)，篩選具有某種酶活性的蛋白質或產生其蛋白質的微生物。
也就是說，本發明的篩選裝置是在具有配置成陣列狀的多數微孔的基板上，添加可能含有具有某種酶活性的蛋白質或產生該蛋白質的微生物的樣品、及通過分解可發生熒光的熒光底物，使具有酶活性的蛋白質與熒光底物在微孔內進行酶反應。熒光檢測器通過檢測在基板上設置的微孔中是否發生了熒光，來判定微孔內有無酶反應，進而判定有無具有酶活性的蛋白質或產生該蛋白質的微生物。
根據此篩選裝置，通過使用具有其容量為pl單位的非常小的微孔的基板，即可從大量文庫中短時間且廉價地進行篩選。并且，因各微孔非常小，所以可從樣品中微量取出含有目的蛋白質或微生物的溶液。其結果，為微生物時可取出1個～多個，也可使其增殖。由此，可在篩選的下一階段實施的、例如功能分析等中以其本身的狀態或其增殖的狀態使用。在此，文庫是指樣品中含有的全蛋白質或全微生物(包含目的蛋白質或微生物以外的蛋白質或微生物)。
如此，上述樣品是指成為篩選對象的樣品，具體地說，可以是從土壤或海洋等自然環境中采集的樣品，也可以是通過以往公知的基因工程技術通過轉化法制備的含有突變蛋白質或微生物的突變體的樣品等。
上述樣品中，使用從土壤或海洋等自然環境中采集的樣品進行本發明的篩選時，可從自然界篩選具有特定酶活性的有用的微生物。并且，上述樣品使用含有突變蛋白質或微生物的突變體的樣品進行篩選時，可容易地分離出所制備的突變蛋白質或突變體。
在本發明的篩選裝置中，上述蛋白質是在微生物的細胞膜表層表達的蛋白質，上述的熒光檢測器優選通過檢測上述多數的微孔中可發生熒光的微孔，檢測在細胞膜表層表達具有酶活性的蛋白質的微生物。
也就是說，上述篩選裝置中，成為篩選對象的蛋白質是在酵母等微生物的細胞膜表層表達的蛋白質。此時，篩選對象也包括在細胞膜表層表達具有酶活性的蛋白質的微生物自身。
將含有在此細胞膜表層表達蛋白質的微生物的樣品滴在基板上時，上述微生物在基板上所形成的多數微孔的一些中分散存在。因此，熒光檢測器通過檢測基板上設置的多數微孔中哪些微孔發生了熒光，即可確認哪些微孔內含有目的蛋白質。
本發明的篩選裝置，優選進一步具備取出發生熒光的微孔內的內容物的顯微操作器。
根據上述構成，可獲得含有目的蛋白質或微生物的微量溶液。由于此溶液非常微量且確實含有目的蛋白質或微生物，所以可在篩選之后進行的功能分析等中直接利用。
本發明的篩選裝置中，上述微孔的內徑優選為5～500μm。
如上所述，只要上述微孔的內徑在5～500μm的范圍內，微孔的容量即可為pl單位的非常小的容量。由此，可將1個微孔內所包含的含有蛋白質或微生物的溶液直接用于之后進行的功能分析等中。
只要使用本發明的方法及裝置，即可簡便地確認在酵母等的微生物或細胞中具有酶活性的蛋白質在細胞膜表層表達或分泌表達。以往，為檢驗微生物或細胞中是否導入了表達目的蛋白的基因，使用在載體內導入抗生素抗性基因，確認在添加了抗生素的培養基中是否能生長發育的方法。此時，需使用多余的基因與載體結合，有時還需去除該基因。
另外，用本發明的方法確認時，可大量且同時地挑選少量樣品中進行了導入的突變株，且不需將多余的基因導入載體。同時，通常的方法是將GFP等發光蛋白質的基因導入載體并確認其表達，但此時需使多余的基因結合于載體，所以載體也會變長。如載體變長，就會產生基因難于導入、即使導入也不表達的問題。
本發明的篩選方法及篩選裝置，如上所述，通過使用具有其容量為pl單位的非常小的微孔的基板，可從含有大量文庫的樣品中短時間且廉價地進行篩選。并且，因各微孔非常小，所以可從樣品中微量取出含有目的蛋白質或微生物的溶液。由此，可在篩選的下一階段實施的、例如功能分析等中以其本身的狀態使用。
因此，本發明所涉及的篩選方法及篩選裝置可高速且低成本地實施，同時，能以容易利用于下～階段的狀態獲得目的蛋白質或微生物，所以可以說是具有很大方便性的方法及裝置。根據本發明的方法及裝置，可確認微生物在細胞膜表層表達具有酶活性的蛋白質或分泌表達具有酶活性的蛋白質。


圖1是一例表示構成本發明篩選裝置的模式圖。
圖2(a)是一例表示具有微孔的基板的模式圖。(b)、(c)是表示(a)所示基板上配置的微孔模式的模式圖。
圖3(a)是表示實施例1結果的模式圖，(b)是表示實施例2結果的模式圖，(c)是表示實施例3結果的模式圖。
符號說明1 具有微孔的基板2 電動平臺3 CCD照相機4 電腦10 篩選裝置具體實施方式
以下，更具體地說明本發明，但本發明不限于此記載。
本發明中的蛋白質或微生物的篩選，使用內徑為20～500μm的微孔配列成陣列狀的載玻片(基板)，還使用如下方法，通過在其微孔內加入含有酵母或微生物等的樣品及熒光底物并進行酶反應后，用熒光顯微鏡觀察所發生的熒光、或用安裝在顯微鏡上的CCD照相機攝影，以檢測進行了酶反應的微孔。
以下，就本發明的篩選方法及本發明的篩選裝置分別進行說明。
(1)本發明的篩選方法本發明的篩選方法包括在具有配置成陣列狀的多數微孔的基板上添加熒光底物的工序；和將含有蛋白質或微生物的樣品滴在上述基板上的工序；和通過檢測通過蛋白質或微生物與上述熒光底物的酶反應所發生的熒光，檢測上述微孔內存在的具有酶活性的蛋白質或產生其蛋白質的微生物的工序。
此篩選方法使用具有配置成陣列狀的多數微孔的基板。此基板被稱作微孔芯片，容量為1～2000pl左右(例如，微孔內徑為500μm時容量為2μl，內徑為100μm時容量為80pl)的非常小的凹型形狀的孔在載玻片上配列成陣列狀。此基板與本發明的篩選裝置中具備的具有多數微孔的基板是相同物體，所以將在篩選裝置的說明中詳細敘述。
在上述基板的微孔內，添加熒光底物的同時滴入含有蛋白質或微生物的樣品。此添加熒光底物的工序和滴入含有蛋白質或微生物的樣品的工序的順序可不同，先進行哪相工序均可。且“含有蛋白質或微生物的樣品”是指成為篩選對象的樣品，同時，本發明的篩選方法是指篩選具有其酶活性的蛋白質或產生該蛋白質的微生物的方法。
在“添加熒光底物的工序”及“滴入含有蛋白質或微生物的樣品的工序”之后，進行“檢測微孔內存在的具有酶活性的蛋白質或產生其蛋白質的微生物的工序”。在此檢測工序中，檢測配置成陣列狀的多數的微孔中哪些微孔發生了酶反應。因此，可判定進行了酶反應的微孔中含有目的蛋白質或微生物，未進行酶反應的微孔中不含目的蛋白質或微生物。
本發明的篩選方法中，使用熒光底物作為確認有無酶反應的酶反應底物。因此，在上述檢測工序中，通過檢測每個微孔是否發生熒光，可容易地確認是否引起了酶反應。所以也可容易地判定微孔內是否含有目的蛋白質或微生物。
根據本發明的篩選方法，通過使用具有其容量為pl單位的非常小的微孔的基板，可從含有大量文庫的樣品中短時間且廉價地篩選。并且由于各微孔非常小，所以可從樣品中微量取出含有目的蛋白質、微生物的溶液。其結果，為微生物時可取出1個～多個，也可使其增殖。由此可在進行篩選的下一階段、例如功能分析等中，以其本身的狀態或使其增殖的狀態使用。
且本發明的篩選方法，可在上述檢測工序后，進一步進行取出含有目的蛋白質的微孔內的內容物的工序。此取出工序可利用顯微操作器等進行。通過包括此種取出工序，可獲得含有目的蛋白質或微生物的微量溶液。由于此溶液非常微量且確實含有目的蛋白質或微生物，所以可直接利用于篩選之后進行的功能分析等。
(2)本發明的篩選裝置本發明的篩選裝置是從樣品中篩選具有酶活性的蛋白質或產生其蛋白質的微生物的裝置。此篩選裝置具備具有配置成陣列狀的多數微孔的基板，和檢測在上述基板上發生的熒光的熒光檢測器，上述熒光檢測器通過檢測通過具有酶活性的蛋白質與熒光底物的酶反應所發生的熒光，檢測上述微孔內存在的具有酶活性的蛋白質或產生其蛋白質的微生物。
圖1是本發明的篩選裝置的構成例。圖1中所示的篩選裝置10由具有微孔的基板1、和載置上述基板1且使其移動的電動平臺2、和用于檢測基板1上發生的熒光的熒光檢測器構成。基板1上內徑為5～500μm左右的微孔配列成陣列狀。且圖1A表示配置在基板1上的孔陣列。熒光檢測器由CCD照相機3和用于放映CCD照相機所拍攝的圖像的PC4構成。以下，就構成篩選裝置的各部分進行說明。
首先，對上述篩選裝置上設置的具有多數微孔的基板進行說明。
基板的材質可使用玻璃或聚碳酸酯等。其可通過在此基板上直接加工形成微孔，也可在此基板上粘貼開孔(洞)狀態的聚二甲基硅氧烷、聚酰亞胺等的膜。粘貼此種膜時，開在膜上的孔即為微孔。或者也可以在玻璃制的基板上涂膜后對膜面進行加工形成微孔。
因此篩選裝置用熒光檢測目的蛋白質和底物的酶反應，所以優選盡量不帶熒光的基板及膜。此種微孔芯片也包括現在市售的可獲得的微孔芯片。
基板上所形成的微孔，為使孔內的容量適當，優選其內徑為5～500μm，更優選為10～100μm。微孔的深度優選為5～50μm，更優選為7～20μm。如上所述，只要微孔的內徑為5～500μm的范圍內，其容量即可為1～2000pl左右。篩選后進行的蛋白質的功能分析，也使用此程度的微量溶液。因此，如能使微孔的容量在上述范圍內，即可將1個微孔內所包含的含有蛋白質或微生物的溶液直接用于以下的功能分析等。
且上述微孔配列在其長度、寬度為5～20mm、優選為5～10mm范圍的基板上。1個基板上所形成的微孔的數量優選為1000～100000，更優選為5000～100000。
微孔的形狀只要是凹型無特別限定，例如，可以是如非專利文獻1所示的四棱錐或四棱柱、圓柱、半球形、圓錐等。微孔的形狀是四棱錐或四棱柱時，上述“內徑”是指基板表面上微孔一邊的長度。微孔的形狀是圓柱、半球形或圓錐時，上述“內徑”是指基板表面上微孔的直徑。
圖2(a)是一例具有多數微孔的基板的模式圖。圖2(a)上部的圖表示上述基板的全部，下部的圖是配置于基板上的微孔的放大圖。此圖中所示的基板上，在其基本中央的位置上陣列狀配置有80×80個80μm間隔的微孔。而且此微孔的大小為內徑50μm、深度10μm，其形狀是半球形。
圖2(b)、(c)是一例表示上述基板上配置的微孔的陣列模式的模式圖。圖2(b)中所示的模式1是80×80個微孔在一邊為10.32mm的范圍內等間隔配置。圖2(c)中所示的模式2是40×40個微孔的部分配列、在一邊為11.24mm的范圍內配置，每邊2個、共4個。
其次，就上述篩選裝置上設置的熒光檢測器進行說明。
上述熒光檢測器可使用能檢測出由檢測對象物所發生的熒光的以往公知的所有儀器。其具體例子可例舉為熒光顯微鏡、帶光源及CCD照相機的圖像顯示裝置等。圖1中所示的篩選裝置中的熒光檢測器由CCD照相機3和PC4構成。
本發明的篩選裝置至少具備具有上述微孔的基板及熒光檢測器即可，除此2個構成部件以外，還可進一步具備用于取出發生熒光的微孔內的內容物的顯微操作器。
如設置顯微操作器，即可獲得含有目的蛋白質或微生物的微量溶液，且可直接將此微量溶液用于之后進行的蛋白質的功能分析等。
其次，說明使用本發明的篩選裝置，篩選目的蛋白質或微生物的步驟。
使用上述的篩選裝置進行篩選時，首先在形成有上述微孔的基板上滴入可能含有成為篩選對象的蛋白質或微生物的樣品。
滴樣時，在1個微孔內散布1～100個微生物，優選1～10個左右。因此，最好將由酵母的突變株或微生物組成的文庫懸浮于水或緩沖液中，制備濁度為0.01～1.0的樣品。而且，在孔內放入1個～多個微生物時0.5左右的濁度較為適合，加入更多微生物時則為更高的濁度。放入孔內的微生物的數量與樣品中含有的微生物的濃度有關，遵從泊松分布式。
然后，在此基板上添加含有熒光底物的溶液。
熒光底物，例如檢測脂肪酶活性時，可以是傘形酮的脂肪酸酯，熒光素的脂肪酸酯等。這些底物通過酯水解后發生熒光。檢測葡萄糖苷酶活性時，可列舉為傘形酮的葡萄糖苷衍生物、熒光素的葡萄糖苷衍生物、試鹵靈(resorufine)的葡萄糖苷衍生物等。半乳糖苷酶、葡萄糖醛酸苷酶等也可使用同樣的半乳糖苷衍生物、葡萄糖苷酸衍生物檢測。
使用包括肽酶在內的蛋白酶等可在上述底物的帶有氨基酸序列的寡肽的C末端、以酰胺鍵與具有氨基色滿(amino chroman)衍生物等氨基的熒光探針結合的底物進行檢測。例如，半胱天冬酶(caspase酶)可使用C末端具有天冬酰胺酰色滿(asparagyl chroman)的寡肽，識別胰蛋白酶等堿性氨基酸的蛋白酶可使用C末端具有賴氨酸色滿(Lys chroman)、精氨酰色滿(arginyl chroman)的寡肽，識別糜蛋白酶等脂溶性氨基酸的蛋白酶可使用C末端具有苯丙氨酰色滿(phenyl alanyl chroman)、亮氨酰色滿(leucyl chroman)等的寡肽。
這些熒光底物具有了通過各個酶的催化作用分解時可發生熒光的性質。熒光檢測器通過檢測此熒光，可判別上述樣品中是否含有具有酶活性(例如脂肪酶活性、葡萄糖苷酶活性、蛋白酶活性等)的蛋白質或產生其蛋白質的微生物，同時可判別配置成陣列狀的哪些微孔中含有上述蛋白質或上述微生物。
且含有此熒光底物的溶液中該底物濃度優選為10μm～1mmol/dm3(10μmM～1mM)。只要是此程度的濃度，即可充分檢測出樣品中含有的蛋白質的酶活性。
如上所述，在基板上添加樣品及含有熒光底物的溶液時，樣品中所含有的具有酶活性的蛋白質就會與熒光底物進行酶反應，分解熒光底物。而且為檢測基板上發生的熒光而配備的熒光顯微鏡(熒光檢測器)，可通過觀察熒光底物分解后生成的物質的熒光，檢測出哪些微孔具有酶活性。由此，可檢測出哪些微孔中含有目的蛋白質或微生物。熒光檢測器是帶光源及CCD照相機的電腦時，用光源的激發波長照射基板，將該基板上發生的熒光用CCD照相機傳入電腦，并在電腦上設置的圖像顯示裝置中顯示發生熒光的基板。因此，使用者可通過用圖像顯示裝置觀察，識別發生熒光的微孔。
使用上述裝置進行篩選時，先進行樣品的滴入和熒光底物的添加的哪一項均可。也就是說，不是如上所述的先滴入樣品，先添加熒光底物溶液后再滴入樣品也可檢測出酶活性。
在上述篩選裝置上配備顯微操作器時，通過從發生熒光的微孔內取出內容物，可微量獲得具有目的酶活性的微生物、蛋白質。其結果，為微生物時可取出1個～多個，也可使其增殖。此目的微生物可直接用于功能分析等。
本發明不只限于上述實施方式，可在權利要求所述范圍內作種種變更。即在權利要求所示范圍內，組合適當變更的技術方式后所獲得的實施方式也包含于本發明的技術范圍內。
實施例以下通過實施例進一步具體說明本發明。但是，本發明不只限于下述實施例。
針對脂肪酶分泌表達酵母使用微孔芯片中熒光底物的水解反應的檢測。
本實施例中，首先按以下步驟制備脂肪酶分泌表達酵母。
(1)脂肪酶分泌表達酵母的制備使用白地霉脂肪酶lip1(Geotrichum candidum lipase lip1)基因的5’端EcoRI、3’端SalI的位點可用的引物，進行聚合酶鏈反應(polymerase chainreaction(PCR))。通過將所得到的PCR產物用EcoRI、SalI酶切后與同樣用EcoRI、SalI處理的酵母用的分泌用載體pYE22m連接，構建白地霉脂肪酶分泌表達質粒pYEGCL1。構建的pYEGCL1的白地霉脂肪酶基因部分的堿基序列用脫氧終止法確認其有無錯誤。用pYEGCL1轉化啤酒酵母菌EH1315(Saccharomycescerevisiae EH1315)株，制備脂肪酶分泌表達酵母。質粒導入的確認是以從轉化株提取的基因為模板，使用白地霉脂肪酶基因兩端的引物進行PCR，用白地霉脂肪酶基因大小1.6kb左右的擴增帶的擴增確認。
(2)使用微孔芯片中的熒光底物的水解反應的檢測將用上述步驟制備的白地霉脂肪酶分泌表達酵母在10mL合成培養基中30℃振蕩培養2日后，用3000rpm、4℃、10分鐘離心分離培養液并集菌。所得到的菌體用PBS 10mL懸浮后，在同條件下用離心分離集菌。再次進行菌體的洗滌，洗滌菌體懸浮于PBS 1mL中，用OD600測定濁度。在4℃保存狀態的微孔芯片(內徑20μm)上，散布懸浮酵母40μl(相當于OD600＝0.6)，4℃放置10分鐘。然后，在其液面添加底物(0.1mmol/l(0.1mM)MU-C18/1％DMF/50mmol(50mM)磷酸緩沖液(pH7.0))360μl，4℃放置10分鐘。滑動覆蓋蓋波片，擠壓水分后，使板在濕度100％的培養箱(室溫)內反應1小時，之后用熒光顯微鏡觀察(激發波長320nm、檢測波長450nm)。
其結果如圖3(a)所示。此圖是倍率400倍的顯微鏡照片。如此圖所示，觀察到了基板上的各微孔內的熒光，可確認在各微孔內存在有白地霉脂肪酶分泌表達酵母。
針對脂肪酶表層表達酵母使用微孔芯片中熒光底物的水解反應的檢測。
本實施例中，首先按以下步驟制備脂肪酶表層表達酵母。
(1)脂肪酶表層表達酵母的制備使用白地霉脂肪酶lip1(Geotrichum candidum lipase lip1)基因的5’端EcoRI、3’端Xhol的位點可用的引物，進行聚合酶鏈反應(polymerase chainreaction(PCR))。通過將所得到的PCR產物用EcoRI、Xhol酶切后與同樣用EcoRI、Xhol處理的酵母用的分泌用載體pCASS25連接，構建白地霉脂肪酶表層表達質粒pCASS25GCL1。構建的pCASS25GCL1的白地霉脂肪酶基因部分的堿基序列用脫氧終止法確認其有無錯誤。用pCASS25GCL1轉化啤酒酵母菌EH1315(Saccharomyces cerevisiae EH1315)株，制備脂肪酶表層表達酵母。質粒導入的確認是以從轉化株中提取的基因為模板，使用白地霉脂肪酶基因兩端的引物進行PCR，用白地霉脂肪酶基因大小1.6kb左右的擴增帶的擴增確認。
(2)使用微孔芯片中的熒光底物的水解反應的檢測將用上述步驟制備的白地霉脂肪酶表層表達酵母在10mL合成培養基中30℃振蕩培養2日后，用3000rpm、4℃、10分鐘離心分離培養液并集菌。所得到的菌體用PBS 10mL懸浮后，在同條件下用離心分離集菌。再次進行菌體的洗滌，洗滌菌體懸浮于PBS 1mL，用OD600測定濁度。在4℃保存狀態的微孔芯片(內徑20μm)上，散布懸浮酵母40μl(相當于OD600＝0.6)，4℃放置10分鐘。然后，在其液面添加底物(0.1mM MU-C18/1％DMF/50mM磷酸緩沖液(pH7.0))360μl，4℃放置10分鐘。滑動覆蓋蓋波片，擠壓水分，之后使板在濕度100％的培養箱(室溫)內反應1小時后，用熒光顯微鏡觀察(激發波長320nm、檢測波長450nm)。
其結果如圖3(a)所示。此圖是倍率400倍的顯微鏡照片。如此圖所示，觀察到了基板上的各微孔內的熒光，可確認在各微孔內存在有白地霉脂肪酶表層表達酵母。
針對海洋性微生物使用微孔芯片中的熒光底物的水解反應的檢測將從海底采集的地桿菌(Terrabacter)屬的海洋微生物(與文獻微生物學雜志(J.Bacteriol).179，53-62，1997中所述的地桿菌屬細菌的16 SrRNA有100％同源性的菌)用市售的海鮮肉湯(marine broth)(Difco，cat no.279110)10mL、25℃振蕩培養5日后，將培養液用8000rpm、4℃、5分鐘離心分離并集菌。所得到的菌體用PBS 10mL懸浮后，在同條件下離心分離集菌。再一次進行菌體的洗滌，洗滌菌體懸浮于PBS 1mL。用OD600測定濁度。在4℃保存狀態的微孔芯片(內徑100μm)上散布懸浮酵母40μl(相當于OD600＝0.6)，4℃放置10分鐘。然后，在其液面添加底物(0.1mM Fluorescein-diC18/1％DMF/50mM磷酸緩沖液(pH7.0))360μl，4℃下放置10分鐘。滑動覆蓋蓋波片，擠壓水分后，使板在濕度100％的培養箱(室溫)內反應1小時，之后用市售的微陣列掃描儀(CRBIOTMIIe-FIPC)檢測(激發波長473nm，檢測波長532nm)。
其結果如圖3(c)所示。如此圖所示，觀察到了基板上的各微孔內的熒光，可確認在各微孔內存在有產生具有脂肪酶活性的海洋微生物。
根據本發明，可用微量的單位進行短時間、不耗費成本的篩選。因此，可有效地用于基因組學、蛋白質組學中大量的基因、蛋白質的功能分析。
權利要求
1.蛋白質或微生物的篩選方法，其特征在于，包括在具有配置成陣列狀的多數微孔的基板上添加通過分解可發生熒光的熒光底物的工序，和將含有蛋白質或微生物的樣品滴在上述基板上的工序，和通過檢測通過蛋白質或微生物與上述熒光底物的酶反應所發生的熒光，檢測上述微孔內存在的具有酶活性的蛋白質或產生其蛋白質的微生物的工序。
2.權利要求1中所述的篩選方法，其特征在于，上述蛋白質是在微生物的細胞膜表層表達的蛋白質，上述檢測工序通過檢測上述多數微孔中發生熒光的微孔，檢測在細胞膜表層表達具有酶活性的蛋白質的微生物。
3.權利要求1或2中所述的篩選方法，其特征在于，上述微孔的內徑為5～500μm。
4.權利要求1～3中任一項所述的篩選方法，其特征在于，進一步包括在上述檢測工序之后取出含有上述蛋白質的微孔內的內容物的工序。
5.蛋白質或微生物的篩選裝置，其是從樣品中篩選具有酶活性的蛋白質或產生其蛋白質的微生物的裝置，其特征在于，具備配置成陣列狀的多數微孔的基板，和具備檢測在上述基板上發生熒光的熒光檢測器，上述熒光檢測器是通過檢測通過具有酶活性的蛋白質與熒光底物的酶反應所發生的熒光，檢測上述微孔內存在的具有酶活性的蛋白質或產生其蛋白質的微生物。
6.權利要求5中所述的篩選裝置，其特征在于，上述蛋白質是在微生物的細胞膜表層表達的蛋白質，上述熒光檢測器通過檢測上述多數微孔中發生熒光的微孔，檢測在細胞膜表層表達具有酶活性的蛋白質的微生物。
7.權利要求5或6中所述的篩選裝置，其特征在于，還進一步具備取出發生熒光的微孔內的內容物的顯微操作器。
8.權利要求5～7中任一項所述的篩選裝置，其特征在于，上述微孔的內徑為5～500μm。
全文摘要
本發明涉及利用微孔芯片篩選具有有用功能的微生物、蛋白質的方法及裝置。更具體地說，使用具有配置成陣列狀的多數微孔的基板，從成為篩選對象的樣品中篩選具有目的酶活性的蛋白質或產生該蛋白質的微生物。此方法及裝置，通過檢測通過具有酶活性的蛋白質與熒光底物的酶反應所發生的熒光，檢測微孔內存在的具有酶活性的蛋白質或產生其蛋白質的微生物。
文檔編號C12Q1/34GK101014718SQ20058002829
公開日2007年8月8日 申請日期2005年8月24日 優先權日2004年8月24日
發明者植田充美, 中尾正宏, 朝見麻希, 落合美佐, 深見治一 申請人:三得利株式會社