專利名稱：嵌合g蛋白基狂犬疫苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及重組嵌合G蛋白基狂犬疫苗，其具有在植物組織中表達的SEQID No 1及其部分或其變體。
更具體的，本發明涉及SEQ ID No 2嵌合基因，其編碼具有SEQ ID No 1的嵌合G蛋白基狂犬疫苗。
本發明還涉及產生大規模嵌合G蛋白基狂犬疫苗的方法。
更具體的，本發明涉及對對象進行狂犬病的疫苗接種的方法。
發明的背景和現有技術可以參考WHO，1989，WHO的狂犬病專家委員會WHO技術報告(WHOTechnical Report)，WHO，Geneva，其報道狂犬病是最重要和廣泛傳播的人獸互傳的疾病，并且除了少數國家外，狂犬病是真正的全球性問題。狂犬病是可怕的疾病，是人類已知的最古老的疾病之一。狂犬病由于被感染的動物的咬傷或者粘膜暴露而傳播。一旦出現該癥狀，其被證明是致命的。
可以參考Holmes等人，2002；″Genetic Constraints and the AdaptiveEvolution of Rabies Virus in Nature″Virology 292，247-257，他們使用分子進化方法研究自然界中狂犬病病毒的適應。他們的分析揭示，與在被進行實驗室傳代的病毒中所觀察到的非同義進化的高速率相反，天然病毒分離物的核蛋白(N)和糖蛋白(G)基因的DNA序列是高度保守的，特別是在非同義位點。作為該觀點的證據，Charlton等人，1997.″The long incubation period in rabiesDelayed progression of infection in muscle at the site of exposure″，ActaNeuropathologica.94，73-77報道，盡管狂犬病病毒具有強趨向神經性，但是體內的復制不會僅僅發生在神經細胞中。具體的，所述病毒在肌肉組織中復制，還在進入外周和中樞神經系統以及唾腺和其他非神經組織之前在接種的位置復制。這樣的過程已經被Morimoto等人，1996.″Characterization of a uniquevariant of bat rabies virus responsible for newly emerging human cases in NorthAmerica″Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，5653-5658所記載，其說明病毒糖蛋白(G)序列中的體外取代在狂犬病毒的細胞培養中積聚，并改變對神經組織的趨向性，進而改變了毒性。這表現了病毒的適應過程，這也在Kissi等人，1999″Dynamics of rabies′virus quasispecies during serial passages in heterologoushosts″，J.Gen.Virol.80，2041-2050的研究中所強調的，他們觀察到來自由不同寄主物種傳代的病毒的編碼G蛋白的基因中的實質的遺傳變化。
可以參考Patrick等人，1987.美國專利4,707,356，其中肽疫苗需要確定病毒上的抗原決定簇，其具有在不同株中高度保守的序列。發現了狂犬病毒包被糖蛋白的片斷，其具有與箭毒樣蛇毒神經毒素片段的保守序列同源的序列，所述片段包括所述毒素被認為是通過其結合到位于神經肌肉結合處的乙酰膽堿受體結合位點(AchR)的片斷。Lentz等人在Science 226，847-848(1984)″Aminoacid sequence similarity between rabies virus glycoprotein and snake venomcuraremimetic neurotoxins″中報道狂犬病毒在神經肌肉結合處通過結合到在該結合處的乙酰膽堿受體上而聚集。Lenz等人所報道的發現是狂犬病毒在神經肌肉結合處的結合可以通過將含有這類結合的組織與已知會緊密結合到AchR的乙酰膽堿(Ach)結合位點的箭毒樣蛇毒神經毒素，α-金環蛇毒素進行預孵育而阻斷。
可以參考Dietzschold等人，1979.″Rabies virus strain.A comparative studyby polypeptide analysis of vaccine strain with different pathogenic patterns″Virology 98 63-75，其中通過胰蛋白酶肽分析檢測了狂犬病毒株ERA、HEP、CVS和PM(血清型I)和Mokola(血清型3)的五個組成多肽，并揭示了在Mokola和四個血清型1株之間的共同相似性，而胰蛋白酶疫苗株的全面比較說明CVS和PM互相之間比與ERA或HEP是更接近的。
可以參考Slater 1977年8月9日美國專利4,040,904″Novel 30 rabies virusvaccine and processes″，其中狂犬病毒的ERA株衍生自SAD病毒株，其最初分離自患有狂犬病的狗，并在小鼠的腦和倉鼠腎細胞中進行傳代，接著使其適應原代豬腎組織培養。狂犬病毒的ERA株的樣品于1964年10月29日被保存在American Type Culture Collection，Washington，D.C.，并且記錄為號碼VR332。含有適應原代豬腎組織培養的疫苗被廣泛應用于對包括狗、貓和家畜各種動物物種進行對狂犬病的免疫。根據該發明，提供了具有顯著可再生引起細胞病變能力的狂犬病毒的改進的削弱株。用于該發明的改進的狂犬病毒株是從狂犬病毒的ERA株制備的。ERA狂犬病株已經被Abelseth，M.K.在″Propagationof Rabies virus in Pig Kidney Cell Culture″，Can.Vet.J.584-87(1964)以及Abelseth，M.G.，″An Attenuated Rabies Vaccine for Domestic Animals Produced inTissue Culture″，Can.Vet.J.5279-286(1964)中所鑒定，其衍生自被Fenje，P.在″Propagation of Rabies Virus in Cultures of Hamster Kidney Cells″.Can J.Microbiol，6379-484中所描述的狂犬病毒。
可以參考Thoulouze等人，1997，″Rabies virus infects mouse and humanlymphocytes and induces apoptosis″in Journal of Virology 71107372-7380，他們表示狂犬病毒感染小鼠脾淋巴細胞和人類T淋巴細胞細胞系。Jurkat發現削弱的狂犬病毒株ERA比CVS更有效地感染共激活的脾細胞和T細胞系，其中CVS是高度神經毒性的狂犬病毒株，并且報道與CVS相反，ERA狂犬病毒和其他被削弱的病毒刺激強免疫反應，并能夠是有效的活疫苗。失活和被削弱的病毒被用于進行免疫，但生產滅活病毒的成本是主要問題。第二，這樣的疫苗應該是被完全滅活的，為了這樣的目標，首要的是候選疫苗應該是病毒的無毒力株，但其應該是免疫原和遺傳穩定的(Hooper等人，1998，Collaboration ofantibody and inflammation in the clearance of rabies virus from the CNS″inJournal of Virology；723711-9)。
Yang等人，1992在Journal of General Virology；73895-900，″Basis ofneurovirulent rabies virus variant Av01 with sterotaxic brain inoculation in mice″中報道致病性不僅僅是病毒的功能，而且大大依賴于寄主的感染位置和免疫狀態。盡管大部分被削弱的狂犬疫苗能夠潛在地引起致命的腦脊髓炎，這暗示即使失活和被削弱的病毒仍不是進行疫苗接種的可靠來源。
可以參考Coslett等人，1980，″The structural proteins of rabies virus andevidence for their synthesis from separate monocistronic RNA species″在Journalof General Virology，49161-180，他們報道狂犬病毒的基因組與水皰性口炎病毒的基因組是被相似組織的，其中水皰性口炎病毒被五種主要的蛋白質核蛋白(N)、磷蛋白質(NS)和聚合酶(L)蛋白質所編碼，其與基因組RNA共同形成核殼體，核殼體被含有跨膜糖蛋白G的膜(M)所包被。Conzelmann等人，1990在″Molecular cloning and complete nucleotide sequence of the attenuated rabiesvirus SAD B19″Virology 175485-499中克隆并測序了SAD B19狂犬病毒株的病毒基因組全核苷酸序列，其包括11,928個核苷酸，并編碼五種病毒蛋白質N、NS M、G和L。這五種順反子分別被2、5、5和24個核苷酸的基因間區域所分開。
可以參考Gaudin等人，1991″Rabies Virus Glycoprotein is a Trimer″Virology 187，627-632。他們研究了在病毒表面和經過使用去污劑溶解后的糖蛋白的低聚物結構。該研究表明該糖蛋白的原始四級結構是三聚體。然而在該研究中所使用的大部分去污劑會以單體的形式溶解G，只有CHAPS，一種兩性離子去污劑能夠使G以其原始的三體結構溶解，這是使用電子顯微鏡和去污劑溶解的G的沉降分析確定的。CHAPS溶解的G具有9S的沉降系數，而其他去污劑溶劑的G是以4S的單體形式。該研究證實了Whitt等人，1991″Membrane fusion activity，oligomerization and assembly of the rabies virusglycoprotein″in Virology 185，681-688所得到的結果，其中交聯劑被用于從所克隆的cDNA研究在HeLa細胞中所表達的G。電子顯微鏡還說明原始的分子具有“頭部”和“莖部”，并且提供了糖蛋白結構低分辨率模型的基礎。
可以參考Dietzschold等人，1983″Characterization of an antigenicdeterminant of the glycoprotein that correlates with pathogenicity of rabies virus″Proc.Natl.Acad.Sci.USA；8070-74，他們報道糖蛋白333位置的氨基酸精氨酸在狂犬病毒的致病性中發揮了重要的作用。Benmansour等人，1991″Antigenicity of rabies virus glycoprotein″Journal of Virology4198-4203通過利用單克隆抗體和中和抗性(MAR)突變體更精確地描述蛋白質的抗原性，而揭示抗原位置的相對重要性。在該研究中鑒定了226個中和的單克隆抗體，其中97％屬于位點II和III，這首先是由Lafon等人，1990在″Human monoclonalantibodies specific for the rabies virus glycoprotein and N protein″Journal ofGeneral Virology；711689-1696中所定義的。
可以參考Cox等人，1977″Rabies virus glycoprotein 11 Biological andserological characterization″ Infection Immunity 16，743-759，其中狂犬病毒的糖蛋白被鑒定為主要抗原，其誘導保護性的免疫，并誘導產生中和病毒的抗體，并提供對狂犬病毒致死力感染的免疫性。盡管對狂犬病毒感染的保護可能是許多寄主效應子相互作用的結果，但是根據Turner 1985，″Immune response afterrabies vaccinationbasic aspects″Ann.Inst.Pasteur Virol.136E453-460的研究，狂犬病毒G蛋白代表了開發亞單位疫苗的合理選擇，其能夠用于在人類和動物中對狂犬病進行免疫。這一方面，可以參考Cox等人，1980，″Preparation andcharacterization of rabies hemagglutinin″Infection Immunity 30，572-577。
可以參考Swamy等人，1984，″Neurological complication due to beta-propiolactone(BPL)-inactivated antirabies vaccination″Journal of theNeurological Sciences 631111-128，他們研究患者中由于使用BPL疫苗進行抗狂犬病接種疫苗的并發神經癥，這證明病毒不完全被β-丙內酯所失活，并可能具有健康的高風險，因為基本上所失活的狂犬病疫苗由含有被感染的動物的中樞神經組織的病毒懸浮液構成，例如兔或羊或被感染的鴨胎懸浮液。這種類型的疫苗還有另一個缺陷是，由于高含量的外源蛋白質，它們能夠在注射的位點以及通常情況下引起非期望的副作用。當使用來自中樞神經組織的狂犬疫苗時，患者可能甚至會遭受具有永久損傷的神經并發癥，主要由于一系列的注射對于充分保護免于狂犬病是必須的。而且，基于動物組織的疫苗可以攜帶類似朊病毒和類似HIV、雞痘、瘋牛病(Madcow)的病毒的傳染性顆粒。
Anilionis等人1981，″Structure of the glycoprotein gene in rabies virus″Nature294275-278克隆了編碼糖蛋白的基因，其使用從被狂犬病毒感染的BHK細胞提取的mRNA，經過寡聚(dT)纖維素色譜和蔗糖密度離心進行純化，并確定糖蛋白cDNA的全部核苷酸序列。后來，Yelverton等人，1983在″Rabiesvirus glycoprotein analogsbiosynthesis in Escherichia coli″Science219614-620，在大腸桿菌(Escherichia coli)中表達了糖蛋白，但是該蛋白沒有免疫學活性。這是因為抗原決定簇依賴于翻譯后修飾例如糖側鏈附加，即引入可靠的糖，因為它發生在真核細胞中，而在大腸桿菌(Escherichia coli)中達不到。各種其他的異源系統已經被用于表達狂犬糖蛋白。已經深入地試驗了兩種酵母以表達狂犬糖蛋白。它們是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Kelper等人，1993，Sakamoto等人，1999)和畢赤酵母(Pichia pastoris)(專利No.WO9000191，1990)。如根據使用狂犬特異性抗血清免疫印跡所檢測的，釀酒酵母(Saccharomyces)轉化體合成65～68kDa的多肽，它們以相同的分子量遷移作為真實狂犬病毒G蛋白種類。可以參考Sakamoto等人，1999，″Studies on thestructures and antigenic properties of rabies virus glycoprotein analogues producedin yeast cells″，Vaccine17205-218，其中鑒定了兩種類型的狂犬病毒糖蛋白，其是在轉染G-cDNA的酵母細胞中生產的。它們被稱作YGI(66kDa)和YGII(56kDa)。YG1與多克隆抗G抗體反應，但不與構象抗原決定簇特異性的MAb反應。而在釀酒酵母(Saccharomyces)中表達的該蛋白質不會保護動物抵抗狂犬病毒，在畢赤酵母(Pichia)中表達的該蛋白質被宣稱提供保護(WO90000191，日期1990)。然而，其細節沒有被公開，畢赤酵母(Pichia)體系也沒有被使用，因此畢赤酵母(Pichia)不是精選的體系。相同的G-cDNA被表達在動物細胞中，產生了單一的形式。這些結果得出結論大部分G蛋白分子不會在酵母細胞中被正常處理。Foley等人，2000″A recombinant rabiesvirus expressing vesicular stomatitis virus glycoprotein fails to protect againstrabies virus infection″Proc.Natl.Acad.Sci.97；2614680-14685確定了狂犬糖蛋白在保護中的重要作用，他們構建了重組RV(rRV)，其中狂犬病毒糖蛋白的胞外區和跨膜區被水皰性口炎病毒(VSV)糖蛋白的相應區域所替換，對免疫反應進行研究并與含有狂犬病毒糖蛋白親代的rRV株進行比較。對兩種病毒的內部病毒蛋白質相似的免疫反應說明了成功的感染，但所有接受rRV疫苗的小鼠都在挑戰后存活了，而使用區域置換的rRV-VSV-G進行的免疫并沒有誘導保護。這確認了狂犬病毒糖蛋白的關鍵和重要作用，也證明針對或狂犬病毒的免疫反應和免疫保護是兩種不同的現象。
在昆蟲細胞中由桿狀病毒載體的狂犬糖蛋白基因表達提供了在感染48小時后達到18％總細胞蛋白質的蛋白質高產率。在一項研究中(Prehaud DH等人，1989)，編碼CVS株G蛋白的基因被替換，在AcNPV多角體蛋白啟動子的控制下，并以高水平通過衍生的重組病毒使用Spodoptera fugiperda細胞系所表達。昆蟲衍生的蛋白質表現出稍快的電泳遷移率，因為多糖組分中的區別。通過昆蟲衍生的糖蛋白進行疫苗接種，接著對小鼠進行測試，提供了延遲的死亡率，即對狂犬病的低水平保護。
在另一項研究中，Rupprecht等人(1993)證明衍生自重組桿狀病毒感染的昆蟲細胞的糖蛋白(ERA株)是有效地作為浣熊的口服疫苗。考慮到相對高成本的昆蟲和哺乳動物細胞體系，這些不是作為開發針對狂犬病的疫苗策略的G蛋白表達的精選體系。
自從2000年，得到許可并在美國上市的某些重組痘病毒狂犬病糖蛋白基疫苗是(i)貓科(貓)狂犬病的Purevax-抵抗單種病毒的、活金絲雀痘載體(Merial.inc.)和(ii)浣熊的Raboral V-RG-口服活疫苗載體。
重組痘病毒(USPTO 5266313，1986；USPTO 05348741，1994)具有作為表達攜帶來自其他病毒的引起免疫抗原的基因的載體的許多有用的特征。它們容易生產并誘導細胞和體液免疫。然而，如果廣泛地用于人類和動物，會有關于疫苗病毒安全性的考慮。
金絲雀痘病毒Alvac-RG(vCP65)被用作非禽類物種中的載體(Taylor等人，1995)以表達狂犬病糖蛋白G基因(USPTO 5843456日期1998)以解決關于疫苗病毒擴散到非目標種群特別是免疫受損個體。禽痘病毒也被開發為表達狂犬病糖蛋白基因的載體。禽痘病毒(金絲雀痘病毒)重組體(USPTO 6340462日期2002)經歷了在非禽類細胞中的中止的復制，但能夠達到表達外源基因產品以及將它們遞呈給免疫系統，也沒有病毒能夠容易地適應在非禽類細胞中復制。體外研究已經顯示在六種人類衍生的細胞系中沒有檢測到病毒的復制。在不存在可生產的病毒復制時，對所有的細胞系都檢測到了狂犬病G蛋白的表達。在多種動物物種中測試了重組體(Alvac-RG；vCP65)的安全性和效率，接著對其進行一期臨床測試，該研究顯示了非復制型痘病毒作為人類中疫苗接種的載體的潛力(Fries等人，1996)。通過肌肉內和皮下路線，重組子是產生免疫的。在口服給藥時，它們也是產生免疫的。
包括痘病毒(posvirus)載體的病毒載體為傳播疫苗提供了方便的媒介。這還降低了從培養物中純化蛋白質相關的成本。然而，由于安全性能的考慮，對人類有意義的病毒載體需要經歷更嚴格的管理部門的審查才能許可。
基于細胞培養的狂犬病疫苗被限制于在細胞培養中生長病毒的無活性株。這些包括相對昂貴的人類雙倍體細胞疫苗(HDCV)、純化的Vero細胞狂犬病疫苗(Verorab)以及更經濟的原代雞胚細胞培養疫苗(PCEV-Rabipur)。這些疫苗包括在細胞培養中生長的病毒。目前的生物技術方法的目標是表達狂犬病毒的包被蛋白質基因以開發安全的RGP，其能夠被配置為活性疫苗。
最近幾年，在細胞培養中蛋白質或者安全“亞單位疫苗”的表達是常規的方法。這類可以使用的寄主細胞系的例子是VERO和HeLa細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系以及W138、幼倉鼠腎(BHK)、COS-7和MDCK細胞系。穩定的狂犬病毒糖蛋白的穩定表達被顯示在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中(Burger等人，1991)。得到了全長的糖基化67K蛋白質，其與從病毒感染的細胞所分離的G蛋白質共遷移。
就大小和免疫活性而言，在不同細胞系中所表達的狂犬病糖蛋白與天然的蛋白質相似。這樣產生的重組蛋白質提供了對蛋白質的生物學的理解，并提供了在選擇適當的表達系統時所考慮的參數的線索。所述蛋白質是分析級的，并能夠被純化到高純化程度。然而，基于這種方法的動物細胞系對于工業規模是非常昂貴的。為了決定通過經濟上可行的替代品，該表達系統應該自身結合用于發酵罐水平放大(如在細菌中)，以及用于生產與原始形式相近似的完全糖基化蛋白質(如在細胞系中)。在植物中表達是這方面中有希望的替代品。
在包括安全性和生產系統方面，亞單位疫苗是比傳統的削弱或被殺死的疫苗重要的改進。最近幾年在植物中表達外源蛋白質已經成為吸引人的替代，因為其具有大量和低成本地生產重組蛋白質的潛力。在遺傳工程領域最近的進展已經提供了將植物轉化以表達外源基因的必要工具。農桿菌(Agrobacteriurntumefaciens)已經被證明對于將工業上有價值的外源基因表達入植物組織內是有效和高度通用的載體，正如在Hood等人(1999)″Plant-based production ofxenogenic proteins″Current Opinion in Biotechnology 10382-386中所描述的。用于人類和動物疾病保護的疫苗包括基于植物的異種蛋白質最有競爭力的領域。在最近幾年，植物作為生產外源蛋白質的表達載體的應用已經獲得了關注。在植物中已經成功地表達了病毒蛋白質(HbsAg、Norwalk病毒殼體蛋白質、狂犬病糖蛋白、FMDV結構蛋白質VP1)、細菌毒素(LTB)、抗體分子和許多其它的工業和治療上重要的蛋白質(Tacket等人，2000；Kong等人，2001)。在多數情況中，所表達的蛋白質作為抗原或者在配體識別中是完全功能的。重要的是，它們能有效地引起特定的免疫反應。在植物中生產免疫原可以是比基于動物細胞的生產體系用于開發疫苗的經濟的替代。使用植物系統表達治療上重要的蛋白質的最大的優點是在從植物制備的蛋白質制劑中，不存在人類或者動物病原體例如HIV、Fowl Fox、Mad Calf、朊病毒。而另一種可能是利用植物材料直接作為食物，這樣產生可以食用的疫苗。盡管，對高水平蛋白質積聚、翻譯后蛋白質修飾和下游處理有許多研究的范圍，但是已經進行了充分的進展以引起在植物作為有力和經濟上可行的體系的興趣。
植物對陽光、水和礦物的簡單需求使它們成為正確處理和表達能夠是相當復雜的蛋白質的廉價工具。傳統的亞單位疫苗對于生產是昂貴的，并且不是熱穩定的，這就要求從在從制造商到接種疫苗需要“冷鏈”。這限制了它們的實用性和在發展中國家中低投資的衛生保健系統中的應用。然而在植物中表達的蛋白質通常是多年穩定，例如種子蛋白質。
如果將來自植物組織的粗蛋白質提取物進行口服給藥，則在轉基因植物中所生產的細菌抗原(大腸桿菌E.Coli腸毒素)能夠有效地使小鼠產生免疫，正如Curtiss和Cardineau，1997在″Oral immunization by transgenic plants″美國專利5,686,079以及Haq等人，1995在″Oral immunization with a recombinantbacterial antigen produced in plants″Science 268714-716所顯示的。在臨床試驗之后，Haq及其同事的工作顯示人類對以生食品釋放的抗原產生免疫反應，正如Tackett等人，1998″Immunogenicity in humans of a recombinant bacterialantigen delivered in transgenic potato″.Nature Medicine 4607-609所提到的。
可以參考McGarvey等人，1995″Expression of the rabies virus glycoproteinin transgenic tomatoes″ Bio/technology 131484-1487，它們將番茄植物(Lycopersicon esculentum)改造為表達在花椰菜花葉病毒35S′啟動子的控制下表達狂犬病糖蛋白(G蛋白)。該蛋白質在番茄中被表達，并在免疫沉淀后在Western印跡中表現62和60KDa的分子量，而來自在BHK細胞中生長的病毒的G蛋白被觀察到為66kDa。免疫沉淀的G蛋白的量被發現為可溶性蛋白質的大約1～10ng/mg，即0.0001％到0.001％的可溶性蛋白質。低表達水平可能是由于使用了設計得很差的基因。例如，使用了原始的編碼G蛋白的基因以及其原始的信號肽。發明人沒有檢測G蛋白的抗原性，因此不可能評價在番茄植物中所表達的G蛋白或者在該研究中所設計的基因的生物活性及應用，特別是用于藥物目的。
通過將病毒抗原決定簇表達在植物病毒的表面，接著使用重組的被修飾的病毒感染易感寄主，報道了針對疾病的植物衍生的免疫反應，例如水貂腸炎和狂犬病，可以參考Modelska等人，1998″Immunization against rabies with plant-derived antigen″Proc.Natl.Acad.Sci.USA 952481-2485，以及Yusibov等人，2002，″Expression in plants and immunogenicity of plant virus-basedexperimental rabies vaccine″。從組織純化植物病毒，并為測試動物進行給藥。盡管該系統是非常有效的，但是可以在載體病毒的表面表達的抗原多肽的大小被限制為37個氨基酸。因此，抗原的抗原決定簇分布是該方法所必需的。抗原的這類全面的信息通常不是可用的，特別是全長蛋白質的表達可能是唯一選擇的新發現的疾病。同時，許多抗原決定簇需要被鑒定和結合在一起，因為單一的抗原決定簇可能不提供可以接受的對病原病毒的保護。而且，防泄漏可以被認為是農業水平的顯著問題，特別是當使用環境穩定的病毒例如TMV時。
發明目的本發明的主要目的是提供重組嵌合G蛋白基狂犬疫苗，其具有在植物組織中表達的SEQ ID No1及其部分或其變體。
本發明的另一個目的是提供SEQ ID No2嵌合基因，其編碼具有SEQ IDNo1的嵌合G蛋白基狂犬疫苗。
本發明的另一個目的是提供產生大規模嵌合G蛋白基狂犬疫苗的經濟方法。
本發明的另一個目的是提供對對象進行狂犬病的疫苗接種的方法。
發明內容
本發明處理重組嵌合G蛋白基狂犬疫苗，其具有在植物組織中表達的SEQID No1及其部分或其變體，其包括在N-末端1～26位是PR-S信號肽的氨基酸殘基，接著是27～32位六個六組氨酸標簽殘基，33～36位是因子Xa蛋白質水解切割位點的四肽氨基酸殘基，37～541位是狂犬病毒ERA株的成熟糖蛋白G的氨基酸殘基，542～547位是將嵌合G蛋白保持在內質網的位于嵌合蛋白的C末端的六個氨基酸長的殘基。本發明還涉及產生大規模嵌合G蛋白基狂犬疫苗的方法以及對對象進行狂犬病的疫苗接種的方法。
圖1代表基因序列(嵌合)與文獻中所報道的基因序列(原始)的對比。
圖2代表氨基酸序列(嵌合)與文獻中所報道的氨基酸序列(原始)的對比。
圖3代表在克隆載體中的合成的新型嵌合G蛋白基因，其用于構建大腸桿菌(E.coli)植物表達載體圖4代表用于在大腸桿菌(E.coli)中表達嵌合蛋白質的大腸桿菌(E.coli)表達框，其使用合成的嵌合基因。
圖5代表在本研究中用于開發轉基因植物的植物表達盒。
圖6代表被經腹膜內注射狂犬病毒糖蛋白的Balb/c小鼠中的抗狂犬病免疫反應。
經腹膜內注射狂犬病毒糖蛋白在Balb/c小鼠中的抗狂犬病免疫反應。表示了第二次 和第三次 促進后的抗體效價。PIS(免疫前血清)、CON(對照小鼠，注射磷酸鹽緩沖液)、PDP(注射煙草葉的植物衍生的糖蛋白部分)、V(注射購買的Rabipur疫苗的小鼠)。在每種情況中，5只小鼠被注射。
圖7代表用活狂犬病毒對大腦內攻擊后的Balb/c小鼠的免疫保護用活狂犬病毒對大腦內攻擊后的Balb/c小鼠的免疫保護。圖7中表示5只小鼠的免疫反應，它們被活的CVS病毒攻擊，所述病毒被保存在IndianVeterinary Research Institute，Izatnagar，India，表示了被免疫接種磷酸鹽緩沖液 植物衍生的狂犬病毒糖蛋白 和購買的Rabipur疫苗 的小鼠的存活百分比。
發明的詳細描述因此，本發明提供了重組嵌合G蛋白，其具有在植物組織中表達的SEQ IDNo1及其部分或其變體。
在本發明的一個實施方式中，蛋白質的長度包括547個氨基酸或其部分和其變體。
在本發明的另一個實施方式中，所述蛋白質包括在N-末端在1～26位的PR-S信號肽氨基酸殘基，接著是在27～32位的六個六組氨酸標簽殘基，在33～36位的因子Xa蛋白質水解切割位點的四肽氨基酸殘基，在37～541位的狂犬病毒ERA株的成熟糖蛋白G的氨基酸殘基，在542～547位的將嵌合G蛋白保持在內質網的位于嵌合蛋白的C末端的六個氨基酸長的殘基。
進一步，本發明提供重組嵌合G蛋白基狂犬疫苗，其具有在植物組織中表達的SEQ ID No1及其部分或其變體。
在本發明的一個實施方式中，在所述疫苗中，蛋白質的長度是547個氨基酸。
在本發明的另一個實施方式中，所述疫苗蛋白質包括在N-末端1～26位是PR-S信號肽的氨基酸殘基，接著是27～32位六個六組氨酸標簽殘基，33～36位是因子Xa蛋白質水解切割位點的四肽氨基酸殘基，37～541位是狂犬病毒ERA株的成熟糖蛋白G的氨基酸殘基，542～547位是將嵌合G蛋白保持在內質網的位于嵌合蛋白的C末端的六個氨基酸長的殘基。
在本發明的另一個實施方式中，重組的嵌合G蛋白基因編碼具有針對活狂犬病毒的免疫保護活性的蛋白質。
在本發明的另一個實施方式中，所述疫苗提供對狂犬病毒100％的免疫保護。
在本發明的另一個實施方式中，所述疫苗控制人類、寵物和野生生物中的狂犬病。
另外，本發明還提供了SEQ ID No2嵌合基因，其編碼嵌合G蛋白基狂犬病疫苗。
在本發明的一個實施方式中，SEQ ID No2嵌合基因長度為1.67kb。
本發明還提供了一組SEQ ID No.3～54的52個引物，其可以用于合成SEQID No2嵌合基因。
在本發明的一個實施方式中，所有的寡聚核苷酸被化學合成并通過酶進行融合，以得到期望的雙鏈DNA。
另外，本發明還提供了用于在植物中產生大規模嵌合G蛋白基狂犬疫苗的經濟的方法，其通過表達新型嵌合基因SEQ ID No2，以控制狂犬病，其中所述方法包括以下步驟a)設計和構建由重組嵌合G蛋白質構成的基因，其中具有SEQ ID No1重組嵌合G蛋白質包括在N-末端1～26位是PR-S信號肽的氨基酸殘基，接著是27～32位六個六組氨酸標簽殘基，33～36位是因子Xa蛋白質水解切割位點的四肽氨基酸殘基，37～541位是狂犬病毒ERA株的成熟糖蛋白G的氨基酸殘基，542～547位是將嵌合G蛋白保持在內質網的位于嵌合蛋白的C末端的六個氨基酸長的殘基；b)根據理論合成1.67kb的SEQ ID No.2嵌合基因，以編碼步驟(a)中所提供的嵌合G蛋白；c)引入34個單一的限制性位點，并在步驟(b)中所得到的所述基因的上游制造HindIII和XbaI限制性位點，在所述基因的下游制造BamHI和SacI位點；d)將從步驟c)中所得到的所述基因克隆在質粒pBluescriptII SK(+)中，并將其命名為pSA17；e)從pSA17切出重組G蛋白質的HindIII-SacI片段；f)使用Ti雙向載體pBI101在HindIII-SacI位點連接從步驟(e)得到的片段，并將其命名為pSA5，其中Ti雙向載體pBI101包括CaMV35S啟動子，其具有兩個增強子和Nos轉錄終止子；g)通過已知的方法將從步驟(f)獲得的質粒載體pSA5轉化到A.tumenifaciens株LBA4404(pAL4404)。
h)將從步驟(g)中所得到的A.tumenifaciens株轉化到Nicotiana tabacum(煙草)植物；i)獲得表達重組嵌合G蛋白質基因的煙草轉基因植物；j)通過分子鑒定確認在從步驟(i)中所得到的轉基因植物中出現重組嵌合G蛋白質基因。
在本發明的實施方式中，狂犬病病毒株選自由ERA株、CVS株等所組成的組。
在本發明的另一個實施方式中，PR-S信號肽被其它相當的信號肽例如PR-1或任何其它信號肽所替代，這依賴于植物表達系統，以將蛋白質轉運到內質網。
在本發明的另一個實施方式中，所述蛋白質的長度是547個氨基酸。
本發明的另一個實施方式中，六組氨酸殘基能夠被任何其它選自由具有與基質的親和力的纖維素結合結構域、鏈霉親和素瓊脂糖結合結構域、谷胱甘肽-S-轉移酶融合等所組成組的肽，以進行純化。
在本發明的另一個實施方式中，四個用于切割的氨基酸殘基可以被任何選自由牛腸激酶、凝血酶、因子Xa等所組成組的內切蛋白質酶替代。
在本發明的另一個實施方式中，在組氨酸殘基的下游引入四個氨基酸殘基的多肽可以在金屬螯和親和柱上純化嵌合G-蛋白之后，對所述組氨酸殘基進行酶切。
在本發明的另一個實施方式中，其他相似應用的氨基酸殘基例如Asp AspAsp Asp Lys↓，Leu Val Pro Arg↓ Gly Ser，Ile Glu Glu Arg↓等能夠替代SEQID No.1蛋白質疫苗的切割位點氨基酸殘基。
在本發明的另一個實施方式中，在嵌合蛋白質的C末端引入六肽以將其保持在內質網的腔內，其中任何其它的保持信號可以是同等良好的，以將嵌合的G蛋白靶向和積聚在液泡、高爾基體、微管和微粒體或其它細胞器中。
在本發明的另一個實施方式中，重組的嵌合G蛋白基因編碼具有對活狂犬病毒免疫保護活性的蛋白質。
在本發明的另一個實施方式中，所述疫苗控制人類、寵物和野生生物中的狂犬病。
在本發明的另一個實施方式中，用于表達重組G蛋白基因的植物選自由煙草、玉米、豆類、蔬菜和/或其它植物和選自任何藻類的低級植物，其中豆類如鷹嘴豆、木豆、落花生，大豆、蔬菜如番茄、馬鈴薯、甜瓜、西瓜、菠菜、花椰菜、甘藍、紅辣椒、辣椒、胡蘿卜。
在本發明的另一個實施方式中，新型的嵌合G蛋白質從來自轉基因煙草植物的葉子的全部可溶蛋白質中被部分純化。
在本發明的另一個實施方式中，與滅活的病毒相比，所述蛋白質的免疫原高2～4倍，如在實施例2在表3以及圖6中所提供的。
在本發明的另一個實施方式中，疫苗的表達是植物中全部可溶性蛋白質的大約0.2％。
另外，本發明還提供了對對象進行接種免疫狂犬病的方法，其中所述方法包括為對象給藥藥物有效量的重組嵌合G蛋白基因疫苗，其中所述疫苗是在轉基因植物中生產和表達的，并根據情況還同時為對象給藥藥物上可以接受的添加劑。
在本發明的一個實施方式中，所述對象是人類、寵物和野生生物。
在本發明的另一個實施方式中，給藥植物表達的疫苗是通過選自口服、經腹膜內等途徑進行的。
在本發明的另一個實施方式中，所述重組嵌合G蛋白基因疫苗被以ng～μg濃度的量進行給藥，這依賴于蛋白質的純度。μg量的數據在實施例2和3中被提供。
在本發明的另一個實施方式中，所述疫苗對于給藥是安全的。
在本發明的另一個實施方式中，當疫苗被表達在不同的植物部分和組織特別是種子、塊莖、根、葉等時，所述疫苗被認為是長時間穩定的。例如已知儲存在種子中的蛋白質能夠穩定多年。
在本發明的另一個實施方式中，經過第2次加強劑量后，所述蛋白質的抗體效價在0.365±0.20的范圍內，經過第3次加強劑量后，為0.833±0.20，如實施例2所表示的。
在本發明的另一個實施方式中，所述疫苗提供了100％的免疫保護。
本發明涉及狂犬病毒ERA株的嵌合G蛋白以及編碼根據策略設計的重組蛋白質的合成基因。長度為547個氨基酸的嵌合G蛋白，這里被稱作嵌合G蛋白，是根據策略設計的，其通過將狂犬病毒ERA株(EMBLRHRBGP)的原始信號多肽(位點1～19)替換為煙草的PR-S信號肽(位點1～26)。ERA(EvelynRokitniki Abelseth)是熟知的狂犬病疫苗株，其是野生型狂犬病毒株SAD(StreetAlbama Duffering)的衍生物。SAD屬于血清型I，大部分經典的狂犬病毒株都被分組到血清型I。已經確定狂犬病的ERA株在鼠大腦內致死劑量50％(MCLD50)方面作為最有效的疫苗發揮作用。其在各種組織培養細胞系中產生數量級為105-107MICLD50/0.03ml的效價。因此，ERA株的G蛋白基因被選擇用于該研究。因此，為了開發基于植物的疫苗，ERA是很好的狂犬病毒株之一。相應于其它株如CVS等的基因也將適合開發基于植物的疫苗技術。
表示因子Xa的切割位點的全部六個組氨酸殘基和四肽被設計在信號肽和成熟的G蛋白質之間。在嵌合蛋白質的C末端包括將嵌合蛋白質保持在內質網內的六肽。以這種方式，嵌合G蛋白包括1～26位是煙草的PR-S信號肽的氨基酸殘基，27～32位是六個組氨酸殘基，33～36位是因子Xa的切割位點，37～541位是狂犬病毒ERA株的成熟G蛋白，542～547位是用于在內質網內定位的六肽。
表1設計植物內高表達水平的編碼狂犬病糖蛋白基因所遵循的參數
根據理論設計了1.67kb的核苷酸序列以編碼上述嵌合G蛋白。編碼這類嵌合蛋白質的基因被設計為在植物中高水平表達。每個氨基酸植物優選的密碼子平均分布以輔助有效的翻譯。在植物中適合達到基因高水平表達的翻譯起始環境(TAAACAATGAAC)被包括在5’末端，在嵌合蛋白質閱讀框的末端引入兩個翻譯終止密碼子。以40～80bp的跨度，在基因的全部長度中均一地引入總共34個單一限制性位點。在基因的上游行成HindIII和XbaI限制性位點，在基因的下游形成BamHI和SacI以輔助其克隆。使用之間長度為10～16個堿基的缺口，將該基因分為50個重疊的寡聚核苷酸(長48～50個核苷酸)。每個寡聚核苷酸與互補鏈上直接相鄰的寡聚核苷酸具有長度為13～18個核苷酸的重疊。互補重疊被設計為將Tm值保持在48～50℃之間。寡聚核苷酸是在DNA合成儀(Gene Assembler Special，Pharmacia，瑞典)以200納摩的規模合成的，并在變性尿素-PAGE上被純化。所有的50個寡聚核苷酸被連接為1.67kb的雙鏈DNA，即這里所述的嵌合G蛋白基因，其根據Singh等人(1996)的無連接基因合成方法，如圖3所表示的。使用HindIII和SacI限制性酶消化該DNA，并克隆在pBluescriptII SK(+)(Stratagene，La Jolla，CA)中。將該質粒命名為pSA17(圖3)。通過在自動DNA測序系統(Applied Biosystems Model 377A)對所克隆的合成DNA測序以確認所合成DNA的核苷酸序列。
構建一種框，以在大腸桿菌(E.coli)中在T7lac啟動子的控制下表達經過修飾的基因。分別設計適當的引物組以擴增編碼成熟G蛋白的DNA(1545bp)并形成NdeI和BamHI限制性位點。擴增質粒pSA17；使用限制性酶NdeI和BamHI對DNA進行消化，并克隆在表達載體pET-19b(Novagen，Madison WI)中。該質粒被命名為pSA33(圖4)。使用構建pSA33轉化大腸桿菌(E.coli)BL21DE3株。通過引入適當濃度的IPTG(1mM)表達重組的蛋白質。在37℃下進行該表達不同的時間。使用SDS PAGE上樣緩沖液(loadingbuffer)將大腸桿菌(E.coli)細胞裂解，并在10％的變性聚丙烯酰胺凝膠上進行分析。大腸桿菌(E.coli)DE3 BL21(pSA33)表達具有期望分子大小(即60.65kDa)的重組蛋白質，這與使用網站http://www.cbio.psu.edu通過蛋白質分子分析程序確定的被修飾基因的蛋白質分子量相當。這確認了G蛋白的合成基因被正確開發。
這里來所使用的，參考“嵌合G蛋白”的意思是PR-S信號肽、組氨酸標記、因子Xa的切割位點、標記內質網保持信號的成熟G蛋白，其顯示了在小鼠中對活病毒挑戰的高免疫保護活性。
本領域技術人員能夠使用任何其它適當的植物、動物、病毒、昆蟲、微生物信號肽來表達嵌合G蛋白。可以在各自的系統中表達這類蛋白質。關鍵的，包括組氨酸標記和因子Xa的切割位點以輔助從植物葉子提取物中純化嵌合G蛋白。這對于免疫保護不是關鍵的，并且能夠被其它的可替換策略所替代以輔助蛋白質純化。在純化之后，這類分子可以用作控制寵物、野生生物和人類中狂犬病的亞單位疫苗。同樣的，可以提供這類亞蛋白疫苗，或者與DNA疫苗和/或滅活病毒的結合。這類嵌合蛋白質也可以用作口服疫苗。
根據本發明的目標，所述基因和嵌合G蛋白是有用的，并且不僅包括在植物中表達的長度為547個氨基酸的蛋白質，還包括其部分序列、變體和突變體，其具有成熟G蛋白特別是這里所舉例的高免疫保護活性。這里所使用的，基因的“變體”和“變化”是指核苷酸序列，其編碼相同的嵌合蛋白質，或者其編碼就免疫反應和免疫保護而言在小鼠和其它動物中具有較低或者等價生物活性的嵌合蛋白。在一些氨基酸的少量變化、增加、缺失或可接受的取代能夠提供等價效率的狂犬病疫苗。這里所使用的，術語“等價生物活性”是指嵌合蛋白質，其在診斷、治療和預防的應用中具有相似或者基本相同的免疫生物或者免疫保護活性。
參考SEQ ID No1，許多其變體被認為是功能上有活性的，因為它們可以導致從一個氨基酸變化為另一個相近關聯的氨基酸。這樣的替代通常不導致任何蛋白質活性的影響。相似的，幾個氨基酸的缺失或者增加可能不導致蛋白質功能的顯著影響。表2中提供了通常不影響蛋白質功能的氨基酸替代的例子。這樣的替代將幾乎沒有或者沒有影響，特別是如果這些是在氨基酸序列中不參與蛋白質“功能”或“活性位點”的位置。
表No.2表示蛋白質中可以接受的氨基酸替代的矩陣。沿著排和列提供了氨基酸的單個字母密碼
矩陣中正數表示所提供的替代是可以接受的。負數表示是不可以接受的。例如，半胱氨酸(C)只能被其自身替代(評分＝12)，而不能被任何其它的氨基酸所替代(所有的評分都是負的，例如半胱氨酸變為甘氨酸G為-3，因此是不能被接受的)。另一方面，甘氨酸(G)能夠被其自身所替代(評分5)，同時也可以被絲氨酸-S(評分1)，丙氨酸-A(評分1)和天冬氨酸-D(評分1)所替代。正值的程度暗示替代能夠成功的可靠程度(Dayhoff，M.O.，Schwartz，R.M.，Orcutt，B.C.1978.“A model of evolutionary change in proteins.”In“Atlasof Protein Sequence and Structure”5(3)M.O.Dayhoff(ed.)，345-352.NationalBiomedical Research Foundation，Washington.
參考SEQ ID No2以及在SEQ ID No3～54的相應引物，一些DNA序列的變體將不會造成核酸功能的變化。例如，表3給出了編碼相同氨基酸的密碼子列表。這類密碼子在基因中可以被另外的所替代，而對基因所編碼的蛋白質序列沒有任何影響。
表No.3DNA序列中可以接受的密碼子的替代
參考文獻任何遺傳學或者分子生物學的教科書，例如J.D.Watson等人的“Molecular Biology of the Gene”。
制造編碼相同或者基本相同的蛋白質的替代DNA序列是本領域技術人員熟知的。這些變體DNA序列是在本發明的主題范圍內。這里所使用的，引用“基本相同”的序列是指具有氨基酸替代、缺失、增加或者插入，但不實質影響免疫保護活性的序列。保持免疫保護活性的片段也被包括在這個定義之內。
這里已經具體舉例了本發明主題的新型嵌合G蛋白。應該容易清楚的是本發明的主題包括具有與在植物或者植物細胞中所表達的舉例的嵌合蛋白質相同或者相似免疫保護活性的變體或者等價蛋白質(以及編碼等價蛋白質的核苷酸序列)。等價蛋白質與所舉例的蛋白質具有氨基酸的同源性。通常這種氨基酸同源性將高于75％，優選高于90％，最優選高于95％。在嵌合蛋白質的關鍵區域(抗原決定簇)，這種氨基酸同源性將是最高的，該區域負責免疫保護活性，或者參與三維構象的確定，其最終負責其生物活性。在這點上，某些氨基酸替代是可以接受的并且是可以被期待的，如果這些替代是在生物活性方面不重要的區域，或者是保守的氨基酸替代的區域，這將不影響分子的三維構象。例如，氨基酸可以被分為以下類非極性、不帶電極性、堿性和酸性。通過將一個類別的氨基酸替換為相同類別的氨基酸的保守替代將落在本發明主題的范圍內，只要所述替代不實質改變狂犬病G蛋白的生物學活性。表4提供了屬于這些類別氨基酸的例子的列表。
表4
在某些情況中，也可以制造非保守替代。關鍵的因素是這些替代不能顯著降低該嵌合蛋白的生物學活性。蛋白質工程領域的技術人員熟知在許多位置進行將嵌合G蛋白的氨基酸替代為丙氨酸，因為這通常不改變蛋白質的構象。這樣的替代也在本發明的范圍內。
可以將本發明主題的編碼嵌合G蛋白的基因引入寬范圍的植物病毒載體，嵌合基因的表達導致細胞內的生產，并維持免疫保護蛋白質。這類病毒可以用作產生和純化嵌合G蛋白的體系。適當的病毒寄主是桿狀病毒(Badnavirus)、花椰菜花葉病毒、SbCMV樣病毒、CsVMV樣病毒、RTBV樣病毒、牽牛花葉脈透明樣病毒、玉米線條病毒(Mastrevirus)、甜菜曲頂病毒(Curtovirus)、菜豆金黃花葉病毒(Begomovirus)、苜蓿花葉病毒(Alfamovirus)或者Ilarivirus(Koprowski等人，2000美國專利6,042,832和2002美國專利6448070)、Cumovirus、線形病毒組、Crnivirus、豇豆花葉病毒、蠶豆病毒(Fabavirus)、Nepovirus、馬鈴薯Y病毒(Potyvirus)、黑麥草花葉病毒、大麥黃花葉病毒、伴生病毒、矮化病毒(Waikavirus)、香石竹斑駁病毒(Carmovirus)、香石竹病毒(Dianthovirus)、玉米褪綠斑駁病毒、壞死病毒、番茄叢矮病毒、毛狀病毒、隱潛病毒、耳突花葉病毒、真菌傳桿狀病毒、大麥病毒、懸鉤子病毒、黃矮病毒、玉米細線病毒屬、馬鈴薯X病毒(Potexvirus)、南方菜豆花葉病毒、纖細病毒、煙草花葉病毒、煙草脆裂病毒、發狀病毒、蕪菁黃化病毒、幽影病毒、細胞質彈狀病毒、細胞核彈狀病毒、番茄斑萎病毒、α隱潛病毒、β-隱潛病毒屬、斐濟病毒、植物呼腸孤病毒、水稻病毒以開發嵌合G蛋白的生產系統。構建植物轉化載體以開發轉基因植物。使用HindIII消化質粒pPK201(其具有帶雙增強子的CaMV35S啟動子)以切出帶雙增強子的CaMV35S啟動子。使用HindIII和SacI對質粒pSA17進行限制性消化以切除嵌合基因(圖3)。進行三體連接以將上述兩個片段克隆在pBI 101雙向載體中(New EnglandBiolabs)。所得到的質粒即pSA5(圖5)在嵌合基因的上游具有帶雙增強子的CaMV35S啟動子，在嵌合基因的下游具有nos轉錄終止子。通過PstI限制性酶的消化對帶有雙增強子的啟動子CaMV35S到嵌合基因的正確方向進行檢查。nos轉錄終止子被克隆在嵌合基因的下游。表達框由被克隆在Ti雙向載體中的具有帶雙增強子的啟動子CaMV35S的合成基因構成。帶雙增強子的啟動子CaMV35S的HindIII-HindIII片段被從克隆pPK201切出，嵌合G蛋白的HindIII-SacI片段被從克隆pSA17切除，并將兩個片段在HindIII-SacI位點進行三體連接到Ti雙向載體pBI101，其替換了質粒的HindIII-SacI(uidA基因)片斷。該雙向載體被命名為pSA5。為了研究該嵌合G蛋白在植物中的效率，選擇煙草進行表達。根據Cangelosi等人(1991)所討論的修改的“農桿菌Agrobacteriu電穿孔”方案，使用雙向pSA5轉化農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)株LBA4404(pAL4404)，并在抗生素鏈霉素、利福平和卡那霉素上選擇被轉到的菌落。根據Horsch等人，1985的方法，進行農桿菌(Agrobacterium)介導的煙草(Nicotiana tabacum cv.Patit Havana)轉化，并在抗生素卡那霉素上選擇轉基因植物。使用PCR和Southern分析確認編碼嵌合G蛋白的基因的存在，使用RT-PCR確認轉基因的表達，并通過利用ABIPRISM 7700 Sequence Detection System(Applied Biosystem)、Western分析和ELISA通過實時PCR分析轉錄子水平。Western分析顯示嵌合蛋白質的表達占所選擇轉基因系中全部可溶性葉子蛋白質的0.2％。在該項研究中所得到的這樣高水平的表達與前面所提到的McGarvey等人(1995)的報道相反。這是設計新型合成基因的結果，其中許多涉及達到植物中高表達水平的方面是被獨有地使用。在本項研究中所使用的植物優選的翻譯起始環境、密碼子、基因序列、信號序列等已經在達到增強植物葉子中的表達方面發揮重要的作用。在這個方面，本發明的基因和構建是新型的。
通過說明的方式提供下面的實施例，因此不應當被認為限制本發明的范圍。
實施例1在大腸桿菌(Escherichia coli)中表達嵌合基因編碼長度為547個氨基酸殘基的嵌合G蛋白的基因，這里被稱作嵌合G蛋白是根據策略設計的(SEQ ID NO.1)。將G蛋白的原始多肽區(位點1～19)替換為煙草的信號肽PR-S(位點1～26)。之后，將六肽的組氨酸氨基酸殘基和含有氨基酸殘基IEGR的四肽以其順序包括在該基因的N-末端。在編碼G蛋白的序列之后，將編碼SEKDEL以將嵌合G蛋白保持在內質網的六肽的序列包括在該嵌合基因的C-末端(SEQ ID NO.1)。根據理論設計1.67kb的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)以編碼上述所提到的嵌合G蛋白。在該設計的基因中形成許多6堿基的切割子(cutter)限制性酶位點。在所設計的基因的5’末端形成HindIII和SalI限制性位點，在其3’末端形成SacI。將該基因分為50個重疊的寡聚核苷酸(長40～58個核苷酸)。每個寡聚核苷酸與互補鏈上直接相鄰的寡聚核苷酸具有長度為13～18個核苷酸的重疊(Tm在48～50℃之間)。寡聚核苷酸是在DNA合成儀(Gene Assembler Special，Pharmacia，Sweden)以200納摩的規模合成的，并在變性尿素-PAGE上被純化。所有的50個寡聚核苷酸被連接為雙鏈DNA，即這里所述的嵌合G基因，其根據Singh等人(1996)的無連接基因合成方法。使用HindIII和SacI限制性酶消化該DNA，并克隆在pBluescriptII SK(+)(Stratagene)中。將該質粒命名為pSA17(圖3中所示)。通過在自動DNA測序系統(Applied Biosystems Model 377A)對所克隆的合成DNA進行測序確認所合成DNA的核苷酸序列。在本研究中所設計的合成基因的核苷酸序列是新型的，并且與之前所報道的基因序列有實質性的區別。
構建一種框，以在大腸桿菌(E.coli)中在T7lac啟動子的控制下表達嵌合毒素。為了這個目的，通過兩個引物擴增質粒pSA17，并在擴增子的上游和下游形成NdeI和BamHI位點，并克隆在表達載體pET-19b(Novagen)中的相同位點中。該質粒被命名為pSA33(圖4中所示)。DNA編碼成熟嵌合G蛋白，其帶有因子Xa的切割位點，以及載體編碼的長度為10個組氨酸殘基的標記，接著是在嵌合G蛋白上游的腸激酶位點。使用構建pSA33轉化大腸桿菌(E.coli)BL21DE3株。通過引入IPTG表達嵌合G蛋白。
在37℃下進行該表達不同的時間。在SDS PAGE上樣緩沖液(loadingbuffer)中將大腸桿菌(E.coli)細胞裂解，并在10％的變性膠上進行分析。SDS PAGE的結果和Western的結果顯示大腸桿菌(E.coli)表達具有期望分子大小60.65kDa的重組蛋白質，這與使用網站http://www.cbio.psu.edu通過蛋白質分子分析程序確定的無糖基化修飾的蛋白質分子量相當，這確認了合成基因即嵌合G蛋白的基因被正確開發和表達。所設計的用于在大腸桿菌(E.coli)和植物中表達的嵌合G蛋白的氨基酸序列是新型的，并且與之前所報道的蛋白質序列有實質性的區別。
實施例2使用植物衍生的疫苗對BalbC小鼠進行免疫為了確立新型嵌合G蛋白在植物中的效率，構建了植物轉化載體以開發轉基因植物。使用HindIII消化質粒pPK201(其具有帶雙增強子的CaMV35S啟動子)以切出帶雙增強子的CaMV35S啟動子。根據在實施例1中所描述的，制備質粒pSA17，其含有克隆在BluescriptII SK+(Stratagene，La Jolla，CA)的HindIII-SacI的嵌合G蛋白。該嵌合基因依次由下列構成煙草PRS信號肽的26個氨基酸殘基，接著是6個組氨酸殘基，因子Xa切割位點的四個氨基酸殘基，成熟的ERA狂犬病糖蛋白的505個氨基酸殘基，以及在嵌合G蛋白基因的C’末端用于保持在內質網的6個氨基酸殘基(SEQ ID NO.1)。使用植物優選的密碼子根據理論設計1.67Kb的序列，以達到上述嵌合G蛋白的高水平表達。將新型的翻譯起始環境(TAAACAATGAAC)包括在5’末端，兩個終止密碼子TGA，TGA引入到該嵌合G蛋白閱讀框的末端。將該基因分成50個重疊的寡聚核苷酸，并根據Singh等人(1996)的無連接基因合成的方法連接成1.67kb的雙鏈DNA。在基因的上游形成HindIII和XbaI限制性位點，并在基因的下游形成BamHI和SacI位點以輔助克隆。將該嵌合G蛋白克隆在BluescriptII SK+的HindIII-SacI限制性位點，進行測序并命名為pSA17。使用HindIII和SacI對克隆pSA17進行消化，以切出1.67kb的片斷，其具有完成的嵌合G蛋白基因(SEQ ID NO.2)。進行三體連接以克隆兩個片斷，即克隆pPK201的HindIII片斷(其具有帶雙增強子的CaMV35S啟動子)，以及具有嵌合基因的HindIII-SacI片斷。將所得到的克隆命名為pSA17。將上述兩個片斷在HindIII-SacI三體連接到pBI101，替換(-葡糖苷酸酶框。植物表達框在嵌合基因的上游具有帶雙增強子的CaMV35S啟動子，以及在嵌合基因的下游具有260bp的片斷，其含有來自胭脂氨酸合成酶基因(Nos-ter)轉錄終止子的多聚腺酸化信號。該表達框具有在Nos啟動子控制下的卡納霉素抗性的NPTII基因。通過限制性分析對帶有雙增強子的CaMV35S的正確方向進行確認。將克隆在pBI101Ti雙向載體HindIII-SacI具有正確的E-35S到嵌合G蛋白方向的表達框(具有E-35S啟動子的合成嵌合G蛋白基因)命名為pSA5(如圖5所示)。該構建具有多聚核苷酸序列TAAACAATGAAC作為植物優選的翻譯起始環境。在合成基因中引入兩個終止密碼子TGA，TGA用于翻譯的終止。根據Cangelosi等人(1991)所討論的修改的“農桿菌Agrobacteriu電穿孔”方案，使用雙向pSA5轉化農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)株LBA4404(pAL4404)，并在抗生素鏈霉素、利福平和卡那霉素上選擇被轉到的菌落。根據Horsch等人，1985的方法，進行農桿菌(Agrobacterium)介導的煙草(Nicotiana tabacum cv.Patit Havana)轉化，并在抗生素卡那霉素上選擇轉基因植物。使用PCR和Southern分析確認編碼嵌合G蛋白的基因的存在，使用RT-PCR、實時PCR、Western分析和ELISA確認轉基因的表達。Western結果顯示毒素蛋白的表達占所選擇用于這些實驗的轉基因系中可溶性葉子蛋白質的0.2％。這樣高水平的表達使基因的新設計具體化，其中我們選擇的植物優選密碼子、優選翻譯起始環境、內質網保持信號，以及我們設計的其他特征在表達方面發揮了重要作用。嵌合G蛋白被部分從高水平表達合成基因的煙草植物的葉子純化。將100gm煙草的新鮮葉子在液氮中進行清洗、冷凍，使用研缽進行磨碎并搗碎，在Polytron混合儀中在冰冷的提取緩沖液{100mMTris-HCl pH8.0、150Mm NaCl、150mM山梨醇、2mM DTT、0.1％deica、1mMPMSF、0.1％亮抑酶肽、2％聚乙烯聚吡咯烷酮、0.05％植物蛋白酶抑制劑混合物(sigma)}中進行勻漿。在3ml/gm提取緩沖液中對葉組織進行勻漿。在勻漿之后，通過一層尼龍網將混合物進行過濾，并在4℃下1800xg離心5分鐘。在4℃下在38000xg下將上清離心1小時。分離上清，并在冰上將沉淀溶解在緩沖液中1小時，并在4℃下38000xg離心1小時，其中該緩沖葉含有50mMTris pH8.0、2Mm DTT、2.5％甘油、1Mm PMSF、0.05％PPIC(植物蛋白酶抑制劑混合物)、1％脫氧膽酸鈉。將上清上樣到離子交換柱瓊脂糖(SepharoseQ)快流速(fast flow)，使用低鹽緩沖液(50mM tris pH8、0.1％triton X100、0.1％BME)對柱子進行清洗，通過NaCl的線性梯度對所結合的蛋白質進行洗脫。收集ELISA陽性部分，并上樣在抗體親和柱上{連接到CNBr活化的Sepharose4B的抗狂犬病人IgG(Pharmacia Biotech)}。收集ELISA陽性部分，并通過采用BSA作為標準的Bradford染色(Biorad)對蛋白質進行定量，并通過Western使用抗狂犬病馬IgG抗體檢測蛋白質的大小。在每組中，通過注射25(g每種膜蛋白對Balb C小鼠進行接觸抗原，以及商業上可以獲得的被殺死的狂犬病毒疫苗(作為正對照)即Aventis Pharma Ltd.所制備的Rabipur，以及磷酸鹽緩沖液鹽水(作為陰性對照)。在第7天，第14天和第28天進行三次加強注射。在第二次和第3次加強之后7天，收集血清。通過ELISA檢測抗體效價(表5)，血清中抗體效價的結果被提供在表3中，并表示在圖6中。這些表明植物膜蛋白質顯示了在小鼠中高水平的免疫反應。與商業上可以獲得的被殺死的狂犬病毒疫苗相比，其免疫原高2～3倍。
表5
實施例3被免疫小鼠的免疫保護分析通過將富含G蛋白的植物膜部分注射入小鼠，并使用活狂犬病毒攻擊它，來研究植物衍生的G蛋白在免疫保護中的效率。經經腹膜對小鼠進行注射轉基因煙草葉的富含G蛋白的膜部分，商業上可以得到的被殺死的狂犬病毒疫苗(Aventis Pharma Ltd.的Rabipur作為陽性對照)和磷酸緩沖液鹽水(作為陰性對照)。如實施例2所描述的，在第7天，第14天和第28天進行三次加強注射。在每個階段，注射總共25μg蛋白質。第3次加強之后，使用10xLD50的活狂犬病毒通過經腹膜進行攻擊小鼠，并觀察綜合癥的出現。在攻擊的第13天之后，記錄下所得到的攻擊，并表示在表6和圖7中。
表6
在攻擊實驗之后所得到的結果清楚地表明G蛋白定位在植物細胞膜，其引起了高水平的免疫反應，并且是高度免疫保護的。
優點本發明的主要優點是1.本發明提供了與滅活的病毒相比非常安全的疫苗用于控制人類、寵物和野生生物中的狂犬病。
2.其不需要對活病原病毒進行操作，沒有疫苗回復成具有感染性的病毒顆粒的風險。
3.狂犬病G蛋白被根據理論設計為在新型寄主中以高水平表達，所述寄主包括轉基因植物和植物細胞系、如大腸桿菌和酵母的微生物、動物和動物細胞系重組動物和植物病毒。這樣，不需要操作病原病毒，因為這種免疫原抗原能夠被在新型寄主細胞中表達。
4.具體的，嵌合G蛋白被特別設計為在植物細胞中高水平表達。具有適當信號肽的G蛋白被制成在植物細胞的膜上積聚。可以使用相似的信號以在特異性的區室內積聚。靶蛋白在特異的細胞器例如膜上的富集能夠開發較便宜和常規的方法以大規模地在動物細胞系和酵母中制備靶蛋白。
5.在N-末端設計六組氨酸標記用于進一步輔助在固定的金屬親和柱上純化嵌合蛋白。由于針對組氨酸標記的單特異性抗體是商業上可以獲得的，因此該組氨酸標記也可以用于在各種純化的階段鑒定并標記的嵌合蛋白質。因子Xa切割位點被包括在組氨酸標記的下游，用于如果該標記不是治療應用中所期望，在純化后將其切除。
6.SEKDEL保持信號被設計在C-末端，其增強嵌合G蛋白在細胞的內質網中的積聚。異源蛋白在內質網中的區室化能夠增強它們的穩定性和整體的積聚。這使得純化過程更簡單和有效。進一步，膜定位防止了靶蛋白被細胞溶質中所出現的蛋白質水解酶的影響。同時，膜定位能夠導致目標蛋白功能上重要的修飾。
7.與商業上可以獲得的滅活的狂犬病毒疫苗相比，嵌合G蛋白所引起的免疫反應要高數倍。被免疫的動物表現出了對活病毒攻擊的免疫保護作用。定位在煙草葉細胞膜中的G蛋白的高免疫反應反映了蛋白質的新型設計，因為它能夠使G蛋白采用免疫活性的構象。
8.采用用于控制狂犬病的從植物純化的嵌合G蛋白將是非常安全的，因為該疫苗制劑將不含類似HIV、禽痘、瘋牛病、朊病毒等的動物病原體。
9.如果嵌合G蛋白是被表達在類似葉子、谷粒等植物的可食用部分的話，其可以用作口服疫苗。之前，如果為實驗動物通過口服提供狂犬病毒，其將表現出免疫刺激/免疫保護。因此，在植物葉子中表達功能活性的狂犬病外殼G蛋白提供了開發廉價疫苗的機會，如果以種子、谷粒、植物存儲組織等形式進行轉運的話，其被認為是安全的，并且不需要冷鏈。
序列表<110>COUNCIL OF SCIENTIFIC AND INDUSTRIAL RESEARCH<120>A CHIMERIC G PROTEIN BASED RABIES VACCINE<130>FP 1937<140>1502/DEL/2004<141>2004-08-22<160>54<170>PATENTIN VERSION 3.3<210>1<211>547<212>PRT<213>狂犬病疫苗<400>1MET ASN PHE LEU LYS SER PHE PRO PHE TYR ALA PHE LEU CYS PHE GLY1 5 10 15GLN TYR PHE VAL ALA VAL THR HIS ALA ALA HIS HIS HIS HIS HIS HIS20 25 30ILE GLU GLY ARG LYS PHE PRO ILE TYR THR ILE LEU ASP LYS LEU GLY35 40 45PRO TRP SER PRO ILE ASP ILE HIS HIS LEU SER CYS PRO ASN ASN LEU50 55 60VAL VAL GLU ASP GLU GLY CYS THR ASN LEU SER GLY PHE SER TYR MET65 70 75 80GLU LEU LYS VAL GLY TYR ILE LEU ALA ILE LYS MET ASN GLY PHE THR85 90 95CYS THR GLY VAL VAL THR GLU ALA GLU ASN TYR THR ASN PHE VAL GLY100 105 110TYR VAL THR THR THR PHE LYS ARG LYS HIS PHE ARG PRO THR PRO ASP115 120 125ALA CYS ARG ALA ALA TYR ASN TRP LYS MET ALA GLY ASP PRO ARG TYR130 135 140
GLU GLU SER LEU HIS ASN PRO TYR PRO ASP TYR ARG TRP LEU ARG THR145 150 155 160VAL LYS THR THR LYS GLU SER LEU VAL ILE ILE SER PRO SER VAL ALA165 170 175ASP LEU ASP PRO TYR ASP ARG SER LEU HIS SER ARG VAL PHE PRO SER180 185 190GLY LYS CYS SER GLY VAL ALA VAL SER SER THR TYR CYS SER THR ASN195 200 205HIS ASP TYR THR ILE TRP MET PRO GLU ASN PRO ARG LEU GLY MET SER210 215 220CYS ASP ILE PHE THR ASN SER ARG GLY LYS ARG ALA SER LYS GLY SER225 230 235 240GLU THR CYS GLY PHE VAL ASP GLU ARG GLY LEU TYR LYS SER LEU LYS245 250 255GLY ALA CYS LYS LEU LYS LEU CYS GLY VAL LEU GLY LEU ARG LEU MET260 265 270ASP GLY THR TRP VAL ALA MET GLN THR SER ASN GLU THR LYS TRP CYS275 280 285PRO PRO ASP GLN LEU VAL ASN LEU HIS ASP PHE ARG SER ASP GLU ILE290 295 300GLU HIS LEU VAL VAL GLU GLU LEU VAL ARG LYS ARG GLU GLU CYS LEU305 310 315 320ASP ALA LEU GLU SER ILE MET THR THR LYS SER VAL SER PHE ARG ARG325 330 335LEU SER HIS LEU ARG LYS LEU VAL PRO GLY PHE GLY LYS ALA TYR THR340 345 350ILE PHE ASN LYS THR LEU MET GLU ALA ASP ALA HIS TYR LYS SER VAL
355 360 365ARG THR TRP ASN GLU ILE LEU PRO SER LYS GLY CYS LEU ARG VAL GLY370 375 380GLY ARG CYS HIS PRO HIS VAL ASN GLY VAL PHE PHE ASN GLY ILE ILE385 390 395 400LEU GLY PRO ASP GLY ASN VAL LEU ILE PRO GLU MET GLN SER SER LEU405 410 415LEU GLN GLN HIS MET GLU LEU LEU GLU SER SER VAL ILE PRO LEU VAL420 425 430HIS PRO LEU ALA ASP PRO SER THR VAL PHE LYS ASP GLY ASP GLU ALA435 440 445GLU ASP PHE VAL GLU VAL HIS LEU PRO ASP VAL HIS ASN GLN VAL SER450 455 460GLY VAL ASP LEU GLY LEU PRO ASN TRP GLY LYS TYR VAL LEU LEU SER465 470 475 480ALA GLY ALA LEU THR ALA LEU MET LEU ILE ILE PHE LEU MET THR CYS485 490 495CYS ARG ARG VAL ASN ARG SER GLU PRO THR GLN HIS ASN LEU ARG GLY500 505 510THR GLY ARG GLU VAL SER VAL THR PRO GLN SER GLY LYS ILE ILE SER515 520 525SER TRP GLU SER HIS LYS SER GLY GLY GLU THR ARG LEU SER GLU LYS530 535 540ASP GLU LEU545<210>2<211>1647<212>DNA<213>合成的DNA
<400>2ATGAACTTCC TCAAGTCCTT CCCATTCTAC GCATTCCTTT GCTTCGGACA ATACTTTGTT 60GCTGTGACTC ATGCTGCACA CCACCATCAC CACCATATCG AGGGCAGGAA GTTCCCTATC 120TACACTATCC TCGACAAGTT GGGCCCTTGG TCCCCTATCG ACATCCATCA TCTCAGCTGC 180CCTAACAATT TGGTTGTCGA GGACGAGGGC TGCACAAACT TGTCTGGATT CAGCTACATG 240GAGCTTAAGG TTGGCTACAT CCTCGCTATC AAGATGAACG GTTTTACTTG CACAGGCGTC 300GTTACTGAGG CCGAGAACTA CACCAACTTC GTGGGTTACG TTACTACCAC TTTCAAGAGG 360AAGCACTTCC GGCCGACTCC AGACGCATGC CGCGCTGCCT ACAACTGGAA GATGGCTGGT 420GACCCACGTT ACGAGGAGAG TCTACACAAC CCATACCCTG ACTACAGATG GTTACGTACC 480GTCAAGACTA CTAAGGAGTC CCTCGTCATC ATTTCCCCAT CCGTGGCCGA TCTCGATCCA 540TACGATAGGT CCTTACATTC TAGGGTTTTC CCATCCGGTA AGTGCTCCGG CGTGGCTGTC 600TCCTCCACTT ACTGCTCCAC CAACCATGAC TACACTATCT GGATGCCTGA GAACCCTAGG 660TTGGGTATGT CCTGCGATAT CTTCACTAAC TCGCGAGGTA AGAGGGCCAG CAAGGGTTCC 720GAGACCTGCG GTTTCGTCGA TGAGAGAGGT TTGTACAAGT CCCTCAAGGG CGCCTGCAAG 780CTCAAGTTGT GCGGTGTCCT CGGTCTTAGG TTGATGGACG GTACCTGGGT CGCTATGCAA 840ACTAGTAACG AGACTAAGTG GTGCCCACCA GACCAATTGG TCAACCTCCA CGACTTCCGG 900TCCGACGAGA TCGAGCACTT GGTCGTGGAG GAACTCGTTA GGAAGAGGGA GGAATGCTTG 960GATGCTCTCG AGTCCATTAT GACTACTAAG TCCGTCTCTT TCAGAAGGCT CAGCCATCTC1020AGGAAGTTGG TTCCAGGTTT CGGCAAGGCC TATACCATTT TCAACAAGAC TTTGATGGAG1080GCTGACGCTC ACTACAAGTC CGTCCGGACC TGGAACGAGA TCCTCCCATC CAAGGGCTGC1140CTTAGGGTTG GCGGCCGCTG CCATCCACAC GTTAACGGTG TCTTTTTCAA CGGCATTATC1200CTCGGCCCCG ACGGCAACGT TTTGATCCCA GAGATGCAGT CCTCCCTCTT GCAGCAGCAC1260ATGGAGTTGC TCGAAAGCTC TGTTATCCCA TTGGTCCATC CATTGGCTGA CCCTTCCACT1320GTCTTCAAGG ATGGCGACGA GGCCGAGGAC TTCGTGGAGG TGCATTTGCC AGACGTTCAC1380AACCAGGTTT CCGGAGTGGA CCTCGGTCTC CCAAACTGGG GTAAGTACGT CTTGCTCTCC1440GCAGGCGCGC TCACTGCCTT GATGTTGATC ATCTTCCTCA TGACTTGCTG CAGAAGGGTC1500AACAGGTCCG AGCCAACTCA GCATAACTTG AGGGGCACCG GTAGGGAGGT CTCCGTTACT1560CCACAGTCCG GAAAGATTAT ATCCTCTTGG GAGTCCCATA AGTCCGGAGG CGAGACGCGT1620
TTGTCCGAGA AGGATGAGTT GTGATGA 1647<210>3<211>41<212>DNA<213>引物<400>3CCAAGCTTTC TAGATAAACA ATGAACTTCC TCAAGTCATT C41<210>4<211>34<212>DNA<213>引物<400>4TCCTTTGCTT CGGACAATAC TTTGTTGCTG TGAC34<210>5<211>40<212>DNA<213>引物<400>5CCATCACCAC CATATCGAGG GAAGGAAGTT CCCTATCTAC 40<210>6<211>48<212>DNA<213>引物<400>6CTCGACAAGT TGGGCCCTTG GTCCCCTATC GACATCCATC ATCTCAGC 48<210>7<211>49<212>DNA<213>引物<400>7GTCGAGGACG AGGGCTGCAC AAACTTGTCT GGATTCAGCT ACATGGAGC49<210>8<211>48<212>DNA<213>引物<400>8CATCCTCGCT ATCAAGATGA ACGGTTTTAC TTGCACAGGC GTCGTTAC 48
<210>9<211>48<212>DNA<213>引物<400>9CCAACTTCGT GGGTTACGTT ACTACCACTT TCAAGAGGAA GCACTTCC 48<210>10<211>47<212>DNA<213>引物<400>10CCGCGCTGCC TACAACTGGA AGATGGCTGG TGACCCACGT TACGAGG47<210>11<211>47<212>DNA<213>引物<400>11TACCCTGACT ACAGATGGTT ACGTACCGTC AAGACTACTA AGGAGTC47<210>12<211>65<212>DNA<213>引物<400>12ATCCGTGGCC GATCTCGATC CATACTCCTC AGGGAGCAGT AGTAAAGGGG TAGGCACCGG 60CTAGG 65<210>13<211>50<212>DNA<213>引物<400>13CTCCGGCGTG GCTGTCTCCT CCACTTACTG CTCCACCAAC CATGACTACA 50<210>14<211>48<212>DNA<213>引物<400>14
GAACCCTAGG TTGGGTATGT CCTGCGATAT CTTCACTAAC TCGCGAGG 48<210>15<211>49<212>DNA<213>引物<400>15TTCCGAGACC TGCGGTTTCG TCGATGAGAG AGGTTTGTAC AAGTCCCTC 49<210>16<211>48<212>DNA<213>引物<400>16CAAGTTGTGC GGTGTCCTCG GTCTTAGGTT GATGGACGGT ACCTGGGT 48<210>17<211>58<212>DNA<213>引物<400>17AGACTAAGTG GTGCCCACCA GACCAATTGG TCAACCTCCA CGACTTCCGG TCCGACGA58<210>18<211>46<212>DNA<213>引物<400>18TGGTCGTGGA GGAACTCGTT AGGAAGAGGG AGGAATGCTT GGATGC 46<210>19<211>46<212>DNA<213>引物<400>19GACTACTAAG TCCGTCTCTT TCAGAAGGCT CAGCCATCTC AGGAAG 46<210>20<211>47<212>DNA<213>引物<400>20GGCCTATACC ATTTTCAACA AGACTTTGAT GGAGGCTGAC GCTCACT47
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TGAGCGCGCC TGCGGAGAGC AAGACGTACT TACCCCAGTT TGGGAGA47<210>33<211>49<212>DNA<213>引物<400>33AACCTGGTTG TGAACGTCTG GCAAATGCAC CTCCACGAAG TCCTCGGCC 49<210>34<211>48<212>DNA<213>引物<400>34AGACAGTGGA AGGGTCAGCC AATGGATGGA CCAATGGGAT AACAGAGC 48<210>35<211>47<212>DNA<213>引物<400>35CTGCTGCAAG AGGGAGGACT GCATCTCTGG GATCAAAACG TTGCCGT47<210>36<211>51<212>DNA<213>引物<400>36ATGCCGTTGA AAAAGACACC GTTAACGTGT GGATGGCAGC GGCCGCCAAC C 51<210>37<211>47<212>DNA<213>引物<400>37GGAGGATCTC GTTCCAGGTC CGGACGGACT TGTAGTGAGC GTCAGCC47<210>38<211>50<212>DNA<213>引物<400>38GAAAATGGTA TAGGCCTTGC CGAAACCTGG AACCAACTTC CTGAGATGGC 50
<210>39<211>50<212>DNA<213>引物<400>39GACGGACTTA GTAGTCATAA TGGACTCGAG AGCATCCAAG CATTCCTCCC 50<210>40<211>58<212>DNA<213>引物<400>40TTCCTCCACG ACCAAGTGCT CGATCTCGTC GGACCGGAAG TCGTGGAGGT TGACCAAT58<210>41<211>47<212>DNA<213>引物<400>41CACCACTTAG TCTCGTTACT AGTTTGCATA GCGACCCAGG TACCGTC47<210>42<211>49<212>DNA<213>引物<400>42GACACCGCAC AACTTGAGCT TGCAGGCGCC CTTGAGGGAC TTGTACAAA 49<210>43<211>47<212>DNA<213>引物<400>43GCAGGTCTCG GAACCCTTGC TGGCCCTCTT ACCTCGCGAG TTAGTGA47<210>44<211>49<212>DNA<213>引物<400>44ACCCAACCTA GGGTTCTCAG GCATCCAGAT AGTGTAGTCA TGGTTGGTG 49
<210>45<211>50<212>DNA<213>引物<400>45CAGCCACGCC GGAGCACTTA CCGGATGGGA AAACCCTAGA ATGTAAGGAC 50<210>46<211>46<212>DNA<213>引物<400>46GATCGGCCAC GGATGGGGAA ATGATGACGA GGGACTCCTT AGTAGT 46<210>47<211>48<212>DNA<213>引物<400>47CATCTGTAGT CAGGGTATGG GTTGTGTAGA CTCTCCTCGT AACGTGGG 48<210>48<211>48<212>DNA<213>引物<400>48GTAGGCAGCG CGGCATGCGT CTGGAGTCGG CCGGAAGTGC TTCCTCTT 48<210>49<211>53<212>DNA<213>引物<400>49AACGTAACCC ACGAAGTTGG TGTAGTTCTC GGCCTCAGTA ACGACGCCTG TGC 53<210>50<211>45<212>DNA<213>引物
<400>50TTGATAGCGA GGATGTAGCC AACCTTAAGC TCCATGTAGC TGAAT 45<210>51<211>49<212>DNA<213>引物<400>51CCCTCGTCCT CGACAACCAA ATTGTTAGGG CAGCTGAGAT GATGGATGT 49<210>52<211>44<212>DNA<213>引物<400>52CCAAGGGCCC AACTTGTCGA GGATAGTGTA GATAGGGAAC TTCC 44<210>53<211>45<212>DNA<213>引物<400>53ATATGGTGGT GATGGTGGTG TGCAGCATGA GTCACAGCAA CAAAG 45<210>54<211>40<212>DNA<213>引物<400>54GCAAAGGAAT GCGTAGAATG GGAATGACTT GAGGAAGTTC40
權利要求
1.一種重組嵌合G蛋白，其具有SEQ ID No 1的序列和其部分或其變體。
2.根據權利要求1所述的重組嵌合G蛋白，其中蛋白質的長度包括547個氨基酸或其部分或其變體。
3.根據權利要求1所述的重組嵌合G蛋白，其中所述蛋白質包括在N-末端在1～26位的PR-S信號肽的氨基酸殘基，接著是在27～32位六個六組氨酸標簽的殘基，在33～36位的因子Xa蛋白質水解切割位點的四肽氨基酸殘基，在37～541位的狂犬病毒ERA株的成熟糖蛋白G的氨基酸殘基，542～547位是將嵌合G蛋白保持在內質網的位于嵌合蛋白的C末端的長度六個氨基酸的殘基。
4.一種重組嵌合G蛋白基狂犬病疫苗，其具有SEQ ID No 1的序列和其部分或其變體。
5.根據權利要求4所述的狂犬病疫苗，其中蛋白質的長度包括547個氨基酸或其部分或其變體。
6.根據權利要求4所述的疫苗，其中所述疫苗蛋白質包括在N-末端在1～26位的PR-S信號肽的氨基酸殘基，接著是在27～32位六個六組氨酸標簽的殘基，在33～36位的因子Xa蛋白質水解切割位點的四肽氨基酸殘基，在37～541位的狂犬病毒ERA株的成熟糖蛋白G的氨基酸殘基，542～547位是將嵌合G蛋白保持在內質網的位于嵌合蛋白的C末端的長度六個氨基酸的殘基。
7.根據權利要求4所述的疫苗，其中重組嵌合G蛋白基因編碼針對活狂犬病毒具有免疫保護活性的蛋白質。
8.根據權利要求4所述的疫苗，其中所述疫苗提供針對狂犬病毒的100％的免疫保護。
9.根據權利要求4所述的疫苗，其中所述疫苗控制人類、寵物和野生生物中的狂犬病。
10.SEQ ID No 2的嵌合基因，其編碼權利要求1中所述的嵌合G-蛋白。
11.根據權利要求10所述的嵌合基因，其中所述基因的長度為1.67kb。
12.一組SEQ ID No.3～54的52個引物，其用于合成權利要求10中所述的SEQ ID 2的嵌合基因。
13.一種在植物中大規模產生嵌合G蛋白基狂犬病疫苗的方法，其通過表達新型的嵌合基因SEQ ID No 2以控制狂犬病，其中所述方法包括步驟a.使用編碼SEQ ID No.1和其部分或其變體的嵌合G蛋白的SEQ ID No.2的DNA分子轉化植物，其在該DNA被表達，并且該嵌合G蛋白被生產并被定位于植物內質網內的條件下，以及b.分離和純化嵌合G蛋白以對適當的對象進行免疫。
14.根據權利要求13所述的方法，其中所述的商業上可以獲得的狂犬病毒株是選自由ERA株和CVS株所組成的組。
15.根據權利要求13所述的方法，其中所述蛋白質的長度是547個氨基酸。
16.根據權利要求13所述的方法，其中PR-S信號肽被其他相當的信號肽例如PR-1或者任何其它信號肽所替代，這依賴于植物表達系統，以將蛋白質轉運至內質網。
17.根據權利要求13所述的方法，其中六個組氨酸殘基可以被從由具有與基質的親和力的纖維素結合結構域、鏈霉親和素瓊脂糖結合結構域、谷胱甘肽-S-轉移酶融合等所組成組中選擇的任何其它肽所替代，以用于純化。
18.根據權利要求13所述的方法，其中用于切割的四個氨基酸殘基可以被從由牛腸激酶、凝血酶和因子Xa所組成組中選擇的任何內切蛋白質酶替代。
19.根據權利要求13所述的方法，其中相同類別的其他氨基酸殘基能夠替代SEQ ID No.1的蛋白質疫苗的氨基酸殘基。
20.根據權利要求13所述的方法，其中重組嵌合G蛋白基因編碼針對活狂犬病毒的具有免疫保護活性的蛋白質。
21.根據權利要求13所述的方法，其中所述疫苗控制人類、寵物和野生生物中的狂犬病。
22.根據權利要求13所述的方法，其中用于表達重組G蛋白基因的植物選自由煙草、玉米、豆類、蔬菜和/或其它植物和選自任何藻類的低級植物所組成的組，其中豆類如鷹嘴豆、木豆、落花生、大豆，蔬菜如番茄、馬鈴薯、甜瓜、西瓜、菠菜、花椰菜、甘藍、紅辣椒、辣椒、胡蘿卜。
23.根據權利要求13所述的方法，其中所述蛋白質與滅活的病毒相比免疫原高2～4倍。
24.根據權利要求13所述的方法，其中所述的疫苗表達是植物中總可溶性蛋白的大約0.2％。
25.一種對對象進行狂犬病疫苗接種的方法，其中所述方法包括為對象給藥藥物有效量的權利要求4中所述的重組嵌合G蛋白基因疫苗，其中所述疫苗在轉基因植物中被生產和表達，可選擇地同時為對象給藥藥物上可以接受的添加劑。
26.根據權利要求25所述的方法，其中所述對象為人類、寵物和野生生物。
27.根據權利要求25所述的方法，其中所述給藥是通過選自口服、經腹膜內給藥等的路線。
28.根據權利要求25所述的方法，其中所述重組嵌合G蛋白基因疫苗的濃度為從至少ng開始的范圍內。
29.根據權利要求25所述的方法，其中所述疫苗對于給藥是安全的。
30.根據權利要求25所述的方法，其中所述疫苗由于在種子、塊莖、根、葉和其他植物部分內，因此所述疫苗穩定多年。
31.根據權利要求25所述的方法，其中所述蛋白質的抗體效價在經過第2次強化劑量后在0.365±0.20的范圍內，經過第3次強化劑量后為0.833±0.20。
32.根據權利要求25所述的方法，其中所述疫苗提供100％的免疫保護。
全文摘要
根據策略設計了狂犬病毒的新型嵌合包膜蛋白質，以在轉基因植物中高水平表達嵌合G蛋白。根據理論設計基因并化學合成以編碼嵌合G蛋白并以高水平在植物組織中被表達。在轉基因煙草植物中表達該基因以檢測其針對狂犬病毒的感染的治療效率。該嵌合G蛋白在植物膜中被富集。使用植物葉表達的G蛋白對BalbC小鼠進行免疫。商業上可以獲得的滅活狂犬病毒疫苗作為陽性對照。植物衍生的嵌合G蛋白與商業的疫苗相比引起更高的免疫反應。當使用活病毒攻擊小鼠時，小鼠表現了保護性的免疫。在植物葉中以高水平表達的嵌合G蛋白被證明作為商業上可以獲得有價值的針對狂犬病毒感染的亞單位疫苗發揮功能。其對于控制人類、寵物和野生生物中的狂犬病非常有價值。進一步，這類轉基因植物的可食用部分或者被純化的蛋白也可以用作口服疫苗。
文檔編號C12N15/82GK101065145SQ200580030650
公開日2007年10月31日 申請日期2005年8月12日 優先權日2004年8月13日
發明者拉凱什·圖利, 薩米爾·維什瓦納特·沙旺特, 沙德馬·阿什拉夫, 普拉德尤姆納·庫馬·辛格, 迪內希·亞達夫, 穆罕默德·沙赫納瓦茲, 薩蒂什·米什拉 申請人:印度科學工業研究所, 尤尼錢姆實驗室有限公司, 印度獸醫研究院