專利名稱：：包含vdup1蛋白或其編碼基因的用于將造血干細胞分化為天然殺傷細胞的試劑，及...的制作方法
技術領域：
：本發明涉及將造血干細胞分化為天然殺傷細胞的試劑，及利用該試劑將造血干細胞分化為天然殺傷細胞的方法，更明確地涉及，將造血干細胞分化為天然殺傷細胞的試劑，所述試劑含有作為有效成分的VDUP1(上調蛋白1的維生素D3)或其編碼基因或調節VDUP1的維生素D3，以及利用該試劑將HSCs分化為NK細胞的方法。
背景技術：
：造血干細胞，即干細胞中的一種，能夠通過任何機會分化為各種血液成分(紅細胞(redbloodcell或erythrocyte),白細胞(whitebloodcell或leukocyte),血小板和淋巴細胞)，且在體內不斷地自體再生并分化為免疫細胞。在形成免疫系統的細胞中，天然殺傷細胞(下文中稱為"NK細胞")能夠殺傷非特異性腫瘤細胞。NK細胞的細胞毒性不僅提供利用淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK)和腫瘤滲透淋巴細胞(TIL)處理實體腫瘤的線索，還適用于通過供體淋巴細胞輸注進行的免疫療法(J.Immunol.,36:3910-3915，1986;Hematologia，84:1110-1149，1999)，從而開發一種新型的對付骨髓移植或器官移植后排斥反應的細胞療法。根據近期的報告，NK細胞有缺陷的分化和活化在多種疾病中有所涉及，所述疾病包括乳腺癌(BreastCancerRes.Treat.,66:255-263，2003)，黑素瘤(MelanomaRes.,13:349-356，2003)，肺癌(LungCancer,35:23-18，2002)，等，并且因此，產生了利用NK細胞治療這些疾病的新型細胞療法。NK細胞來源于骨髓中的造血干細胞。NK細胞由HSCs的發育由若干步驟組成，尚未完全定義這些步驟。上調蛋白1的維生素D3(VDUP1)最初報告是通過HL-60白血病細胞中的維生素D3進行上調的(Biochem.Biophys.Acta,1219:26-32,1994)。近期還有報告指出VDUP1與硫氧還蛋白(Trx)相互作用，從而抑制Trx的活性并阻斷Trx與其它因子的相互作用(J.Biol.Chem.，274:21645-21650，1999，丄I鵬unoL，164:6287-6295，2000)。換句話說，VDUP1在Trx調節細胞內氧化/還原中充當負控制劑，從而使該細胞對氧化應力更加敏感。另外，報道指出VDUP1反義DNA在鼠黑素瘤細胞中的黑色素合成和腫瘤發生中有所涉及(ImmunologyLetters,86:235-247，2003)，且通過抑制腫瘤細胞中細胞周期而具有抗癌活性。實際上，VDUP1在腫瘤組織中的表達與在正常細胞中的表達相比有所下降。VDUP1的表達在免疫細胞中是顯性的，但是其在免疫細胞中全部的作用尚未知。因此，本發明人證實了VDUP1通過調節VDUP1基因敲除小鼠中IL-2受體P(CD122)而參與NK細胞體外分化，，還證實了上調VDUP1的維生素D3也調節NK細胞的分化。并且，本發明人通過證實利用基因調節分化為NK細胞的可能性完成了本發明，其中所述NK細胞具有細胞毒性和控制免疫系統進行細胞分化及進一步進行癌癥治療的能力
發明內容技術問題本發明證實VDUP1(上調蛋白1的維生素D3)即調節干細胞分化為NK細胞的基因，的功能，并且因此提供用于NK細胞分化的試劑，所述試劑含有VDUP1或編碼該蛋白質的基因和調節VDUP1基因的維生素D3，以及利用該試劑的分化方法。技術方案本發明提供用于NK細胞分化的試劑，該試劑含有作為有效成分的VDUP1蛋白或其編碼基因。本發明還提供用于NK細胞分化的試劑，特征在于含有由SEQIDN0:1所代表的VDUP1蛋白。本發明提供用于NK細胞分化的試劑，特征在于含有由SEQIDN0:2所代表的VDUPl基因。本發明提供用于NK細胞分化的試劑，特征在于通過向非病毒載體或病毒載體中引入所述基因制備而成。本發明提供用于NK細胞分化的試劑，其中所述非病毒載體是在圖18中存在的pFLAGmVDUPl。本發明提供用于NK細胞分化的試劑，其包括作為有效成分的維生素D3。本發明提供用于NK細胞分化的試劑，其特征為通過維生素D3調節VDUP1基因。本發明提供用于NK細胞分化的試劑，特征在于可用于癌癥的治療。本發明提供用于NK細胞分化的試劑，該試劑用于癌癥的治療，所述癌癥特征在于選自由下列各項組成的組乳腺癌、黑素瘤、胃癌和肺癌。本發明提供一種將HSCs分化為NK細胞的方法，包括向HSCs中引入VDUP1蛋白或編碼該蛋白的基因的步驟。本發明提供一種將HSCs分化為NK細胞的方法，特征在于包括共同培養0P9基質細胞和IL-15的步驟。本發明提供一種將HSCs分化為NK細胞的方法，特征在于包括對HSCs處理維生素D3的步驟。本發明提供一種將HSCs分化為NK細胞的方法，其中維生素D3的濃度為10-20nM。本發明提供一種將HSCs分化為NK細胞的方法，特征在于包括共同培養0P9基質細胞和IL-15的步驟。本發明還提供VDUP1基因敲除小鼠，該小鼠表現出由缺乏VDUP1基因而引起的NK細胞水平的下降。本發明還提供VDUP1基因敲除小鼠，特征在于是以保藏號KCTC10794BP來保藏的。本發明還提供一種闡明NK細胞分化所涉及的VDUP1基因功能的方法，該方法是通過比較在野生型小鼠和VDUP1基因敲除小鼠間該基因的表達來進行的。本發明還提供一種增加NK細胞的細胞毒性的方法，特征在于包括施用VDUP1，編碼該蛋白質的基因或維生素D3的步驟。本發明還提供一種增加NK細胞的細胞毒性的方法，該方法包括共同施用IL-2和所提及的因子的步驟。本發明還提供VDUP1表達載體，該載體由圖18的pFLAGiVDUPl所表示。本發明還提供作為用于分化的NK細胞的檢驗標記的VDUP1蛋白或編碼該蛋白的基因。在本發明中，"分化調節子基因"指調節從干細胞分化為天然殺傷細胞的基因，更明確地，它指每個能夠促進或抑制分化的基因。換言之，本發明的基因能夠促進向下一個階段分化，且對于維持各個步驟或抑制向下一個步驟分化是必需的。在下文中，詳細描述本發明。本發明提供用于調節NK細胞分化的試劑，該試劑含有VDUP1(上調蛋白1的維生素D3)或編碼該蛋白質的基因。所述VDUP1蛋白不限于具體的一種，但優選地由SEQIDN0:1所代表。所述VDUP1基因不限于具體的一種，但優選地由SEQIDN0:2所代表。所述基因優選地包括于非病毒載體或病毒載體中，且如圖18的pFLAG-mVDUPl所代表，但是并不總限于此。本發明還提供用于調節NK細胞分化的試劑，該試劑含有控制VDUP1基因的維生素D3作為有效成分。本發明人分離和純化了NK細胞，并研究了分化階段特異性的VDUP1基因表達，且作為結果，本發明人證實了VDUP1基因的表達隨著干細胞向NK細胞的成熟而增加(見圖l)。另外，CD122啟動子的活性，通過VDUP1以劑量依賴性方式而提高(見圖13)，其中CD122是在NK細胞中表達的基因。本發明人首次證明了VDUP1基因是NK細胞的發育的關鍵因子，這是通過證實對HSCs細胞進行維生素D3處理誘導向NK細胞的分化來實現的(見圖15)，其中維生素D3已知為VDUP1基因的調控子。本發明還提供VDUP1基因敲除小鼠，該小鼠表現出由缺乏VDUP1(上調蛋白1的維生素D3)基因而引起的NK細胞水平的下降。本發明進一步提供闡明NK細胞分化所涉及的VDUP1基因功能的方法，該方法是通過比較在野生型小鼠和VDUP1(上調蛋白1的維生素D3)基因敲除小鼠間所述基因的表達來進行的。本發明人產生了VDUP1(上調蛋白1的維生素D3)基因敲除小鼠(見圖2)，并于2005年4月26日，將所述小鼠的受精卵保藏在韓國生物科學和生物技術研究所(KoreaResearchInstituteofBioscienceandBiotechnology)的韓國典型培養物保藏中心(KCTC)中(保藏號KCTC10794BP)。NK細胞在VDUP1基因敲除小鼠的脾、骨髓和肺中的數量，與野生型小鼠中的數量相比，顯著下降，這是通過NKl.1，即一種NK標記，所表示的(見圖5)。從骨髓和淋巴結分離單細胞，從而利用FACS研究另一種NK標記——DX-5的表達。且作為結果，類似于NKl.l的表達，DX-5在VDUP1基因敲除小鼠的表達有所下降(見圖6)。利用FACS，通過NK1.1-PE和LY49-F工TC或NKG2D-FITC的雙染色，還研究了NK受體諸如Ly49NK受體和NKG2D受體的表達。且作為結果，那些NK受體在VDUP1基因敲除小鼠的脾和BM的淋巴細胞中的表達有所下降，或甚至無誘導表達(見圖7)。利用FACS，還研究了CD122在野生型小鼠和VDUP1基因敲除小鼠的小腸中的體內表達。作為結果，CD122在VDUP1基因敲除小鼠的小腸中的體內表達，與野生型小鼠的表達相比，有所下降(見圖8)。以上結果證實了VUDP1基因確實具有調節NK細胞分化的功能。本發明提供將HSCs分化為NK細胞的方法，該方法包括向HSCs中引入VDUP1(上調蛋白1的維生素D3)或編碼該蛋白的基因的步驟。該分化方法不受具體的限制，但是優選地包括0P9基質細胞和IL-15的共同培養。本發明提供將HSCs分化為NK細胞的方法，該方法包括向HSCs中施用維生素D3的步驟。該方法不受具體的限制，但是優選地含有濃度為10-20nM的維生素D3，并包括共同培養0P9基質細胞和IL-15的步驟。為了研究已知調節VDUP1的維生素D3是否直接影響NK細胞分化，在小鼠HSCs從pNK到mNK的發育階段中，對其進行1，25-二羥基維生素D(3)處理，然后在0P9和IL-15存在中培養經處理的細胞，從而引起mNK的發育。然后進行FACS分析和"Cr釋放測定。作為結果，NK細胞種群通過維生素D3以劑量依賴性方式增加了(見圖15)。對靶細胞的細胞毒性，與未經維生素D3處理的組相比，有所增高(見圖16〉，其中所述耙細胞是NK細胞的Yac-1，而所述NK細胞是通過低濃度維生素D3(10nM)的處理而分化的。同時，從野生型小鼠的脾中分離成熟NK細胞，該野生型小鼠經IL-2和維生素D3共同處理24小時，隨后進行5'Cr釋放測定。作為結果，證實了通過維生素D3處理增高了細胞毒性(見圖17)。以上結果表明維生素D3或VDUP1參與NK細胞分化，且直接影響到其中的細胞毒性。本發明提供用于調節細胞分化的試劑，特征在于用于癌癥的治療。所述癌癥不限于具體的一種，但優選地選自由下列各項組成的組乳腺癌、黑素瘤、胃癌和肺癌。NK細胞有缺陷的分化和活化導致多種癌癥，包括乳腺癌(BreastCancerRes.Treat.,66:255-263,2003)，黑素瘤(MelanomaRes.'2003,13:349-356，2003)，肺癌(LungCancer,35:23-18，2002)。所以，本發明的用于調節NK細胞分化的試劑能夠用于通過調節NK細胞分化治療癌癥。本發明用于調節細胞分化的試劑能夠口服或胃腸外施用，且能以藥物制劑的普遍形式使用。本發明用于調節細胞分化的試劑能夠通過與普遍使用的填充劑、補充劑、粘合劑、潤濕劑、崩解劑、稀釋劑如表面活性劑或賦形劑相混合制備為經口或經胃腸外施藥的。用于經口施藥的固體制劑是片劑、丸劑、粉劑、粒劑和膠囊劑。這些固體制劑是通過混合一種或多種合適的賦形劑，如淀粉、碳酸鈣、蔗糖、乳糖、明膠等，制備而成的。除了簡單的賦形劑，可以使用潤滑劑，例如硬脂酸鎂、滑石等。用于經口施藥的液體制劑為混懸液、溶液、乳狀液和糖漿，且以上所提及的制劑除了普遍使用的簡單稀釋劑，如水和液體石蠟外，可以含有多種賦形劑，如潤濕劑、甜味劑、芳香劑和防腐劑。用于經胃腸外施藥的制劑為無菌的水溶液，不溶于水的賦形劑，混懸液、乳狀液和栓劑。不溶于水的賦形劑和混懸液，除了一種或多種活性化合物，可以含有丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄欖油，可注射酯類如ethylolate，等。栓劑除了一種或多種活性化合物，可以含有wit印sol、聚乙二醇、吐溫61、可可脂、月桂精脂、甘油、明膠等。本發明試劑的有效劑量是每天0.1-0.2mg/kg，且優選地每天0.15mg/kg。施藥頻率為每天1-3次。有益效果本發明中，本發明人產生了VDUP1基因敲除小鼠并利用所述小鼠通過實驗證實了VDUP1通過調節IL-2受體B(CD122)參與NK細胞的體外分化，且調節VDUP1的維生素D3是調節NK細胞分化的重要因子。因此，調節NK細胞分化的基因能夠有效地用于調節這樣的NK細胞的分化，所述NK細胞具有細胞毒性和控制免疫性的功能，以及進一步用于開發抗癌癥的細胞療法。附圖簡述圖1是瓊脂糖凝膠照片。小鼠HSCs在存在或缺乏0P9基質細胞(+0P9或-0P9)下經過NK前體(pNK)分化為成熟的NK細胞(mNK)，并且從階段特異性NK發育細胞中提取總RNA，從而通過RT-PCR分析VDUP1基因。圖2是顯示產生VDUP1基因敲除小鼠的基因組策略的示意圖。圖3是顯示通過RT-PCR以VDUP1基因敲除小鼠(-/-)分析VDUP1基因的瓊脂糖凝膠照片。圖4是一組RNA印跡法照片，顯示了VDUP1基因敲除小鼠(-/-)各個器官中VDUP1基因的檢測。圖5是一組顯示FACS分析結果的圖。從野生型小鼠(+/+)和VDUP1基因敲除小鼠(-/-〉的每種脾、骨髓(BM)和肺中分離單細胞，并用FITC標記的抗CD3抗體和PE標記的抗NK1.1抗體進行染色。記錄了NK細胞(CD3-/NK1.l+)在淋巴細胞中的百分比。圖6是一組顯示FACS分析結果的圖，該分析研究一種NK細胞標記一一DX5在從野生型小鼠(+/+)和VDUP1基因敲除小鼠(-/-)的每種骨髓(BM)和淋巴結(LN)中分離出的單細胞中的表達。圖7是一組顯示FACS分析結果的圖，該分析研究Ly49NK受體和NKG2D受體在野生型小鼠(+/+)和VDUP1基因敲除小鼠(-/-)脾和骨髓的NK細胞中的表達。圖8是一組顯示FACS分析結果的圖，該分析研究CD122的體內表達，明確地，在野生型小鼠(+/+)和VDUP1基因敲除小鼠(-/-)的小腸中的表達。圖9是顯示對從野生型小鼠(V+)和VDUP1基因敲除小鼠(-/-)分離并經IL-2激活24小時的脾細胞的YAC-1的細胞毒性的圖。圖10是一組瓊脂糖凝膠照片。從來自野生型小鼠的HSCs的階段特異性NK發育細胞(HSC，pNK，mNK)體外提取細胞質DNA，并通過RT-PCR研究了VDUP1在其中的表達。圖11是一組瓊脂糖凝膠照片。野生型小鼠和VDUP1基因敲除小鼠的HSCs均體外分化為NK細胞，且利用RT-PCR研究了IL-2受體P(CD122),PU.1,ETS-1,LTPR,MEF，id2和^-肌動蛋白基因在階段特異性細胞(pNK,mNK)中的表達。圖12是一組顯示FACS分析結果的圖，通過該分析，對在從HSCs體外分化為NK細胞的過程中，CD122和NKG2A在階段特異性細胞中的表達進行了研究，該研究在野生型小鼠和VDUP1基因敲除小鼠中進行。圖13是顯示VDUP1和CD122關系的圖，其中己知CD122是參與NK細胞分化的重要因子。利用CD1221uc和pFLAG-mVDUPl轉染293T細胞，從而通過熒光素酶分析研究所述的關系。圖14是一組瓊脂糖凝膠照片，顯示利用RT-PCR所研究的工L-15在野生型小鼠(+/+)和VDUP1基因敲除小鼠(-/-)的骨髓中的表達。圖15是一組顯示利用對NK1.1陽性的NK細胞群的FACS分析結果的圖。在從野生型小鼠的HSCs經過pNK分化為mNK的整個過程中處理維生素D3，該過程是通過在存在0P9和IL-15的細胞培養中進行的，從而導致對NK1.1陽性的NK細胞群的確認。圖16是顯示通過5'Cr釋放測定研究的針對靶細胞"Yac-1"的NK細胞的細胞毒性的圖，其中"Yac-1"是在低濃度維生素D3(10nM)的處理下發育的。E/T指效應細胞和靶細胞的比例。圖17是表示成熟NK細胞的細胞毒性的圖，其中成熟NK細胞分離自野生型小鼠的脾，再經IL-2和/或維生素D3處理24小時，利用510釋放測定檢測。圖18是VDUP1表達載體的示意圖。實施本發明的最佳方式本發明實踐的和目前優選的實施方案例證性地顯示在以下實施例中。然而，本領域的那些技術人員將在對此公開內容的考慮上，認識到可以在本發明的精神和范圍內對其進行改變和改進。實施例l:從骨髓分離造血干細胞將包括6-9周的C57BL/6小鼠(DaehanBiolink，韓國)脛骨和股骨的骨進行研磨，使經研磨的產物經過70p的細胞濾網，并向其中加入溶解溶液(Sigma，St.Louse,M0)以去除紅細胞，從而得到骨髓細胞。將骨髓細胞與生物素標記的特異于系統標記(CDllb:巨噬細胞標記，Gr-1:粒細胞標記，B220:B細胞標記，NKl.1:NK細胞標記，CD2:T細胞標記，TER-119:紅細胞標記)的抗體反應，然而進行清洗。所述細胞與鏈霉抗生物素蛋白標記的磁珠(MiltenyiBiotec,Auburn，CA)反應。對于磁性標記的Lin+細胞，通過使其經過SuperMACS(MiltenyiBiotec，Auburn,CA)磁場內的CS柱(MiltenyiBiotec)進行收集。經過該柱的Lin細胞與跟c-kit偶合的磁珠反應。在經過MS柱(MiltenyiBiotec)后，獲得保留在該柱中的c-kit+細胞。利用FACS(BDBioscience,Mountainview，CA)研究了上述獲得的Lin—c-kit+造血干細胞(下文中稱為HSC細胞)的純度，并證實了高于96%的純度。實施例2:誘導HSCs分化為NK細胞將上述實施例1中的從骨髓分離的HSCs接種于6孔板中(Falcon,美國)，該6孔板使用了完整的RPMI培養基并附加小鼠SCF(30ng/mL,BioSource,Camarillo,CA)，小鼠Flt3L(50ng/mL，P印roTech，RockyHill,NJ)，小鼠IL-7(0.5ng/mL，P印roTech)，吲哚美辛(2g/mL，Sigma),慶大霉素(20g/mL)和10%胎牛血清，接種濃度為2x106個細胞/孔。所述細胞在37。C和5%的C02的培養箱中培養6天。3天后，棄一半培養上清液，并用具有與上述相同的成分的新鮮新培養基取代。進一步培養6天后，利用FITC綴合抗CD122和與MACS磁珠偶合的抗FITC抗體分離CD122+未成熟NK細胞(下文中稱為"pNK細胞")。通過FACS確定了pNK細胞的純度，并證實了高于92%的純度。為了產生成熟NK細胞(下文中稱為"raNK細胞")，在小鼠IL-15(20ng/mL，P印roTech,美國)存在下，將收集到的HSCs與0P9基質細胞或不與0P9基質細胞一起培養(Science,265:1098-1101，1994)。培養3天后，將該培養基的一半替換為具有與先前所述相同的成分新鮮培養基。在培養的第12天，利用FITC綴合抗NK1.1抗體和與MACS磁珠偶合的抗FITC抗體分離NKl.l+細胞。利用抗CD122，NK1.1，DX-5和NK細胞受體的抗體通過流式細胞術(FACS)確定了該成熟NK細胞的純度。實施例3:階段特異性VDUP1基因在分離和純化的NK細胞分化過程中的表達為獲得階段特異性NK發育細胞，從小鼠骨髓中分離Linc-h'fHSCs(〉95%)，然后再在SCF，Fit-3L和IL-7的存在下對其培養6天。分離了CD122+pNK細胞(95%)，隨后進行FACS分析。將pNK細胞在僅有IL-15(-0P9)或IL-15和0P9基質細胞共同(+0P9)存在下繼續培養6天，隨后進行FACS分析。當該細胞與0P9基質細胞共同培養時，mNK細胞數量增加得更多(-0P9;94。Z。和+0P9;〉95%)。mNK細胞表面的LY49受體在mNK細胞功能中起重要作用，且它們的表達由與其它免疫細胞交流的信號轉導所調節。為了研究骨髓來源的HSCs和基質細胞的共同培養是否對LY49受體，即mNK細胞的NK受體的表達是必要的，在僅有IL-15或IL-15和0P9基質細胞共同存在下培養mNK細胞。然后，研究了Ly49，即NK受體的表達。當該細胞與0P9基質細胞共同培養時(+0P9)，在mNK細胞中誘導了Ly49C/1和Ly49G2，即NK受體的表達。然而，當不與0P9基質細胞共同培養時(-0P9)，不誘導Ly49C/工和Ly49G2的表達。這些結果說明與0P9基質細胞的共同培養對NK細胞的成熟是必要的。利用RT-PCR研究了NK細胞分化階段特異性VDUP1基因的表達(圖1)。利用Trizol試劑(LifeTechnology,美國)并根據廠商的指示從所有細胞中提取RNA，并利用RT-PCR試劑盒(Quiagen，德國)并根據廠商的指示合成了cDNA。將含有cDNA的PCR混合物在95。C加熱1分鐘，用HSC和mNK細胞進行擴增，其方法如下進行28個循環或32個循環的反應，其中每個循環為95TV1分鐘，55。C/1分鐘，和72TV2分鐘。用pNK細胞進行PCR，其方法如下進行32個循環的反應，其中每個循環為95°C/1分鐘，60°C/1分鐘，和分鐘，隨后在72。C延長10分鐘。對該PCR產物進行電泳并利用溴化乙錠染色。RT-PCR研究服細胞分化階段特異性VDUP1基因表達的結果顯示在圖1中。如圖1中所示，VDUP1基因的表達階段依賴性地，即隨著NK細胞的成熟而增加。實施例4:VDUP1基因敲除小鼠的產生為了產生VDIJP1基因敲除小鼠，構建了這樣的靶載體(圖2)，在所述靶載體中，VDUP1基因從外顯子1到外顯子8的序列由lacZ/neo盒基因所取代。將所述載體引入129Sv小鼠胚胎干細胞，將其在附加有G418抗生素和9-鳥嘌呤(gancyclovir)的培養基中進行培養。在培養基上的活的胚胎細胞中，選擇了在VDUP1基因的一個等位基因中表現出突變的細胞，并將其注射到C57BL/6小鼠的胚泡胚胎中，以產生嵌合小鼠。該突變的等位基因通過它們的種系成功地傳遞給下一代。由此，產生了VDUP1基因敲除小鼠。利用對各個器官進行的RT-PCR和RNA印跡法證實了VDUP1基因敲除小鼠的成功產生(圖3和圖4)。為進行RT-PCR，cDNA由如實施例3所說明的方法獲得，并使用了引物5'-ATTCCCCTTCCAGGTGGA-3'和5'-TTGAAATTGGCTCTGT-3，。確切地，將含有cDNA的PCR混合物在95。C加熱1分鐘，隨后進行32個循環的反應，其中每個循環為95'C/1分鐘，55XV1分鐘，和72"C/2分鐘，最后在72'C保持10分鐘。對擴增的PCR產物進行電泳并利用溴化乙錠染色。為進行RNA印跡法，從小鼠獲得器官，包括胃、腦，肺和脾。利用組織混合器在RNAzolB溶液(Tel-Test，Friendswood，TX)中對它們進行均質化，并純化由此生成的RNA。在含有2.2M甲醛的1%的瓊脂糖凝膠中電泳30iig的RNA，然后將其粘附在尼龍膜(GeneScreen腦，NENLifeScienceProducts,Boston,MA)上。該尼龍膜在含有32P標記的VDUP1cDNA的ExpressHyb溶液(Clontech，美國)中，在65'C反應16小時。清洗該膜3次以上，從而去除非特異性加載的探針，隨后進行放射自顯影。如圖3或圖4中所示，在VDUP1基因敲除小鼠中完全沒有檢測到VDUP1基因，這證實了該基因的成功去除。本發明人于2005年4月26日，將VDUP1基因敲除小鼠的受精卵保藏于韓國生物科學和生物技術研究所(KoreaResearchInstituteofBioscienceandBiotechnology)的韓國典型培養物保藏中心(KCTC)中(保藏號KCTC10794BP)。實施例5:VDUPl基因敲除小鼠中的NK細胞分化從野生型小鼠和VDUP1基因敲除小鼠的脾、骨髓(BM)和肺中分離單細胞，并用FITC標記的抗CD3抗體和PE標記的抗NK1.1抗體進行染色，從而通過FACS分析確定NK細胞(CD3-/NK1.1+)在淋巴細胞中的百分比(圖5)。如圖5中所示，與野生型小鼠相比，NK細胞在VDUPl基因敲除小鼠的脾、BM和肺中的數量顯著減少。還從骨髓和淋巴結分離單細胞，并利用FACS分析研究另一種M標記DX-5在其中的表達(圖6)。如圖6中所示，與NKl.l減少的表達相一致，另一種NK標記DX-5在VDUP1基因敲除小鼠中的表達也減低。進行了利用NK1.1-PE和Ly49-FITC或NKG2D-FITC的雙染色，隨后進行FACS分析，從而研究NK受體"Ly49NK受體和NKG2D-FITC受體"在NK細胞中的表達(圖7)。如圖7中所示，VDUP1基因敲除小鼠的脾和骨髓中NK受體的表達也有所下降，或甚至不誘導表達。利用FACS比較了野生型小鼠和VDUP1基因敲除小鼠小腸中CD122的體內表達(圖8)。如圖8中所示，在VDUP1基因敲除小鼠中不誘導小腸中CD122的體內表達。實施例6:NK細胞毒性測定用IL-2(10u/ml)處理由體外分化或從脾分離的NK細胞，隨后培養24小時。清洗后，根據效應子細胞對靶細胞的比例，將NK細胞涂布于含有靶細胞(s'Cr標記的Yac-l細胞，104/孔)的96孔板(圓底孔板，Falcon，美國)中，隨后進一步培養4小時。隨著培養的完成，利用Y計數器測量了100ii1上清液的放射性(圖9)。如圖9中所示，利用IL-2對從每個野生型小鼠和VDUP1基因敲除小鼠的脾中分離的細胞進行激活24小時，然后測量了NK介導的對YAC-1的細胞毒性。作為結果，VDUP1基因敲除小鼠中的細胞毒性與野生型小鼠中的相比顯著減少。實施例7:研究在NK細胞發育過程中表達的基因為了研究VDUP1對NK細胞發育的影響，如先前的實施例所述，從來自野生型小鼠HSCs的體內NK發育的各個階段提取細胞質RNA。然后，對VDUPl進行了RT-PCR(圖10)。如圖10中所示，VDUP1的表達從pNK細胞階段開始增加，并持續到mNK細胞階段。同時，在野生型小鼠和VDUP1基因敲除小鼠中均誘導了起始于HSCs的體外NK細胞分化，并利用RT-PCR比較了CD122，PU.1，ETS-1，LtbetaR,MEF,1d2，和P肌動蛋白基因的階段特異性表達(圖ll)。如圖11中所示，CD122在VDUPl基因敲除小鼠的pNK和mNK細胞中的表達，與在野生型小鼠中的相比，有所下降。另外，利用FACS體外研究了CD122和NK1.1的階段特異性表達(圖12)。如圖12中所示，CD122在VDUPl基因敲除小鼠的pNK細胞中的表達，與在野生型小鼠中的相比，有所下降。NKl.l和NKG2A在mNK細胞中的表達也有所下降。實施例8:VDUP1對CD122啟動子活性的作用利用以下各項對293T細胞進行轉染0.1yg的CD122啟動子(-857/97)熒光素酶受體質粒，0.Itigrenilla熒光素酶質粒(CD1221uc)和不同濃度的VDUP1表達載體(pFLAG-mVDUPl;通過將小鼠VDUPlcDNA插入pFLAG-CMV2表達載體(Clontech，美國)的〃J'Wm和I位點構建VDUP1表達載體(圖18))。通過使用空載體調節總DNA濃度。培養48小時后，利用細胞溶解產物并根據廠商的指示(Promega，Madison，WI)測量熒光素酶活性(圖13)。通過計數renilla熒光素酶活性標準化轉染效率。如圖13中所示，CD122啟動子活性對VDUP1的劑量依賴性提高。實施例9:維生素D3對NK細胞發育的作用為了研究維生素D3對NK細胞發育的作用，其中已知維生素D3調節VDUP1，對從小鼠HSCs經pNK分化為mNK的各個階段進行1，25-二羥基維生素D(3)處理。通過在0P9和IL-15存在下的培養使細胞成熟，隨后進行FACS分析(圖15)和5'Cr釋放測定(圖16)。如圖15中所示，維生素D3使NK細胞數量以劑量依賴的方式增加。如圖16中所示，與未經維生素D3處理的組相比，NK介導的對Yac-l的細胞毒性在那些經過低濃度(10nM)維生素D3處理的細胞中有所增加。此外，從野生型小鼠的脾中分離成熟NK細胞。用維生素D3和IL-2一起處理這些細胞24小時，隨后進行5'Cr釋放測定(圖17)。如圖17中所示，NK介導的細胞毒性隨著維生素D3的處理有所增加。上述結果說明維生素D3或VDUP1參與NK細胞發育，并直接影響細胞毒性。工業適用性如上文中所說明的，本發明人產生了VDUP1基因敲除小鼠，并利用所述小鼠通過實驗證實了VDUP1通過調節IL-2受體B(CD122)參與NK細胞的體外分化，且調節VDUP1的維生素D3是調節NK細胞分化的重要因子。因此，調節NK細胞分化的基因能夠有效地用于調節這樣的服細胞的分化，所述NK細胞具有細胞毒性和控制免疫性的功能，以及進一步用于發展抗癌癥的細胞療法。序列列表SEQIDN0:1是小鼠VDUP1蛋白的氨基酸序列。SEQIDN0:2是小鼠VDUP1基因的核苷酸序列。在提交本申請時，已經向受理處提交了上述的序列的序列表。本領域中的那些技術人員將意識到在以上描述中所公開的概念和具體的實施方案可以很容易地作為修改或設計其他實施方案的基礎而使用，從而實現與本發明相同的目的。本領域中的那些技術人員還將意識到這些等價的實施方案不違反后附權利要求所闡明的本發明的精神和范圍。微生物國際保藏證明(譯文)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>權利要求1.一種用于NK細胞分化的試劑，含有作為有效成分的VDUP1(上調蛋白1的維生素D3)或編碼所述蛋白質的基因。2.權利要求1中所述的用于NK細胞分化的試劑，其中所述VDUP1(上調蛋白1的維生素D3)由SEQIDN0:1表示。3.權利要求1中所述的用于NK細胞分化的試劑，其中所述VDUP1(上調蛋白1的維生素D3)基因由SEQIDN0:2表示。4.權利要求l中所述的用于NK細胞分化的試劑，其中所述基因包含在非病毒載體或病毒載體中。5.權利要求4中所述的用于NK細胞分化的試劑，其中所述非病毒載體是如圖18中所示的pFLAG-mVDUPl。6.—種用于NK細胞分化的試劑，含有作為有效成分的維生素D3。7.權利要求6中所述的用于NK細胞分化的試劑，其中所述維生素D3調節VDUP1(上調蛋白1的維生素D3)基因。8.權利要求1-7的任一項中所述的用于NK細胞分化的試劑，其中所述試劑用于抗癌癥的細胞療法。9.權利要求8中所述的用于NK細胞分化的試劑，其中所述癌癥選自由下列各項組成的組乳腺癌、黑素瘤、胃癌、肝細胞瘤和肺癌。10.—種用于將造血干細胞(HSCs)分化為NK細胞的方法，包括向所述HSCs引入VDUP1(上調蛋白1的維生素D3)或其編碼基因的步驟。11.權利要求10中所述的用于將造血干細胞(HSCs)分化為NK細胞的方法，其中在IL-15存在下用0P9基質細胞培育所述HSCs。12.—種用于將造血干細胞(HSCs)分化為NK細胞的方法，包括向所述HSCs施用維生素D3的步驟。13.權利要求12中所述的用于將造血干細胞(HSCs)分化為NK細胞的方法，其中所述維生素D3的濃度為10-20nM。14.權利要求12中所述的用于將造血干細胞(HSCs)分化為NK細胞的方法，其中在IL-15存在下用0P9基質細胞培育所述HSCs。15.VDUP1(上調蛋白1的維生素D3)基因敲除小鼠，其表現出由于缺乏VDUP1(上調蛋白1的維生素D3)基因而引起的NK細胞水平的下降。16.權利要求15中所述的VDUP1(上調蛋白1的維生素D3)基因敲除小鼠，其中所述小鼠以保藏號KCTC10794BP保藏。17.—種闡明參與NK細胞分化的VDUP1(上調蛋白1的維生素D3)基因的功能的方法，所述方法是通過比較所述基因在野生型小鼠和VDUP1(上調蛋白1的維生素D3)基因敲除小鼠中的表達進行的。18.—種增加NK細胞的細胞毒性的方法，包括施用VDUP1(上調蛋白1的維生素D3)，編碼所述蛋白質的基因或維生素D3的步驟。19.如權利要求18中所述的增加服細胞的細胞毒性的方法，其中還包括施用IL-2的步驟。20.由圖18中的pFLAG-mVDUPl所代表的VDUP1表達載體。21.作為用于NK細胞分化標記的VDUP1(上調蛋白1的維生素D3)或其編碼基因。全文摘要本發明涉及將造血干細胞分化為天然殺傷細胞的試劑，所述試劑包含VDUP1蛋白或其編碼基因，以及涉及利用所述試劑將造血干細胞分化為天然殺傷細胞的方法。本發明通過產生缺乏VDUP1基因的小鼠，首次揭示了VDUP1基因是對調節天然殺傷細胞分化的關鍵因子，這證實了VDUP1基因對NK成熟是必需的。因此，通過調節VDUP1基因，可以調節具有殺傷癌癥細胞能力的NK細胞，且能夠用于細胞治療法。文檔編號C12N5/00GK101198690SQ200580050003公開日2008年6月11日申請日期2005年6月8日優先權日2005年6月8日發明者尹錫蘭,崔仁杓,李基寧,柳大烈,金善昱申請人:韓國生命工學研究院