專利名稱：金線蓮組培苗培養方法
技術領域：
本發明涉及一種植物組織培養方法，具體涉及金線蓮的組培苗培養方法及其應用。
背景技術：
金線蓮為蘭科花葉開唇蘭屬多年生的珍稀藥用植物，全草均可入藥。具有清 熱解毒、固腎平肝、降血糖等功效，近來年的藥理學研究表明，金線蓮有明顯的 治療乳腺癌的作用。由于其營養體繁殖緩慢，種胚發育不全，在自然狀態下難以 繁殖，造成野生金線蓮的自然資源儲量日見減少，已成為瀕危的藥用植物。利用 組織培養技術對金線蓮進行無性快速繁育，是解決金線蓮資源匱乏的關鍵。目前， 有關金線蓮的研究備受人們的關注，雖有一些金線蓮組織培養的研究，但試管苗 的無激素培養及其栽培苗應用未見報道，為了確保金線蓮栽培苗食用的安全性， 需要尋找一種金線蓮組培苗無激素培養的方法。發明內容本發明所要解決的技術問題是在于提供一種金線蓮組培苗無激素培養的方 法，用該方法培育出來的金線蓮繁殖快速、適合大規模生產，食用安全，有效成 分(多糖、氨基酸)含量與野生型金線蓮相似，且相對穩定，解決其營養體繁殖 緩慢及生產應用中資源匱乏問題。本發明的一方面，提供了一種金線蓮組培苗培養方法，包括下列步驟a) 培養基配置:I) 培養基配方為-MS+生長素+細胞分裂素生長素取自萘乙酸(NAA)、 口引哚乙酸(IAA)、 H引噪丁酸(IBA)中的一種或 幾種，含量為O. 1 —2mg/L，優選0. 1-0. 5mg/L;細胞分裂素取自6-芐基氨基嘌呤(BA)、激動素(KT)、玉米素(ZT)中的一 種或幾種，含量為0. l—2mg/L，優選0. 1-0. 5mg/L;II) 按I)配方配置培養基，調節培養基pH值在5. 6-5. 8范圍內，加入8. 8-9. 0% 的瓊脂，常規高壓滅菌20分鐘；b) 選擇野生金線蓮莖段或莖尖為種源，滅菌后接種于按步驟a)配制的固體培養 基中進行誘導培養，培養條件為光照(500-3000 lx) 12小時/天，溫度20 26 。C;c) 經誘導形成的再生芽依次置于生長素和細胞分裂素濃度從高到低再到零的 馴化培養基上迸行培養(遞減梯度O. 1 0.5mg/L)，每個梯度培養30天，培養 溫度2(T26。C，光照(500-3000 lx) 12小時/天，直至培養基中生長素與細胞 分裂素濃度為0;d) 從步驟c)的無激素培養基上選取組培苗進行繼代培養(每月一次)，優選生 長快且健壯的苗。本發明的另一方面，還提供了按上述方法獲得的組培苗的大田栽培技術，包 括下列步驟 a)組培苗移栽-清水沖洗掉組培苗根部的培養基后，再用0 . 25-0. 5%多菌靈溶液浸1 0分
鐘后移栽至有遮蔭棚的基質(疏松、透氣、濕潤)中； b)組培苗栽培條件溫度20 25°C水分相對濕度為75 85%光照自然散射光基質要求疏松、透氣、濕潤、弱酸性 用黃豆餅發酵后的稀釋液定期澆肥每隔l 0 — 1 5天。 本發明的第三方面，提供了用上述方法獲得的金線蓮栽培苗用于制備袋泡 茶、飲料、和各種口服制劑(如膠囊劑、片劑、顆粒劑)等的用途。上述制劑 的主要成分含有總多糖含量為1一20%;總氨基酸含量為1一10%。 本發明的其他方面，所屬技術領域的人員可以通過現有技術得知。 本發明的優點在于通過本發明培育出來的金線蓮繁殖快速、適合大規模生 產，有效成分(多糖、氨基酸)含量與野生型金線蓮相似，且相對穩定，解決了 自然條件下金線蓮營養體繁殖緩慢而使得生產中資源匱乏的問題，由于最后實現 了無激素培養，因此食用更安全。
具體實施方式
本發明中，"無激素培養"是指植物從有激素培養過渡到無激素培養。本發明中，MS為一種基本培養基，其配方參見《蔬菜組織培養》(王紀方等 編輯，上海科技技術出版社出版)。本發明中，MS()是指不加激素的基本培養基。 本發明所述袋泡茶由下列方法制得-
取金線蓮栽培苗，揀去雜質，噴70%的乙醇滅菌，揮盡乙醇，低溫80'C干 燥粉碎，取過60目未過IOO目的細粉，再經8(TC恒溫滅菌2小時的無菌食用干粉制成保健茶。本發明所述飲料由下列方法制得取金線蓮栽培苗，揀去雜質，加水減壓回流提取，過濾，濾液加葡萄糖、防 腐劑、矯味劑充分溶解后，加水稀釋至總量，過濾、滅菌，灌裝后即得。本發明所述口服劑是由下列方法制得取金線蓮栽培苗，揀去雜質，加水減壓回流提取，合并提取液，真空濃縮干燥，得到浸膏粉碎(100目 200目)，加入常用輔料，充分混合，制成顆粒，即 得顆粒劑；將顆粒填入空膠囊中，即得膠囊劑；顆粒直接壓成片，即得片劑；片 子薄膜包衣，即得薄膜包衣片。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明 本發明而不用于限制本發明的范圍。 實施例l:金線蓮再生苗的培養以野生金線蓮莖段或莖尖為材料，用70%的醫用乙醇浸泡約5分鐘，隨后 轉移至10%次氯酸鈉水溶液中進行消毒，無菌水漂洗干凈后接種于高溫滅菌過 的MS+NAA0. 5mg/L+IBA0. 5mg/L+ZT0. 2mg/L固體培養基上，培養條件為光照 (1500 lx)12小時/天，溫度25i:進行培養，30天后得金線蓮再生芽。 實施例2:金線蓮組培苗無激素快速繁殖將實施例1得到的再生芽依次置于激素濃度從高到低再到零的馴化培養基 上進行培養。取再生芽接種于MS+NAAO. 2mg/L+IBA0. 2mg/L+ZT0. 1 mg/L培養基上進行培
養，培養30天，培養溫度2(T26"C，光照(1500 lx)12小時/天。取上述組培苗在MS。培養基上進行培養，培養30天，培養溫度20 26r，光 照(15001x)12小時/天。最后，從無激素培養基上選取生長快且健壯的苗進行繼代培養(每月一次)。 實施例3:金線蓮組培苗的大田栽培用清水沖洗掉實施例2獲得的組培苗根部的培養基后，再用0 . 25%多菌靈 溶液浸l 0分鐘后移栽至有遮蔭棚的基質(疏松、透氣、濕潤)中，保持生長溫 度在20 25t:，相對濕度在75 85%的小環境下生長，并注意棚內通風換氣。 實施例4:金線蓮組培苗與野生金線蓮有效成分多糖和氨基酸比較(1) 總多糖金線蓮組培苗(實施例2獲得)與野生金線蓮多糖含量相似(測定方法本 室測定；采用分光光度法，具體操作方法由《保健食品功效成分檢測方法》(王 光亞主編，輕工業出版社出版)完全公開)，分別為15.4%和13. 17%。(2) 氨基酸含量對人體必須18種氨基酸按國家標準GB5009. 124 (2003年)方法進行測定， 結果總氨基酸含量金線蓮栽培苗(實施例2獲得)高于野生金線蓮，分別為:9. 17% 和6. 26%。實施例5:金線蓮栽培苗的應用取金線蓮栽培苗，揀去雜質，噴70%的乙醇滅菌，揮盡乙醇，低溫8or干燥 粉碎，取過60目未過IOO目的細粉，再經80。C恒溫滅菌2小時的食用干粉制成 保健茶。多糖含量為13.8%，總氨基酸含量為8.17%。
權利要求
1、一種金線蓮組培苗培養方法，其特征包括下列步驟a)培養基配置I)培養基配方為MS+生長素+細胞分裂素生長素取自萘乙酸、吲哚乙酸、吲哚丁酸中的一種或幾種，含量為0.1-2mg/L；細胞分裂素取自6-芐基氨基嘌呤、激動素、玉米素中的一種或幾種，含量為0.1-2mg/L；II)按I)配方配置培養基，調節培養基pH值在5.6-5.8范圍內，加入重量百分比8.8-9.0％的瓊脂，常規高壓滅菌；b)選擇野生金線蓮莖段或莖尖為種源，滅菌后接種于按步驟a)配制的固體培養基中進行誘導培養，培養條件為光照(500-3000 1x)12小時/天，溫度20~26℃；c)經誘導形成的再生芽依次置于生長素和細胞分裂素濃度從高到低再到零的馴化培養基上進行培養，生長素和細胞分裂素濃度遞減梯度為0.1~0.5mg/L，每個梯度培養30~40天，培養溫度20~26℃，光照(500-3000 1x)12小時/天，直至培養基中生長素與細胞分裂素濃度為0；d)從步驟c)的無激素培養基上選取生長快且健壯的組培苗進行繼代培養。
2、 如權利要求1所述的金線蓮組培苗培養方法，其特征在于，還包括下列歩驟: a)組培苗移栽沖洗掉組培苗根部的培養基，用0 . 25-0. 5%多菌靈溶液浸1 0分鐘后移栽 至有遮蔭棚的基質中； b)組培苗栽培條件 溫度20 25°C水分相對濕度為75 85%光照自然散射光基質疏松、透氣、濕潤、弱酸性用黃豆餅發酵后的稀釋液定期澆肥每隔l 0 — 1 5天。
3、 一種如權利要求1或2所述金線蓮組培苗培養方法獲得的金線蓮栽培苗的應用，其特征在于將所述金線蓮栽培苗用于制備袋泡茶、飲料和口服制劑。
4、 如權利要求3的金線蓮栽培苗的應用，其特征在于，用所述金線蓮栽培苗制備的袋泡茶、飲料和口服制劑中，總多糖含量為1—20%;總氨基酸含量為: l一亂
5、 如權利要求3所述的金線蓮栽培苗的應用，其特征在于，所述的口服制劑選自膠囊劑、片劑或顆粒劑中的一種。
全文摘要
本發明涉及一種植物組織培養方法，具體涉及金線蓮的組培方法及其應用。本發明提供了一種金線蓮組培苗培養方法以野生金線蓮為原材料進行誘導培養，通過無激素培養，獲得金線蓮組培苗無菌培養系，建立適合大規模生產的組培苗培養系統，其培養物的主要有效成分(多糖、氨基酸)與野生金線蓮接近且穩定。主要內容包括組培苗培養基的配制；組培苗培養條件；組培苗栽培技術及用途。解決了野生金線蓮的自然資源匱乏的問題。
文檔編號C12N5/04GK101124890SQ20061003021
公開日2008年2月20日 申請日期2006年8月18日 優先權日2006年8月18日
發明者顧慧芬 申請人:上海雷允上科技發展有限公司;上海市中藥研究所