專利名稱：利用幼胚離體挽救培養獲得百合遠緣雜種的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用受精后的幼胚離體培養獲得百合屬遠緣雜種的方法，屬于生物技術育種領域。
背景技術：
百合(Lilium L.)花型優美，高貴典雅，且香氣宜人，是世界上重要的切花材料之一。百合屬植物原種有90多種，因其花色豐富，雜交工作十分活躍。20世紀20-30年代一些國家即開始了對百合屬種間雜交的研究，并利用遠緣雜交獲得百合種間雜種。
中國是世界百合資源的自然分布中心，全球百合屬植物約有96個種，分布于中國的就有47個(其中36種為中國特有)，此外還有18個變種。云南有野生百合20余種，占世界百合資源的四分之一。而且大多數百合種類具有較好的香味，生境分布地域較廣，抗病力及適應性較強，在改良香味、抗性，增加現有百合品種遺傳多樣性等方面有一定優勢，亟待進一步的開發利用。同時隨著云南省10余年花卉產業的發展，已有上百個現代栽培品種引入云南，這些品種具有豐富的花色、花型、不同的生長勢及抗病性、抗逆性等，有的較適宜云南的氣候及土壤條件，各種優良性狀得到較好表現，有的則表現出某方面的優點，但缺點也突出。充分利用云南的百合種質資源優勢，選育具有云南特色，適于云南生產條件的優質、高效、抗病百合新品種是云南球根花卉產業發展亟待解決的關鍵問題，也是改進云南百合商品質量和提高花農經濟效益的重要途徑。
百合新品種的培育多數是通過種間或種系間遠緣雜交實現的，要使雜交組合獲得成功，不僅要有足夠數量的雜交種子，而且必須保證雜種后代植株有足夠的生活力與生育力。雜種胚的挽救培養技術作為組織培養的一個重要領域已有近百年的歷史，雜交子房、胚珠和雜交幼胚的離體培養，是目前克服受精后發育障礙的有效方法，在植物育種工作中發揮著極為重要的作用，已廣泛運用于水稻、小麥、玉米等糧食作物的育種工作中。當前世界各國培育的亞洲百合和東方百合雜種系，多數是屬于不同的種群和雜種間雜交育成的，由于是遠緣雜交，雜交胚的胚乳發育不正常或是胚與胚乳之間生理上的不協調而使雜種胚早期敗育。
發明內容
本發明的目的在于提供一種利用受精后的幼胚離體挽救培養獲得百合屬遠緣雜種的方法。
本發明通過下列技術方案實現一種利用幼胚離體挽救培養獲得百合遠緣雜種的方法，其特征在于經過以下步驟A、將授粉后8-23天的受精子房切割下來，在2～6℃溫度條件下存放8～15小時，用濃度為75％的酒精對其表面擦拭2-3次，再用濃度為75％的酒精浸泡消毒1～2分鐘，然后在濃度為0.05～0.1％的升汞溶液中浸泡12～18分鐘，用無菌水洗2～3次，選取膨大的部位，將子房橫切為0.2cm的切片；B、在無菌條件下，將滅菌后的子房切片接種到單位為mg/L的下列誘導培養基中MS基本培養液萘乙酸(NAA)0.5～1.0mg/L蔗糖 60000mg/L瓊脂 6000mg/LpH 5.0～5.5在光照8～10h/d，光強800～1200Lx，培養室溫度22～26℃條件下，培養20～30d后，在解剖鏡下剝離膨大的胚珠；C、在與步驟B相同的培養條件下，對剝離的胚珠進行單胚培養，培養40～50天后幼胚萌發；D、將萌發的幼胚接種到單位為mg/L的下列增殖培養基中MS基本培養液6-芐基氨基嘌呤(6-BA)0.5～1.0mg/L萘乙酸(NAA) 0～0.1mg/L
蔗糖30000mg/L瓊脂6000mg/LpH 5.5～5.8在光照10～12h/d，光強1000～1500Lx，培養室溫度22～26℃條件下繼代培養，每15～20d繼代一次；E、繼代3次后，待每個單胚增殖到15～25株后，將其分離成單株，切除葉片后接種到單位為mg/L的下列培養基中MS基本培養液萘乙酸(NAA) 0～0.1mg/L蔗糖60000～90000mg/L瓊脂6000mg/LpH 5.5～5.8在無光照，培養室溫度為22～26℃條件下，培養80～100d出瓶，包裝后于2～4℃條件下放置60～90天，即可下地種植。
本發明所述溶液濃度單位為質量比濃度。
本發明的創新點是本發明與常規育種技術相結合，選擇包括云南野生百合的國內外各類優異親本，配制不同基因型的遠緣雜交組合，對受精子房和幼胚進行離體培養挽救，獲得了一批雜交幼胚種質，在胚挽救技術應用于百合種間雜交育種上取得了進展，是百合種間雜交育種技術的創新，將有效推進百合育種工作的進程。同時胚挽救技術與百合瓶內結球技術的結合，有效縮短了百合雜交后代的培育周期和雜種成活率。
本發明的優越性在于(1)通過雜交授粉子房及幼胚的離體培養可在胚敗育之前將其取出培養，避免遠緣雜種胚早衰，使大量遠緣雜交胚繼續發育成正常種子，盡快進入選育程序，縮短了育種周期。(2)選擇包括云南野生百合的國內外各類優異親本，配制不同基因型的遠緣雜交組合，對授精子房和幼胚進行離體培養挽救，在胚搶救技術應用于百合種間雜交育種上取得了進展，同時獲得了大量的遠緣雜交后代，為培育具有特色的百合商業新品種打下了較好的基礎。(3)建立的胚挽救技術體系是百合種間雜交育種技術的創新，將有效推進百合育種工作的進程。(4)胚挽救技術與百合瓶內結球技術的結合，有效縮短了百合雜交后代的培育周期和雜種成活率。
為了更好地說明本發明的實質內容，下面給出本發明的實施例，但本發明的內容并不僅限于這些。
實施例11、自百合屬種間人工授粉第5天起，對授粉子房胚的形態發育進行觀察，根據子房膨大及萎縮現象的觀察，將授粉后10天的遠緣雜交受精子房整個切割下來，經4℃低溫存放12小時，用濃度為75％的酒精棉球對其表面擦拭2次，再用濃度為75％的酒精浸泡消毒1分鐘，然后在0.1％升汞溶液中處浸泡15分鐘，其間經多次搖動，最后用無菌水洗2次，污染率可有效控制在3％以內，選取滅菌子房頂端至中部且靠上的膨大部位，將其橫切為0.2cm的切片，每個子房可切片8-15片，此時子房切片的胎座中，可肉眼看見略為透明的膨大胚珠；2、在無菌條件下，將滅菌后的子房切片接種到單位為mg/L的下列誘導培養基中MS基本培養液萘乙酸(NAA) 1.0mg/L蔗糖60000mg/L瓊脂6000mg/LpH 5.0在光照8h/d，光強1200Lx，培養室溫度22℃條件下，培養20d后，在解剖鏡下剝離膨大的胚珠；3、在下列培養條件MS基本培養液萘乙酸(NAA) 1.0mg/L蔗糖60000mg/L瓊脂6000mg/LDH 5.0
光照8h/d，光強1200Lx，培養室溫度22℃下，對剝離的胚珠進行單胚培養，培養40天后幼胚萌發4、將萌發的幼胚接種到單位為mg/L的下列增殖培養基中MS基本培養液6-芐基氨基嘌呤(6-BA)1.0mg/L萘乙酸(NAA) 0.1mg/L蔗糖30000mg/L瓊脂6000mg/LpH 5.8在光照10h/d，光強1500Lx，培養室溫度26℃條件下繼代培養，每15d繼代一次；5、繼代3次后，待每個單胚增殖到20株后，將其分離成單株，切除葉片后接種到單位為mg/L的下列培養基中MS基本培養液萘乙酸(NAA) 0.1mg/L蔗糖90000mg/L瓊脂6000mg/LpH 5.8在無光照，培養室溫度為26℃條件下，培養20d后，瓶內可生成白色或粉紅色、無葉片、鱗片緊實、根系發達的小籽球，繼續培養60天后出瓶，經包裝并在2℃條件下放置90天，即可下地種植，定植后成活率達100％。
實施例21、自百合屬種間人工授粉第5天起，對授粉子房胚的形態發育進行觀察，根據子房膨大及萎縮現象的觀察，將授粉后20天的遠緣雜交受精子房整個切割下來，經2℃低溫存放15小時，用濃度為75％的酒精棉球對其表面擦拭3次，再用濃度為75％的酒精浸泡消毒2分鐘，然后在0.05％升汞溶液中處浸泡18分鐘，其間經多次搖動，最后用無菌水洗2次，污染率可有效控制在3％以內，選取滅菌子房頂端至中部且靠上的膨大部位，將其橫切為0.2cm的切片，每個子房可切片8-15片，此時子房切片的胎座中，可肉眼看見略為透明的膨大胚珠；2、在無菌條件下，將滅菌后的子房切片接種到單位為mg/L的下列誘導培養基中MS基本培養液萘乙酸(NAA) 0.5mg/L蔗糖60000mg/L瓊脂6000mg/LpH 5.5在光照10h/d，光強800Lx，培養室溫度26℃條件下，培養30d后，在解剖鏡下剝離膨大的胚珠；3、在下列培養條件MS基本培養液萘乙酸(NAA)0.5mg/L蔗糖 60000mg/L瓊脂 6000mg/LpH 5.5光照10h/d，光強800Lx，培養室溫度26℃下，對剝離的胚珠進行單胚培養，培養50天后幼胚萌發4、將萌發的幼胚接種到單位為mg/L的下列增殖培養基中MS基本培養液6-芐基氨基嘌呤(6-BA)0.5mg/L蔗糖30000mg/L瓊脂6000mg/LpH 5.5在光照12h/d，光強1000Lx，培養室溫度22℃條件下繼代培養，每20d繼代一次；5、繼代3次后，待每個單胚增殖到18株后，將其分離成單株，切除葉片后接種到單位為mg/L的下列培養基中
MS基本培養液蔗糖90000mg/L瓊脂6000mg/LpH 5.5在無光照，培養室溫度為22℃條件下，培養30d后，瓶內可生成白色或粉紅色、無葉片、鱗片緊實、根系發達的小籽球，繼續培養70天后出瓶，經包裝并在4℃條件下放置60天，即可下地種植，定植后成活率達100％。
由于百合各個雜交組合親本來源及遺傳背景的不同，在離體培養中的生長狀況存在一定的差異。本發明著重對雜種幼胚培養中的關鍵因素進行了研究。具體對適合子房切片培養材料的選擇、不同雜交組合子房切片的膨大狀況及胚珠萌發情況、胚齡(授粉的發育時間)及培養條件對幼胚萌發的影響開展了試驗研究，其結果報告如下1、試驗材料經人工授粉的遠緣雜交百合子房。共5個雜交組合類型，15個雜交組合(表1)。
2.方法與結果外植體的選擇、滅菌、培養的整個環節同實施例，重點研究了遠緣雜交幼胚的有效培養方法。
(1)適合子房切片培養材料的選擇有報道已表明，百合幼胚的胚齡與胚培救效果有一定的關系。我們在試驗中也證實了這一結論。百合進行雜交授粉后，不同雜交組合的子房發育有差異，有些不親合的配組在發育的前期就表現出萎縮的狀況。選擇合適的時期進行子房的離體培養，對切片培養結果有明顯的影響。根據多次試驗與觀察，本試驗根據子房發育狀況，主要是膨大及萎縮現象的觀察，依照不同的雜交配組，采取了授粉后8-23天，每個組合2-3個子房。
經滅菌處理后，主要切取頂端至中部，有膨大現象的部位，由于子房的生長狀況不同，每個子房可切片8-15片。此時子房切片的胎座中，可肉眼看見略為透明的膨大胚珠。由于培養材料前期的生長狀況有差異，每個子房切片肉眼可見的胚珠為9-15個。
(2)不同雜交組合子房切片的膨大狀況及胚珠萌發情況子房切片在培養基中培養7-10天后，子房壁開始增厚，胎座中部的胚珠開始膨大；培養25-30天以后，有的子房切片從胚珠處開始褐化，直到完全失去生命力；而有的切片中幼胚膨大明顯，呈淺綠色。在此期間多數培養材料經3-4次轉瓶，少數長勢較好的膨大胚珠在轉接時，切去周邊的部分子房壁，采用胚珠結合胎座培養(ovule with placenta culture，OPC)和胚獨立培養方法(young single ovule culture，YOC)進行。100天以后，陸續有胚珠開始萌發，并長成幼苗。
表1百合遠緣雜交胚培救材料
(注O為東方百合雜種系；為麝香百合；A為亞洲百合雜種系；W為中國野生百合。)
我們于培養150天后，比較了各個雜交組合幼胚的出苗情況(表2)。
表2不同雜交組合子房切片的培養及胚珠萌發情況
從表2的觀察結果表明由于百合各個雜交組合親本來源及遺傳背景的不同，雜交配組的類型對培養效果有明顯的影響。O×O類型的子房在取材時表現出較好的長勢，在培養過程中萌發率最高，H3的萌發率達到35.5％，而且胚珠的長勢最好；O×W類型的雜交子房在發育過程中，因在田間發育的后期有萎縮現象，所以培養取材的胚齡較小，在培養過程中萌發率最低，H9僅為4.3％，而且長勢不好。尤其是H7(Siberia×岷江百合)的3個培養子房切片均未獲得萌發的幼胚植株。其它的組合類型O×A、O×LA和O×L都有再生的幼胚植株。
從親緣關系分析，O×O類型屬種系內雜交，親和力較好，在田間也收到了一定數量的正常種子；其它的組合均屬于遠緣的種系外雜交，但在發育前期均有胚的生長。雖然所選取的O×W類型中的野生岷江百合和淡黃花百合均屬于亞洲百合系列，但可能由于其在人工栽培條件下的馴化生長仍存在一定的不適應性，在雜交配組后子房的發育有障礙。
從整個培養結果觀察，在經多次試驗的改進后，本試驗所采取的培養方法是有效的，采用的取材方法和培養條件對百合幼胚的生長有利。所培養的材料大部分均有萌芽現象，并獲得了一定數量的雜交幼胚再生植株。
(3)胚齡(授粉的發育時間)及培養條件對幼胚萌發的影響所培養材料的胚齡階段內，胚齡對幼胚的萌發無明顯的影響。胚齡最小為8天，最大為23天均可培養出雜交后代。但胚齡不同，胚萌發時間有一定的差異。在同一雜交類型中，H12的胚齡8天，胚萌發時間為128天，H11的胚齡12天，胚萌發時間為108天；H14的胚齡12天，胚萌發時間為120天，H15的胚齡9天，胚萌發時間為125天。胚齡越小，胚萌發需要的時間越長。
本試驗采取的不同培養方法主要針對培養材料轉接時的生長狀況，未觀察到對培養結果有明顯的影響。只是在培養過程中，子房壁、胎座等組織可能會因適宜的培養條件產生愈傷組織而分化出芽，影響培養出的再生植株的雜種真實性，所以在試驗后期，我們采用ARP-PCR(anchored randomprimer-PCR)法對部分胚培后代進行了雜種鑒定。
在培養過程中，對少數胚大明顯的胚珠采取了剝離培養，但培養材料均出現玻璃化和褐化現象，在培養后期未觀察到胚的萌發。可能試驗所采取的培養條件不適應于剝離胚的培養；培養基的pH值對培養效果有一定的影響。當pH值超過5.8時，培養物的褐化現象較明顯。
在百合遠緣雜交育種中，采用子房切片離體培養技術進行胚挽救是一種有效的方法。在合適的胚齡階段，不同種間及種系間雜交組合類型對百合幼胚的萌發及植株再生有一定的影響O×O，O×A雜交類型的授粉子房幼胚萌發率最高，O×野生種的幼胚萌發率最低。
培養基中的糖濃度、激素濃度、pH值的大小以及培養條件不是各自獨立地對培養有影響。胚培養后代以瓶內結球的形式出瓶后，成活率大大提高。出瓶的小籽球經過春化處理，可于次年長出地上莖，在一定程度上縮短了雜種后代種球的培育周期，可于2-3年后開花篩選。
權利要求
1.一種利用幼胚離體挽救培養獲得百合遠緣雜種的方法，其特征在于經過以下步驟A、將授粉后8-23天的受精子房切割下來，在2～6℃溫度條件下存放8～15小時，用濃度為75％的酒精對其表面擦拭2-3次，再用濃度為75％的酒精浸泡消毒1～2分鐘，然后在濃度為0.05～0.1％的升汞溶液中浸泡12～18分鐘，用無菌水洗2～3次，選取膨大的部位，將子房橫切為0.2cm的切片；B、在無菌條件下，將滅菌后的子房切片接種到單位為mg/L的下列誘導培養基中MS基本培養液萘乙酸(NAA)0.5～1.0mg/L蔗糖 60000mg/L瓊脂 6000mg/LpH 5.0～5.5在光照8～10h/d，光強800～1200Lx，培養室溫度22～26℃條件下，培養20～30d后，在解剖鏡下剝離膨大的胚珠；C、在與步驟B相同的培養條件下，對剝離的胚珠進行單胚培養，培養40～50天后幼胚萌發；D、將萌發的幼胚接種到單位為mg/L的下列增殖培養基中MS基本培養液6-芐基氨基嘌呤(6-BA) 0.5～1.0mg/L萘乙酸(NAA)0～0.1mg/L蔗糖 30000mg/L瓊脂 6000mg/LpH 5.5～5.8在光照10～12h/d，光強1000～1500Lx，培養室溫度22～26℃條件下繼代培養，每15～20d繼代一次；E、繼代3次后，待每個單胚增殖到15～25株后，將其分離成單株，切除葉片后接種到單位為mg/L的下列培養基中MS基本培養液萘乙酸(NAA)0～0.1mg/L蔗糖 60000～90000mg/L瓊脂 6000mg/LpH 5.5～5.8在無光照，培養室溫度為22～26℃條件下，培養80～100d出瓶，包裝后于2～4℃條件下放置60～90天，即可下地種植。
全文摘要
本發明公開了一種利用幼胚拯救獲得百合屬遠緣雜種的方法，它選擇云南野生百合及國內外各類優異親本，以東方百合雜種系為母本，進行雜交，通過雜交授粉子房及幼胚的離體培養可在胚敗育之前將其取出培養，避免遠緣雜種胚早衰，使大量遠緣雜交胚繼續發育成正常種子，盡快進入選育程序，縮短了育種周期，同時獲得了大量的遠緣雜交后代，實現了百合屬種間遠緣雜交，創造了一批新種質，胚挽救技術與百合瓶內結球技術的結合，有效縮短了百合雜交后代的培育周期和雜種成活率。
文檔編號C12N5/04GK1994067SQ20061004882
公開日2007年7月11日 申請日期2006年11月16日 優先權日2006年11月16日
發明者屈云慧, 熊麗, 蔣亞蓮, 吳學尉, 張藝萍 申請人:云南省農業科學院花卉研究所