專利名稱：一種異性孿生不育母牛的檢測方法
技術領域：
本發明涉及動物遺傳育種技術領域，尤其涉及一種利用PCR技術早期檢測異性孿生不育母牛的檢測方法。
背景技術：
在奶牛自然繁殖過程中，一胎雙犢比例約為2％，而異性雙胎占0.7％。隨著現代奶牛胚胎移植技術的推廣應用，奶牛一胎雙犢、異性雙犢的比例顯著增加。在孿生犢牛中，如果是一雌一雄，雄性孿生犢牛發育正常，而雌性孿生犢牛則有很高的幾率(91％～95％)不能生育，即異性孿生母牛不育現象(王元興，郎介金.動物繁殖學.江蘇科學技術出版社，1993)。
對異性孿生母牛不育現象目前有兩種解釋。一種解釋是激素學說，即認為雄性胎牛的生殖腺發育較早，故同胎中雄性胎牛產生的激素可能經過融合的胎盤血管到達雌性胎牛，抑制了雌性胎牛的卵巢皮質及生殖道的發育或者使雌性胎牛雄性化(徐立仁等.異性孿生不育母牛研究.畜牧與獸醫，1994，26(6)251～253)。但近年來人們對這個內分泌理論提出了懷疑因為沒有證據支持雄激素可以使哺乳動物的卵巢變為睪丸的主張；而且，雄激素不能造成副中腎管的退化，而副中腎管退化是異性孿生母牛的普遍特征，其外生殖器官仍然保持雌性。另外一種解釋是近年來有人根據現代免疫學和細胞遺傳學的研究認為，孿生時兩胎牛間尿囊絨毛膜緊密的融合，導致了胎盤血管發生廣泛的吻合，因此兩胎兒間造血細胞和其他細胞進行了交換，因而在孿生兩胎牛間出現了相同的紅細胞抗原，同時在外周血液細胞中還出現了白細胞性染色體的嵌合體。在實際中，人們也發現少數的異性孿生母牛具有生殖能力，研究認為這是因為孿生時兩胎牛的胎盤血管沒有發生吻合，所以沒有形成性染色體的嵌合體所致(王元興，郎介金.動物繁殖學.江蘇科學技術出版社，1993)。因此目前人們認為異性孿生母牛不育是由于其性染色體為嵌合體(XX/XY)造成的(正常母牛的性染色體為XX，正常公牛的性染色體為XY，而異性孿生不育母牛體內除了含有X性染色體外，還含有公牛所獨具的Y性染色體)，而不是以前認為的由于激素的影響。
60年代前后，人們知道哺乳動物的性別決定依賴于Y染色體，推測Y染色體上有1個基因，它編碼了1種睪丸決定因子TDF(testis determining factor)決定性脊發育為睪丸。直到1990年，人們才克隆到Y染色體短臂上的性別決定區基因(sex determining region of chromosome Y，SRY)(在人類稱為SRY，其他動物稱為Sry)，Sry是單拷貝基因。現經許多實驗室證實它具有性別決定基因的性質，是目前性別決定的最佳候選基因。該基因在哺乳動物中是高度保守的。目前，在畜禽性別控制研究領域，如胚胎性別早期鑒定，精子分離等方面，人們主要利用Sry基因來確定研究對象的性別。
以前對異性孿生不育母牛的研究報道不多，研究開發異性孿生不育母牛檢測方法也不多，主要為生化方法，一種是血型鑒定方法，即同時檢測異性孿生公母牛的血型，這要求孿生雌雄牛的血樣都要具備，而且這種方法還不能早期判定異性孿生母牛是否具有生育的能力；一種是檢測白細胞的染色體，即利用普通顯微鏡檢測牛樣本中有無Y染色體來判定，這種方法要求檢驗者要有豐富的經驗，費時費力，并且準確性不高；還有一種是檢測其移植相容性，這也要求孿生雌雄牛的樣本都要具備，而且所用的試劑價格偏貴，步驟繁瑣，對操作者的要求也比較高(徐立仁等.異性孿生不育母牛研究.畜牧與獸醫，1994，26(6)251～253)。基于上述情況，現有的生化方法實際上是很難真正用于生產上的檢測應用。值得注意的是，近年來隨著我國奶牛業的迅速發展，牛價不斷升高，有些人有意低價收購異性孿生母牛犢，然后再當做正常母牛犢高價賣出，由于異性孿生母牛犢在外觀上與正常母牛犢很難分別，所以往往買牛者要到牛犢養大了以后才發現買的母牛犢出現不能發情，屢配不孕等情況，造成的損失十分慘重，因此，生產上急需有一種能早期快速檢測異性孿生不育母牛的可行方法。
發明內容
本發明的目的在于，針對已有檢測方法中存在的費時、費力、成本高、準確性不高、并要求同時提供孿生雌雄牛的血樣等問題，提供一種應用分子生物學技術中的PCR技術，能簡便、快速、靈敏、成本低廉、特異檢測異性孿生不育母牛的方法。
本發明的主要依據是異性孿生不育母牛的性染色體是嵌合體(XX/XY)(即異性孿生不育母牛體內存在Y性染色體)，而正常母牛性染色體為XX這一現象，研究開發了一種基于PCR技術的檢測方法即檢測待檢異性孿生母牛體內是否存在Y染色體上特異的Sry基因，如果檢測出Sry基因，則說明待檢異性孿生母牛體內存在Y染色體，判定被檢測牛是異性孿生不育母牛；如果沒有檢測出Sry基因，則說明待檢異性孿生母牛體內不存在Y染色體，判定被檢測牛不是異性孿生不育母牛。
本發明目的通過以下技術方案來實現一種異性孿生不育母牛的檢測方法，包括以下步驟1)、待檢異性孿生母牛血液樣品或組織樣品的采取血樣可于待檢母牛尾靜脈采集，每頭0.5毫升～2毫升，用ACD或肝素抗凝；組織樣可于待檢母牛耳采集，每頭10毫克～20毫克，放于裝有70％乙醇的1.5毫升EP管中；采取的血樣或組織樣現用或在-20℃下冷凍保存；2)、陰性對照牛(正常母牛)和陽性對照(正常公牛)牛血樣或組織樣的采取陰性對照牛和陽性對照牛的血樣或組織樣可分別采集1-3個。血樣采集可于正常公、母牛尾靜脈采集0.5毫升～2毫升，用ACD或肝素抗凝；組織樣可采集耳組織10毫克～20毫克，放于裝有70％乙醇的1.5毫升EP管中；采取的血樣或組織樣現用或在-20℃下冷凍保存；3)、樣品基因組DNA的提取采用常規的酚-氯仿抽提法提取基因組DNA，或用基因組提取試劑盒提取基因組DNA，TE溶解或雙蒸水融解，現用或在-20℃冷凍保存；4)、根據GenBank中牛1.715微衛星DNA序列設計一對內標基因引物，擴增片斷長度為216bp，引物序列為5′端引物5′-TGGAAGCAAAGAACCCCGCT-3′3′端引物5′-GAACTTTCAAGCAGCTGAGGC-3′；5)、根據GenBank中牛Sry基因序列設計一對檢測基因引物，擴增片斷長度為302bp，引物序列為5′端引物5′-TGAACGCCTTCATTGTGTGGTC-3′3′端引物5′-GCTAGTAGTCTCTGTGCCTCCT-3′；6)、最佳擴增體系的建立利用正交試驗，摸索建立牛1.715微衛星DNA和Sry基因片斷最佳擴增體系；7)、樣本檢測與判定根據待檢測樣品和對照樣品的1.715微衛星DNA和Sry基因片斷的擴增結果，對被檢測母牛是否為異性孿生不育母牛進行判定。
本發明的有益效果為
1、簡便易行采用實驗室常規PCR技術，通過兩次PCR擴增，就可以判斷出所檢測的母牛是否為異性孿生不育母牛；檢測時無需同時具備孿生雌雄牛的血樣，只需采集待檢母牛的血液樣品幾毫升或組織樣品如耳組織幾毫克即可。
2、快速、靈敏、特異性檢測從取樣到檢測擴增結果，快速得到結果；通過特異性擴增產物的有無即可進行準確、直觀的判斷；具備簡單分子生物學技術的人員就可以應用。
3、成本低廉檢測一個樣本的成本低于2元。
4、早期檢測、降低奶牛養殖戶風險利用這項技術，一是在奶牛場可以對出生的異性孿生母牛犢進行早期檢測，以決定孿生母牛犢是留還是淘汰，以免造成不必要的經濟損失；二是應用這項技術，就可以在奶牛買賣過程，對交易奶牛犢實施檢測，以判斷其是否是孿生不育母牛犢，可以有效打擊欺詐行為，保障奶農的權益。三是可以對懷疑買到異性孿生母牛犢的奶農提供科學的檢測依據，以供他們在維權時使用，保障他們的利益。
因此，本檢測技術具備快速(5-10個小時就可以得到結果)、簡便(具備簡單分子生物學技術的人員就可以應用)、準確(通過擴增產物有無可以進行直觀判斷)，成本低廉等特點，易于推廣使用。
圖1、內標引物擴增牛1.715微衛星DNA片斷結果示意圖1-16，牛1.715微衛星DNA(216bp)；CK，陰性對照；M，DL2000；圖2、檢測引物擴增牛Sry基因片斷結果示意圖1-16，牛Sry基因(302bp)；CK，陰性對照；M，DL2000。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步詳細說明，但以下描述不對本發明的保護范圍構成任何意義上的限定。
實施例1(以血液為樣品對異性孿生不育母牛的檢測方法)步驟1待檢異性孿生母牛血液樣品的采集。
奶牛血樣采自浙江省金華市部分牛場的黑白花奶牛，共11個異性孿生母牛，各采取尾靜脈血樣1ml左右，采用抗凝劑ACD抗凝，-20℃凍存。
步驟2陰性和陽性對照牛血液樣品的采集。
奶牛血樣采自浙江省金華市部分牛場的黑白花奶牛，共5個樣品，其中3個為正常母牛樣品，2個為正常公牛樣品，各采取尾靜脈血樣1ml左右，采用抗凝劑ACD抗凝，-20℃凍存。
步驟3血液樣品的基因組DNA的提取。
采用常規的酚-氯仿抽提法提取血液樣品的基因組DNA，TE溶解(也可雙蒸水融解)后-20℃凍存。
步驟4內標基因引物設計與擴增根據GenBank中牛1.715微衛星DNA序列(GenBank序列號V00125)設計一對引物作為內標基因引物，擴增片斷長度為216bp，由上海生物工程公司合成，引物序列為5′端引物Primer 1.715F5′-TGGAAGCAAAGAACCCCGCT-3′3′端引物Primer 1.715R5′-GAACTTTCAAGCAGCTGAGGC-3′PCR最佳擴增體系為見表1
表1.牛1.715微衛星DNA的最優PCR擴增體系位點雙蒸水10×Buffer dNTP引物1引物2MgCl2 Taq酶模板總體積1.715 16.5μL 2.5μL 1μL 1μL 1μL 1.5μL 0.5μL 1μL 25μLPCR擴增程序擴增條件為94℃預變性5min；94℃，30s；56℃，40s；72℃，40s；30個循環；最后一個循環后72℃延伸10min。
PCR擴增產物經2％瓊脂糖凝膠電泳，獲得216bp的擴增條帶(見圖1)。
步驟5檢測基因引物設計與擴增根據GenBank中牛Sry基因序列(GenBank序列號AB039748，AF148462)設計一對引物作為檢測基因引物，擴增片斷長度為302bp，由上海生物工程公司合成，引物序列為5′端引物Primer SryF5′-TGAACGCCTTCATTGTGTGGTC-3′3′端引物Primer SryR5′-GCTAGTAGTCTCTGTGCCTCCT-3′PCR最佳擴增體系為見表2表2.牛Sry基因的最優PCR擴增體系位點雙蒸水Buffer 10×dNTP引物1引物2MgCl2 Taq酶模板總體積Sry 16μL 2.5μL 1μL 1μL 1μL 2.0μL 0.5μL 1μL 25μLPCR擴增程序擴增條件為94℃預變性5min；94℃，30s；56℃，40s；72℃，40s；30個循環；最后一個循環后72℃延伸10min。
PCR擴增產物經2％瓊脂糖凝膠電泳，獲得302bp的擴增條帶(見圖2)。
步驟6樣本檢測與判定根據待檢測樣品和對照樣品的1.715微衛星DNA和Sry基因片斷的擴增結果，對被檢測母牛是否為異性孿生不育母牛進行判定。下面是本實施例的具體判定過程所用樣品為血樣，共有16個，其中3個為正常母牛樣品(陰性對照)，編號1，2，3；2個為正常公牛樣品(陽性對照)，編號4，5；11個為孿生母牛樣品，編號6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16。
為保證檢測結果的可靠性，首先用牛1.715微衛星DNA基因為內標基因對所提取的基因組DNA進行檢驗。從圖1(牛1.715微衛星擴增結果)中可以看出，所檢測的十六頭牛中，都擴增出了216bp左右的片斷，說明所擴增片斷為牛1.715微衛星DNA序列片斷。這表明這些樣品的DNA均來自牛，質量良好而且可以用來做進一步的分析。
接著用檢測引物對16頭牛的Sry基因片斷進行擴增，結果見圖2(牛Sry基因擴增結果)。從圖2中可以看出，樣品1、2、3、11都沒有擴增產物，而樣本4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16都擴增出302bp的片斷，在所檢測的16個樣品中，樣品1、2、3為正常母牛，其性染色體型為XX，沒有Y染色體，所以沒有擴增出Sry基因片斷。而樣品11雖是異性孿生母牛，但其沒有擴增出Sry基因片斷，說明其體內不存在Y染色體，是異性孿生母牛中具有生育能力的，可以留用。樣品4、5為正常公牛，其性染色體型為XY，因此擴增出Sry基因擴增片斷。樣品6、7、8、9、10、12、13、14、15、16為異性孿生母牛，其擴增出Sry基因片斷，證明其性染色體型為XX/XY，這十頭母牛是異性孿生母牛中的不育母牛，應該被淘汰。
需要指出的是，我們還對所檢測的11頭異性孿生母牛進行了生殖系統的常規檢查，其中編號為11的母牛經常規檢查其生殖器官發育正常，能正常發情配種，而其他10頭母牛生殖系統發育不正常，不能正常發情配種。這也說明我們所建立的檢測方法能準確的檢測出異性孿生母牛中的不育母牛。本發明為生產實踐提供了一種簡便、快速、靈敏、特異的檢測異性孿生不育母牛的技術。
實施例2(以組織為樣品對異性孿生不育母牛的檢測方法)步驟1待檢異性孿生母牛組織樣品的采集。
奶牛組織樣采自浙江省金華市部分牛場的黑白花奶牛，共11個異性孿生母牛，各采取耳組織15毫克，放于裝有70％乙醇的1.5毫升EP管中，-20℃凍存。
步驟2陰性和陽性對照牛組織樣品的采集。
奶牛組織樣采自浙江省金華市部分牛場的黑白花奶牛，共5個樣品，其中3個為正常母牛樣品，2個為正常公牛樣品，各采取耳組織15毫克，放于裝有70％乙醇的1.5毫升EP管中，-20℃凍存。
步驟3組織樣品的基因組DNA的提取。
采用常規的酚-氯仿抽提法提取組織樣品的基因組DNA。TE溶解(也可雙蒸水融解)后-20℃凍存。
步驟4(內標基因引物設計與擴增)、步驟5(檢測基因引物設計與擴增)和步驟6(樣本檢測與判定)的方法、步驟及材料均同于實施例1。
以上以舉例方式詳細描述了本發明的實施過程，但對本領域熟練技術人員來說，顯而易見的是，在實施過程中可進行許多等效的修改和替換。因此，本發明的范圍僅以權利要求書的限定為準。
權利要求
1.一種異性孿生不育母牛的檢測方法，其特征在于包括以下步驟1)、待檢異性孿生母牛血液樣品或組織樣品的采取、備用；2)、陰性對照牛和陽性對照牛血樣或組織樣品的采取、備用；3)、樣品的基因組DNA的提取；4)、根據牛1.715微衛星DNA序列設計一對內標基因引物，擴增片斷長度為216bp，引物序列為5′端引物5′-TGGAAGCAAAGAACCCCGCT-3′3′端引物5′-GAACTTTCAAGCAGCTGAGGC-3′；5)、根據牛Sry基因序列設計一對檢測基因引物，擴增片斷長度為302bp，引物序列為5′端引物5′-TGAACGCCTTCATTGTGTGGTC-3′3′端引物5′-GCTAGTAGTCTCTGTGCCTCCT-3′；6)、最佳擴增體系的建立利用正交試驗，摸索建立牛1.715微衛星DNA和牛Sry基因片斷的最佳擴增體系；7)根據待檢測樣品和對照樣品的1.715微衛星DNA和Sry基因片斷的擴增結果，對被檢測母牛是否為異性孿生不育母牛進行判定。
全文摘要
本發明公開了一種異性孿生不育母牛的檢測方法，屬于動物遺傳育種技術領域。該方法包括待檢母牛和陰性對照牛(正常母牛)及陽性對照牛(正常公牛)血液樣品或組織樣品的采取；樣品基因組DNA的提取；根據GenBank中牛1.715微衛星DNA序列設計一對內標基因引物；根據GenBank中牛Sry基因序列設計一對檢測基因引物；最佳擴增體系的建立及樣本檢測與判定等技術步驟。本方法具備快速(5－10個小時)、簡便、準確(通過擴增產物有無即可直觀判斷)，成本低廉(2元/每樣本)等特點，能及早檢測出異性孿生不育母牛犢，以便及早淘汰，減少奶牛養殖者的損失。
文檔編號C12Q1/68GK1932032SQ200610053469
公開日2007年3月21日 申請日期2006年9月20日 優先權日2006年9月20日
發明者徐如海, 胡錦平, 翁經強, 禇曉紅, 蔣永清, 張妙仙, 黃少珍 申請人:浙江省農業科學院