專利名稱：鑒別芥菜類蔬菜抗蕪菁花葉病毒的分子標記方法
技術領域：
本發明涉及一種植物分子標記技術，確切地說是一種鑒別芥菜類蔬菜抗蕪菁花葉病毒的分子標記方法，屬于分子生物學技術領域。
背景技術：
隨著分子生物學的發展，分子標記技術已成為輔助育種及鑒別特異種質資源的重要手段，利用分子標記輔助選擇可以在育種早期如苗期進行鑒定；選擇過程中不受環境等因素的影響。作物育種常用的分子標記有RFLP、RAPD、SSR以及SCAP標記等。該方法采用特異分子標記技術獲得芥菜蔬菜抗蕪菁花葉病毒的分子標記，并用于芥菜類蔬菜抗蕪菁花葉病毒(TuMV)特異種質資源的篩選鑒定。
蕪菁花葉病毒(TuMV)屬于馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus Y)，是一個危害范圍廣、危害程度深的世界性病原，自1992年Schultz發現TuMV以來，TuMV至少可以侵染43科318種植物，其中以重要的十字花科經濟作物危害最為嚴重。十字花科芥菜類蔬菜是我國重要的經濟作物，包括葉芥菜、莖芥菜、根芥菜、苔芥菜等，浙江、四川、江蘇、湖南、湖北、上海、重慶等省市是芥菜類蔬菜的主要產地，其加工產品深受消費者喜愛。而蕪菁花葉病毒(Turnip mosaic virus，TuMV)是危害芥菜類蔬菜，特別是莖用芥菜(榨菜)的主要病害，有些年份甚至絕產，已嚴重影響其穩產高產和芥菜加工業的發展。中國是芥菜類蔬菜的起源中心，演化至今，類型十分豐富，有幾千份芥菜類蔬菜種質資源。豐富的芥菜種質為我們尋找抗TuMV基因提供了豐富的基因資源。作為異源四倍體(AABB)，理論上比白菜(AA)、黑芥(BB)、甘藍(CC)有更加豐富的遺傳背景，我們推定在芥菜類蔬菜中可能存在高抗/免疫TuMV的種質資源及基因資源。迄今為止，在十字花科作物中，關于TuMV抗性的遺傳特性已經有所報道，如白菜抗TuMV為隱性基因控制，甘藍型油菜抗TuMV為超顯性基因控制等(Yoon er al.，1993；Suh et al.，1995；Hughes et al.，2002；Walsh et al.，1999，2002；Shattuck and Stobbs 1987；Jenner et al.，2002)，并且已經將抗TuMV的QTL或基因(TuRB01、TuRB01b及TuRB03)定位在相應的染色體上(Walsh et al.，1999；Rusholme 2000；)，為抗TuMV基因的克隆奠定了基礎，十字花科蔬菜中未見抗TuMV基因被克隆到。到目前為止，尚無芥菜類蔬菜抗TuMV相關的分子標記報道。
發明內容
本發明的目的是提供鑒別芥菜類蔬菜抗蕪菁花葉病毒的分子標記方法。
本發明的鑒別芥菜類蔬菜抗TuMV的分子標記方法，步驟如下提取芥菜類蔬菜不同種質的基因組DNA，以其為模板，根據已克隆的芥菜類蔬菜抗蕪菁花葉病毒基因BjRT設計權利要求1敘述的引物，進行鏈式聚合酶反應，擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳，在芥菜類蔬菜檢測抗蕪菁花葉病毒特征帶。
在高抗TuMV的種質中檢測到抗TuMV標記基因的特征帶，而在不抗TuMV的種質中未能檢測到該特征帶。
上述分子標記方法中所述的引物，即人工合成的核苷酸分子是正向引物5’-GCTGACCCAATAGTCTTGAT-3’反向引物5’-TAGACGGAAATCCAAAGAG-3’上述鏈式聚合酶反應(PCR)的具體步驟如下(1)首先將下列試劑混和在一起10×Taq DNA聚合酶緩沖液5微升(μl)模板DNA1μl正向引物(1.25μg/l)0.4μl反向引物(1.25μg/l)0.4μl脫氧核苷酸混合物(dNTP) 1μlTaq DNA聚合酶 0.4μl滅菌水 41.8μl總體積 50μl(2)將上述混和液94℃變性5分鐘，然后進入下來循環94℃變性1分鐘，50℃退火45秒，72℃延伸1分鐘，35個循環后72℃延伸10分鐘，結果擴增到663的一條帶。
(3)將擴增產物采用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測本發明首次提出采用人工合成的核苷酸分子標記在芥菜類蔬菜種質中鑒別抗TuMV種質，為鑒別芥菜類蔬菜中抗TuMV種質資源奠定基礎。
圖1芥菜類蔬菜抗TuMV分子標記在不同芥菜類蔬菜種質中的特征標記。其中3、5、6及7為抗TuMV種質，1、2、4、8及9為不抗TuMV種質。
具體實施例方式
實施例芥菜類蔬菜抗TuMV的分子標記方法芥菜類蔬菜(Brassica juncea var.)由本實驗室提供，材料在浙江大學農業與生物技術學院園藝系蔬菜研究所種植。
(1)引物設計根據Genebank數據庫中Brassica juncea抗TuMV相關基因BjRT，(BjRT基因Genebank登錄號DQ789595，可以在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/中查找到)設計引物，人工合成的核苷酸分子正向引物5’-GCTGACCCAATAGTCTTGAT-3’反向引物5’-TAGACGGAAATCCAAAGAG-3’(2)CTAB法提取植物總DNA(a)取0.5g嫩葉于研缽中，液氮狀態下研磨，加入600ul 65℃預熱的2×CTAB，(30μl巰基乙醇混勻)，轉移到離心管中，65℃保溫1-2小時。
(b)加入等體積氯仿異戊醇(24/1)輕輕搖勻，4℃，13000rpm離心，10分鐘。
(c)取上清，重復(2)步驟一次。
(d)取上清于另一eppendorf管中，加入等體積異丙醇，顛倒混勻，靜置5分鐘，13000rpm，離心10分鐘。
(e)倒去上清，加入700ul Wash Buffer漂洗DNA沉淀，離心，重復一次。
(f)加15微升TE-Rnase，37℃保溫1小時。
(g)加入2mol/L NaCl 100ul+100％乙醇250ul混勻，-20℃靜置30min，13000rpm離心10分鐘。
(h)倒去上清，加入500ul 70％乙醇，漂洗，倒去乙醇，重復一次，常溫晾干。
(i)加入30-50ul ddH2O或TE，回溶，-20℃保存備用。
注2×CTAB配方，200ulCTAB 4gTris(pH8.0)20mlEDTA 1.488gNaCl 16.352gTE-RNase15ul TE加入1/100體積的RNaseWash Buffer10mmol/L乙酸氨76％乙醇
(3)鏈式聚合酶反(PCR)的試劑首先將下列試劑混和在一起10×Taq DNA聚合酶緩沖液5微升(μl)模板DNA1μl正向引物(1.25μg/l)0.4μl反向引物(1.25μg/l)0.4μl脫氧核苷酸混合物(dNTP) 1μlTaq DNA聚合酶 0.4μl滅菌水 41.8μl總體積 50μl(4)PCR反應條件將上述混和液94℃變性5分鐘，然后進入下來循環94℃變性1分鐘，50℃退火45秒，72℃延伸1分鐘，35個循環后72℃延伸10分鐘。
(5)分子標記檢測擴增產物在1％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠(ethidiumbromide)中染色，紫外燈下觀察，凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司產品)拍照記錄，結果在高抗TuMV的種質中檢測到抗TuMV標記基因的特征帶，而在不抗TuMV的種質中未能檢測到該特征帶。如圖1箭頭所示標記。
權利要求
1.一種人工合成的核苷酸分子，其特征在于具有下列堿基組成的特定序列的寡聚體正向引物5’-GCTGACCCAATAGTCTTGAT-3’反向引物5’-TAGACGGAAATCCAAAGAG-3’
2.一種鑒別芥菜類蔬菜抗蕪菁花葉病毒的分子標記方法，其特征是步驟如下提取芥菜類蔬菜不同種質的基因組DNA，以其為模板，根據已克隆的芥菜類蔬菜抗蕪菁花葉病毒基因BjRT設計權利要求1敘述的引物，進行鏈式聚合酶反應，擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳，在芥菜類蔬菜檢測抗蕪菁花葉病毒特征帶。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于鏈式聚合酶反應的具體步驟如下(1)首先將下列試劑混和在一起10×Taq DNA聚合酶緩沖液 5微升(μl)模板DNA 1μl正向引物(1.25μg/l) 0.4μl反向引物(1.25μg/l) 0.4μl脫氧核苷酸混合物(dNTP) 1μlTaq DNA聚合酶0.4μl滅菌水 41.8μl總體積 50μl(2)將上述混和液94℃變性5分鐘，然后進入下來循環94℃變性1分鐘，50℃退火45秒，72℃延伸1分鐘，35個循環后72℃延伸10分鐘；(3)將擴增產物采用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。
全文摘要
本發明的鑒別芥菜類蔬菜抗蕪菁花葉病毒基因分子標記方法，包括以下步驟提取芥菜類蔬菜不同種質的基因組DNA，以其為模板，根據已克隆的芥菜類蔬菜抗蕪菁花葉病毒基因BjRT設計引物，進行鏈式聚合酶反應，擴增產物采用瓊脂糖凝膠電泳，在芥菜類蔬菜檢測抗蕪菁花葉病毒特征帶。在高抗TuMV的種質中檢測到抗TuMV標記基因的特征帶，而在不抗TuMV的種質中未能檢測到該特征帶。本發明首次提出采用人工合成的核苷酸分子標記在芥菜類蔬菜種質中鑒別抗TuMV種質，為鑒別芥菜類蔬菜中抗TuMV種質資源奠定基礎。
文檔編號C12P19/34GK1928120SQ200610053350
公開日2007年3月14日 申請日期2006年9月12日 優先權日2006年9月12日
發明者張明方, 楊景華, 許智穎 申請人:浙江大學