專利名稱：中國荷斯坦牛瓜氨酸血癥基因的檢測方法及檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因檢測方法及檢測試劑盒，尤其涉及中國荷斯坦牛瓜氨酸血癥基因的檢測方法及檢測試劑盒。
背景技術：
牛繁育中遺傳缺陷一般遵循常染色體隱性遺傳，攜帶者不表現癥狀，但攜帶者公牛凍精一旦被大規模使用，隱性缺陷基因就會在牛群中快速傳播。這給廣泛應用人工授精技術的奶牛業造成了巨大的經濟損失。
瓜氨酸血癥(Citrullinemia，CN)是荷斯坦牛尿素循環發生代謝紊亂的一種常染色體單基因隱性遺傳缺陷病。病牛體內由于缺乏尿素代謝過程中催化瓜氨酸生成精氨酸琥珀酸的關鍵酶——精氨酸琥珀酸合成酶，導致瓜氨酸不能轉變為精氨酸琥珀酸而大量積蓄于組織及血液中，從而造成尿素循環發生代謝障礙，使氨無法轉變為尿素排出體外，引發一系列神經癥狀。病牛出生時表現正常，但不久后出現精神沉郁、步態紊亂、驚厥、失明等癥狀，一般出生后5d死亡，死亡率100％。
Robinson等通過分析瓜氨酸血癥(CN)個體的基因型發現，CN個體精氨酸琥珀酸合成酶外顯子5發生C-T的點突變，使密碼子CGA轉變為終止密碼子TGA，從而其翻譯產物——精氨酸琥珀酸合成酶變成了截短了的85個AA的蛋白質(正常為412個AA)，而失去活性。由于該位點突變丟失了一個AvaII酶切位點，這為通過分子生物學方法檢測奶牛群，尤其是種公牛的遺傳缺陷，并淘汰攜帶個體，為提高我國奶牛遺傳育種水平，培育更加優良的種公牛，提供了有效的檢測指標。并且利用分子生物學方法對牛瓜氨酸血癥基因進行檢測，將成為奶牛育種中提高牛群種質的一個重要手段。
發明內容
本發明的目的是利用分子生物學方法提供一種中國荷斯坦牛瓜氨酸血癥基因的檢測方法及檢測試劑盒。
本發明采用PCR-RFLP及DNA測序技術建立了檢測中國荷斯坦牛遺傳缺陷——瓜氨酸血癥的分子生物學方法，為我國提高奶牛遺傳育種水平，培育更加優良的種公牛提供了有效的技術手段。
本發明所述中國荷斯坦牛瓜氨酸血癥基因的檢測方法，包括牛血樣品采集，基因組DNA提取，PCR擴增引物的設計，PCR擴增，限制性內切酶消化，凝膠電泳步驟；其特征在于所述引物序列是1，GTGTTCATTGAGGACATC；2，CCGTGAGACACATACTTG；所述PCR擴增反應體系為25μl；其中DNA模板1μl，50ng；10×buffer 2.5μl；dNTPs2.0μl；引物各0.5μl；Mg2+1.5μl；H2O 16.8μl；Taq酶0.5U；循環參數為95℃ 5min，94℃ 1min，60℃ 1min，72℃ 30s，35個循環，72℃延伸10min，降溫至4℃結束；所述限制性內切酶消化用限制性內切酶Eco471酶切。
上述中國荷斯坦牛瓜氨酸血癥基因的檢測方法，所述經PCR-RFLP檢測為雜合子的樣品，對其PCR產物進行直接測序；經PCR-RFLP檢測為純合子的樣品，PCR產物進行克隆測序。
本發明所述中國荷斯坦牛瓜氨酸血癥基因的檢測試劑盒，其特征在于包括PCR試劑盒、RFLP試劑盒兩部分，其中PCR試劑盒包括10×buffer 2.5μl，由100mM Tris-HCl，500mM KCl組成；2.5mMdNTPs 2.0μl；引物各25mM 0.5μl，；25mM Mg2+1.5μl，；dd H2O 16.8μl；保存溫度-20℃；RFLP試劑盒包括Eco471酶1μl，10U；dd H2O 7μl；Buffer 2μl，由10mM Tris-HClpH8.5，10mM MgCl2，100mM KCl，0.1mg/ml BSA組成；保存溫度-20℃。
本發明通過PCR-RFLP技術和DNA測序技術分析了精氨酸琥珀酸合成酶外顯子5基因，建立了檢測該基因發生突變的方法。在檢測過程中，申請人發現AvaII酶市場價格較高，不利于大規模檢測，經對所得序列進行酶切位點分析后，找到了一個AvaII的替代產品Eco471，該酶不僅價格便宜，而且酶切效果好，適于大規模檢測。
為驗證PCR-RFLP檢測CN的準確性，申請人分別對檢測純合子個體及雜合子個體進行DNA測序。測序方法分別采用克隆測序和PCR測序。克隆測序結果表明，序列同源性達到99％，證明擴增到了所要研究的序列。克隆測序雖然有其優點，但在克隆挑選過程中不能保證所挑選的克隆是否為突變鏈，相反PCR能夠保證測序所得的序列與模板一致，這對驗證雜合子是十分有用的。經測序分析發現，精氨琥珀酸合成酶外顯子5基因在編碼第86位氨基酸的密碼子處存在一個由CGA到TGA的終止點突變，進一步驗證了本發明所建立的PCR-RFLP方法檢測遺傳缺陷的正確性和準確性。
由于隱性缺陷的隱性遺傳方式，攜帶缺陷基因的雜合子表型正常。根據孟德爾理論，一旦兩個雜合體交配，后代就會有四分之一個體隱性純合而表現發病。這使得在廣泛應用人工授精技術的奶牛業中對牛群尤其是種公牛遺傳缺陷基因的研究、檢測從而淘汰攜帶缺陷個體至關重要。在申請人所檢測的公牛群中未發現瓜氨酸血癥的雜合子，是由于這些公牛親代均進行了遺傳缺陷的檢測，并證明是非攜帶者。
本發明利用PCR-RFLP方法成功建立了適于大規模檢測奶牛遺傳缺陷—瓜氨酸血癥的檢測方法以及檢測試劑盒，對建立健全奶牛育種體系，剔除隱性缺陷基因，保證牛群種質，獲得穩定的遺傳進展，保持奶業的可持續發展，有著重要的意義。
圖1精氨酸琥珀酸合成酶基因的PCR-RFLP分析，Eco471酶切PCR產物，4％瓊脂糖凝膠上電泳，結果顯示3，4號牛產生了98bp和79bp的兩條泳帶，為正常個體；1，2號牛由于發生C-T的點突變，丟失了Eco471酶切位點，產生177bp，98bp和79bp三條泳帶，為CN雜合子。
圖2精氨琥珀酸合成酶外顯子5基因突變測序峰圖，測序結果表明，雜合子牛精氨琥珀酸合成酶外顯子5基因發生C-T單堿基突變。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步闡述。
1材料與方法1.1牛血樣品采集濟南市周邊牛場荷斯坦母牛120頭，山東奧克斯生物技術有公司荷斯坦種公牛50頭；母牛隨機采樣，公牛要求三代系譜清楚且祖先均記錄無CN。頸靜脈采血5ml，加1ml抗凝劑(ACD)。
1.2基因組DNA提取按常規酚氯仿法提取基因組DNA。
1.3引物序列引物序列是1，GTGTTCATTGAGGACATC；2，CCGTGAGACACATACTTG。由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。
1.4應用本發明的中國荷斯坦牛瓜氨酸血癥基因的檢測試劑盒，利用PCR-RFLP方法分析所采樣本的基因型。
本發明的中國荷斯坦牛瓜氨酸血癥基因的檢測試劑盒，包括PCR試劑盒、RFLP試劑盒兩部分，其中PCR試劑盒包括10×buffer 2.5μl，由100mM Tris-HCl，500mM KCl組成；2.5mMdNTPs 2.0μl；引物各25mM 0.5μl，；25mM Mg2+1.5μl，；dd H2O 16.8μl；保存溫度-20℃；RFLP試劑盒包括Eco471酶1μl，10U；dd H2O 7μl；Buffer 2μl，由10mM Tris-HClpH8.5，10mM MgCl2，100mM KCl，0.1mg/ml BSA組成；保存溫度-20℃。
PCR-RFLP分析PCR反應體系約為25μl，其中DNA模板1μl(約50 ng)，10×buffer 2.5μl，dNTPs 2.0μl，引物各0.5μl，Mg2+1.5μl，H2O 16.8μl，Taq酶0.5U，循環參數為95℃ 5min，94℃ 1min，60℃ 1min，72℃ 30s，35個循環，72℃延伸10min，降溫至4℃結束。
限制性內切酶消化取10μl PCR產物用10個單位Eco471內切酶，在總體積為20μl的反應體積中酶解，37℃酶切2～3h。
凝膠電泳用4％瓊脂糖凝膠電泳，80V，1.5h，凝膠成像系統照相，分析圖形(見圖1)。
1.5 DNA序列分析經PCR-RFLP檢測為雜合子的樣品，對其PCR產物進行直接測序；經PCR-RFLP檢測為純合子的樣品，PCR產物進行克隆測序。
1.6結果與分析(1)PCR-RFLP結果分析經PCR-RFLP分析，所檢測母牛群中有兩頭雜合子，所檢測公牛群中均為純合子，未發現突變的雜合子，雜合子頻率為1.12％。
(2)DNA測序結果分析所得序列比對分析發現，與澳大利亞荷斯坦牛同源性達到99％以上，該序列已被GenBank收錄(登錄號DQ344626)。雜合子精氨琥珀酸合成酶外顯子5基因在編碼第86位氨基酸的密碼子處存在一個由C-T的點突變，使遺傳密碼子CGA變為終止密碼子TGA，而使翻譯終止，與國外報道一致(見圖2)。
權利要求
1.中國荷斯坦牛瓜氨酸血癥基因的檢測方法，包括牛血樣品采集，基因組DNA提取，PCR擴增引物的設計，PCR擴增，限制性內切酶消化，凝膠電泳步驟；其特征在于所述引物序列是1，GTGTTCATTGAGGACATC；2，CCGTGAGACACATACTTG；所述PCR擴增反應體系為25μl；其中DNA模板1μl，50ng；10×buffer 2.5μl；dNTPs 2.0μl；引物各0.5μl；Mg2+1.5μl；H2O 16.8μl；Taq酶0.5U；循環參數為95℃ 5min，94℃ 1min，60℃ 1min，72℃ 30s，35個循環，72℃延伸10min，降溫至4℃結束；所述限制性內切酶消化用限制性內切酶Eco471酶切。
2.如權利要求1所述中國荷斯坦牛瓜氨酸血癥基因的檢測方法，其特征在于所述經PCR-RFLP檢測為雜合子的樣品，對其PCR產物進行直接測序；經PCR-RFLP檢測為純合子的樣品，PCR產物進行克隆測序。
3.中國荷斯坦牛瓜氨酸血癥基因的檢測試劑盒，其特征在于包括PCR試劑盒、RFLP試劑盒兩部分，其中PCR試劑盒包括10×buffer 2.5μl，由100mM Tris-HCl，500mM KCl組成；2.5mMdNTPs 2.0μl；引物各25mM 0.5μl，；25mM Mg2+1.5μl，；dd H2O 16.8μl；保存溫度-20℃；RFLP試劑盒包括Eco471酶1μl，10U；dd H2O 7μl；Buffer 2μl，由10mM Tris-HClpH8.5，10mM MgCl2，100mM KCl，0.1mg/ml BSA組成；保存溫度-20℃。
全文摘要
本發明公開了一種中國荷斯坦牛瓜氨酸血癥基因的檢測方法，包括牛血樣品采集，基因組DNA提取，PCR擴增引物的設計，PCR擴增，限制性內切酶消化，凝膠電泳步驟；其中所述引物序列是1，GTGTTCATTGAGGACATC；2，CCGTGAGACACATACTTG；所述PCR擴增反應循環參數為95℃5min，94℃1min，60℃1min，72℃ 30 s，35個循環，72℃延伸10min，降溫至4℃結束；所述限制性內切酶消化用Eco471酶切。本發明還同時公開了瓜氨酸血癥基因的檢測試劑盒，包括PCR試劑盒、RFLP試劑盒兩部分。本發明對建立健全奶牛育種體系，剔除隱性缺陷基因，保證牛群種質，獲得穩定的遺傳進展，保持奶業的可持續發展，有著重要的意義。
文檔編號C12Q1/68GK1952175SQ200610069458
公開日2007年4月25日 申請日期2006年10月23日 優先權日2006年10月23日
發明者李建斌, 高運東, 王紅梅, 仲躋峰 申請人:山東奧克斯生物技術有限公司