專利名稱：基因恒溫擴增方法、基因恒溫檢測方法和基因缺陷篩查診斷試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種基因恒溫擴增方法、一種基因恒溫檢測方法、以及一種基因缺陷篩查診斷試劑盒。
背景技術：
體外基因擴增是涉及基因檢測的一項重要內容，目前普遍使用的是PCR技術，這種擴增方式涉及待檢測DNA樣品、DNA引物、DNA聚合酶以及由4種脫氧核苷酸組成的混合物，在反應過程中，要求溫度有一定的周期性變化，以便實現高溫條件下的變形、中間溫度條件下的退火和低溫條件下的延伸，形成新的雙鏈DNA，通過反復的溫度循環，基因擴增的產量以指數方式上升，最終達到滿意的濃度。由于這種技術需要進行周期性的溫度調節，不僅要求復雜的設備，加大了設備投資和操作難度，更無法在一個試劑盒中實現。
發明內容
為克服現有技術的上述缺陷，本發明提供了一種基因恒溫擴增方法、一種采用這種恒溫擴增方法的基因恒溫檢測方法、以及一種采用這種基因恒溫檢測方法的基因缺陷篩查診斷試劑盒。
本發明實現上述目的技術方案是一種基因恒溫擴增方法，其采用內切酶對待擴增的靶DNA進行切割，在靶DNA未被修飾的一條鏈上切開一個缺口，暴露其末端，DNA聚合酶以該切口為起點，合成新鏈，并將“舊鏈”剝離，被剝離的單鏈DNA被作為模板，用于合成新的雙鏈DNA，由此完成一個擴增循環，進入下一個擴增循環，新合成的DNA被用做下一個擴增循環的靶DNA。
一種基因恒溫檢測方法，主要包括待檢測基因的恒溫擴增、單堿基延伸和核酸試紙檢測這三個步驟，其中所述恒溫擴增步驟為采用內切酶對待擴增的靶DNA進行切割，在靶DNA未被修飾的一條鏈上切開一個缺口，暴露其末端，DNA聚合酶以該切口為起點，合成新鏈，并將“舊鏈”剝離，被剝離的單鏈DNA被作為模板，用于合成新的雙鏈DNA，由此完成一個擴增循環，進入下一個擴增循環后，新合成的DNA被用做下一個擴增循環的靶DNA。
一種基因缺陷篩查診斷試劑盒，其試劑包括用于恒溫擴增的內切酶、用于恒溫擴增的引物、用于恒溫擴增的DNA聚合酶和用于合成DNA的混合原料，還包括用于DNA檢測并顯示檢測結果的核酸試紙條。
由于本發明在擴增中采用了內切酶對靶DNA進行切割，在靶DNA上切出一個切口，形成延伸和合成新鏈的起點，替代了現有PCR技術下用于變性的高溫條件，由此極大地簡化了工藝過程，簡化了設備，降低了投資和成本，提供了效率。更為重要的是，現有技術可以將所有試劑和試紙設置在一個試劑盒內。由于這種試劑盒成本低，操作和攜帶都很方便，有利于基因檢測的發展，有利于及早發現基因缺陷，及早采取防范措施，提高人們的健康水平。
附圖是本發明的試劑盒的外部結構示意圖。
具體實施例方式
針對不同的基因缺陷，可以依據現有技術和其他可能的先進技術，對基因進行選擇，確定重大出生缺陷性疾病相關基因SNP的位點，收集足夠的樣品，以保證調查統計數據和結論的可靠性；應依據現有技術和其他可能的先進技術，設計和合成針對各不同基因或基因SNP的特異性引物和特異性探針；應依據檢測步驟和要求，加引物到處理過的樣品和反應體系中，在優化的實驗條件下擴增得到目的片段，將目的片段克隆到表達載體中，建立標準檢測物的質粒文庫，并通過反復的實驗室實驗對各種試劑的有效性進行檢驗和對比，優化檢測條件，以保證在實際實施所要求的特異性、敏感度和可靠性。
例如，已知如下幾種在中國人中出現頻率較高的出生缺陷同特定的基因缺陷有關1)血友病在中國人中發病率為4-8/10萬，其中出生嬰兒發病率為1/5000，主要是FVIII基因缺陷22內含子倒位引起。
2)珠蛋白生成障礙性貧血α珠蛋白生成障礙性貧血在中國人中的發病率為2.64％，主要集中在南方省市，其中基因缺陷SEA缺失的占93.7％；β珠蛋白生成障礙性貧血在中國人中的發病率為0.67％，主要集中在南方省市，個別省市高達6％，其中93.3％為以下基因缺陷引起CD41-42(-TCTT)、IVS-II(C654T)、CD17(A-->T)、TATA box nt-28、CD71-72(+A)。
3)先天性耳聾在中國人中發病率為1/1500，20％的兒童耳聾病人是Connexin 26基因缺陷引起，并且中國人Connexin 26基因缺陷主要是235delC。
4)成年型多囊腎在中國人中發病率約為1/200到1/1000，其中85-90％為PKD1基因C10078T和G10158A缺陷。
5)軟骨發育不全在中國人中發病率約為1/10000，其中97％為FGFR3基因G1138A和G1138C缺陷。
由于本發明涉及的內切酶、引物和探針等的特異性，多種基因的擴增和檢測可以同時進行，可以借鑒芯片理論和技術，并結合本發明的其他技術特點，將與多種基因缺陷(例如上述6種重大出生缺陷)相關的多個基因或基因SNP(例如前面所述的12個基因或基因SNP)的檢測集成在一個試劑盒中，即將相應的各種試劑和試紙條等裝在同一個試劑盒中，制成操作簡便和低成本的六聯篩查診斷試劑盒，這樣一次就可以同時檢測出涉及上述6種出生缺陷的篩查檢測結果，不僅僅是減少成本，而起更加有利于推廣對新生兒的基因篩查和檢測技術，提高國民身體素質。這種多種基因一起檢測的方式也可以應用到本發明的基因恒溫擴增方法和基因恒溫檢測方法。
本發明的恒溫擴增方法，可以適用于各種具有特異性內切酶的基因擴增。其使用擴增引物同靶DNA特異性雜交，該擴增引物可以根據具體的被檢測基因特別設計，所述內切酶可以是所述擴增引物尾部帶有的一段特異性切口核酸內切酶的辨認序列，該切口核酸內切酶辨認特異性DNA序列，只在其未被修飾的一條鏈上切開一個缺口，暴露其末端，DNA聚合酶以該切口為起點，合成新鏈，并將“舊鏈”剝離，被剝離的單鏈DNA作為模板與擴增引物結合，新合成的雙鏈DNA又恢復了半修飾的內切酶位點，所述切口核酸內切酶將在此位點重新切開一個缺口，這樣就進入下一個擴增循環。上述各反應步驟在恒溫的條件下反復、連續地進行，DNA呈指數擴增，直到原料耗盡或酶活性喪失。依據申請人的實驗，在優化的條件下，30分鐘內靶分子可能被擴增數十億倍。可以理解地是，這種所謂的擴增循環只是依據微觀反應過程進行的簡單化表述，由于全部反應都是在同樣的條件下(恒溫)進行的，從宏觀上看，整個反應過程是持續的，不會出現象PCR那樣的周期性循環。
所述單堿基延伸是在恒溫擴增后進行的，加入同種標記的ddNTP(如ddGTP和ddATP)，加入特異標記的延伸引物，以上述恒溫擴增產物為模板，在DNA聚合酶作用下將ddNTP延伸上去，進行SBE反應。針對一個特定突變位點，延伸引物也可以設計兩條正向延伸引物和反向延伸引物，但延伸引物的3’端堿基必須緊挨于突變堿基，檢測時可以選擇其中的任意一條引物進行SBE，并根據所選擇的延伸引物加入相應的ddNTP。采用通過條帶顏色顯示特定基因或基因SNP檢測結果的試紙條進行檢測，以試紙條上有無特異顏色的條帶進行分型，若只有加入ddGTP或ddATP情況下的試紙條出現條帶，表明被檢者該位點基因型為野生型或純合突變型，若未加入ddGTP或ddATP情況下的試紙條也出現條帶，則表明其該位點基因型為雜合突變型。
參見附圖，本發明的基因缺陷篩查診斷試劑盒的盒體一般應為封閉的，并設有蓋。這樣整個檢測過程，包括核酸擴增、單堿基延伸和試紙條檢測在內，都是封閉進行的，反應體系的所有反應物(包括試劑)放置在同一試劑包裝中，反應自動按順序完成，核酸產物一直被密封在試劑包裝(盒體)內，不造成核酸擴增物污染。并且，這種試劑盒體積小，可以非常方便地攜帶和使用。
所述盒體上可以設有透明的窗口，盒體內用于檢測的試紙條放置在該窗口的內側，不用打開盒體就可以方便地觀察到試紙條顏色。
由于用試紙條檢測蛋白質在國內外已是通用試劑，可以借鑒試紙條檢測蛋白質的技術實現試紙條對核酸的檢測。
所述試紙條上可以設有納米級(一般在40nm左右)的乳膠顆粒，所述乳膠顆粒上標記有特異性的核酸或蛋白質分子。所述試劑還可以包括特定的核酸探針，根據特異性免疫反應的原理，通過所述特定的核酸探針，可以把擴增后的待測產物和連著乳膠顆粒的核酸或蛋白質分子連成一體，以達到檢測目的。如果試紙條出現顯色效果，可判斷檢測的樣品為陽性，如果無目標檢測物，則特異性探針將不能把擴增產物與標記物連接，導致無法顯色。
所述用于合成DNA的原料可以是相應4種脫氧核苷酸的混合物，各種試劑可以依照適宜的比例溶入蒸餾水，以方便使用。
本發明試劑盒涉及的各種試劑均可以采用關于基因恒溫擴增方法和基因恒溫檢測方法的技術內容，這些技術特征均可以體現在試劑盒中，故不再贅述。
權利要求
1.一種基因恒溫擴增方法，其特征在于采用內切酶對待擴增的靶蒂娜進行切割，在靶蒂娜未被修飾的一條鏈上切開一個缺口，暴露其末端，DNA聚合酶以該切口為起點，合成新鏈，并將“舊鏈”剝離，被剝離的單鏈DNA被作為模板，用于合成新的雙鏈DNA，由此完成一個擴增循環，進入下一個擴增循環，新合成的DNA被用做下一個擴增循環的靶DNA。
2.如權利要求1所述的基因恒溫擴增方法，其特征在于使用擴增引物同靶DNA特異性雜交，該擴增引物根據具體的被檢測基因特別設計，所述內切酶是所述擴增引物尾部帶有的一段特異性切口核酸內切酶的辨認序列。
3.一種基因恒溫檢測方法，主要包括待檢測基因的恒溫擴增、單堿基延伸和核酸試紙檢測步驟，特征在于所述恒溫擴增步驟為采用內切酶對待擴增的靶蒂娜進行切割，在靶蒂娜未被修飾的一條鏈上切開一個缺口，暴露其末端，DNA聚合酶以該切口為起點，合成新鏈，并將“舊鏈”剝離，被剝離的單鏈DNA被作為模板，用于合成新的雙鏈DNA，由此完成一個擴增循環，進入下一個擴增循環，新合成的DNA被用做下一個擴增循環的靶DNA，如此反復循環。
4.如權利要求3所述的基因恒溫檢測方法，其特征在于使用擴增引物同靶DNA特異性雜交，該擴增引物根據具體的被檢測基因特別設計，所述內切酶是所述擴增引物尾部帶有的一段特異性切口核酸內切酶的辨認序列。
5.如權利要求4所述的基因恒溫檢測方法，其特征在于所述單堿基延伸是在恒溫擴增后進行的，加入同種標記的ddNTP，加入特異標記的延伸引物，以前述恒溫擴增產物為模板，在DNA聚合酶作用下將ddNTP延伸上去，進行SBE反應。
6.如權利要求5所述的基因恒溫檢測方法，其特征在于在所述單堿基延伸步驟種，針對一個特定突變位點，延伸引物可以設計兩條正向延伸引物和反向延伸引物，但延伸引物的3’端堿基必須緊挨于突變堿基，檢測時選擇其中的任意一條引物進行SBE，并根據所選擇的延伸引物加入相應的ddNTP，采用通過條帶顏色顯示特定基因或基因SNP檢測結果的試紙條進行檢測，以試紙條上有無特異顏色的條帶進行分型，若只有加入ddGTP或ddATP情況下的試紙條出現條帶，表明被檢者該位點基因型為野生型或純合突變型，若未加入ddGTP或ddATP情況下的試紙條也出現條帶，則表明其該位點基因型為雜合突變型。
7.一種基因缺陷篩查診斷試劑盒，其特征在于其試劑包括用于恒溫擴增的核酸內切酶、用于恒溫擴增的引物、用于恒溫擴增的DNA聚合酶和用于合成蒂娜的混合原料，還包括用于DNA檢測并顯示檢測結果的核酸試紙條。
8.如權利要求7所述的基因缺陷篩查診斷試劑盒，其特征在于同一個試劑盒中有與若干種基因缺陷相關的若干種基因或基因SNP的檢測試劑和試紙條，盒體是封閉的，并設有蓋，還設有透明的窗口，盒體內用于檢測的試紙條放置在該窗口的內側，盒內放置有一種或多種基因所需的試劑和試紙條。
9.如權利要求7所述的基因缺陷篩查診斷試劑盒，其特征在于其特征在于使用擴增引物同靶DNA特異性雜交，該擴增引物根據具體的被檢測基因特別設計，所述內切酶是所述擴增引物尾部帶有的一段特異性切口核酸內切酶的辨認序列。
10.如權利要求4所述的基因恒溫檢測方法，其特征在于所述單堿基延伸是在恒溫擴增后進行的，加入同種標記的ddNTP，加入特異標記的延伸引物，以前述恒溫擴增產物為模板，在DNA聚合酶作用下將ddNTP延伸上去，進行SBE反應，所述延伸引物可以設計兩條正向延伸引物和反向延伸引物，但延伸引物的3’端堿基必須緊挨于突變堿基，檢測時選擇其中的任意一條引物進行SBE，并根據所選擇的延伸引物加入相應的ddNTP，采用通過條帶顏色顯示特定基因或基因SNP檢測結果的試紙條進行檢測，以試紙條上有無特異顏色的條帶進行分型，若只有加入ddGTP或ddATP情況下的試紙條出現條帶，表明被檢者該位點基因型為野生型或純合突變型，若未加入ddGTP或ddATP情況下的試紙條也出現條帶，則表明其該位點基因型為雜合突變型。
全文摘要
本發明涉及一種基因恒溫擴增方法、一種基因恒溫檢測方法以及一種基因缺陷篩查診斷試劑盒。其采用內切酶對待擴增的靶蒂娜進行切割，在靶蒂娜未被修飾的一條鏈上切開一個缺口，暴露其末端，DNA聚合酶以該切口為起點，合成新鏈，并將“舊鏈”剝離，被剝離的單鏈DNA被作為模板，用于合成新的雙鏈DNA，并使用擴增引物同靶DNA特異性雜交，該擴增引物根據具體的被檢測基因特別設計，所述內切酶是所述擴增引物尾部帶有的一段特異性切口核酸內切酶的辨認序列，在進入下一個擴增循環，前一循環合成的DNA被用作靶DNA。本發明在恒溫下進行DNA擴增，極大地減化了設備和操作，降低了投資，其試劑盒便于攜帶，可用于各種基因檢測。
文檔編號C12Q1/68GK1844385SQ200610080869
公開日2006年10月11日 申請日期2006年5月19日 優先權日2006年5月19日
發明者甄二真 申請人:安邁利科技發展(北京)有限公司