專利名稱：一種禽類精原干細胞的體外培養方法
技術領域：
本發明涉及轉基因，動物克隆，珍稀動物的保存及組織與細胞工程等領域。
背景技術：
精原干細胞(SSCs)是精子形成的前體細胞，是一種具有自我更新和多向分化潛能的多能干細胞。隨著精原干細胞體外培養技術、凍存技術和移植技術的不斷發展和成熟，使精原干細胞的應用成為可能。且精原干細胞在人類醫學、建立轉基因動物模型及瀕危動物保護上都有很重要的意義。對精原干細胞的研究逐漸成為干細胞研究領域里的一個熱點。由于禽類獨特的生殖生理結構和解剖學特點，使得對禽類組織與細胞工程、轉基因及動物克隆方面的研究極少。
自1994年Brister和Zimmerman將可育小鼠的精原干細胞移植到不育小鼠的睪丸中并觀察到精子產生以及1996年Clonthier將大鼠睪丸生殖細胞移植到免疫缺陷小鼠并產生精子之后，精原細胞逐漸成為一個研究熱點。李德雪、尹明等人對小鼠精原干細胞體外培養的條件及分裂增殖的現象進行了研究。精原干細胞的培養條件、鑒定方法和移植技術都在不斷的更新和完善。
研究表明，在有飼養層的基礎上，以DMEM為基礎培養基并加入一些添加劑及某些生長因子對哺乳動物精原干細胞的體外存活、分裂增殖及克隆形成具有良好作用，但對于雞胚胎精原干細胞的長期培養及建系等方面的研究報道很少，仍沒有摸索到最適的體外培養及傳代條件。
發明內容
本發明的目的是提供一種禽類精原干細胞的體外培養方法，為雞精原干細胞的體外培養，對雞精原干細胞長期培養體系及精原干細胞移植、轉基因等技術提供必要的基礎，給體外研究細胞的發育分化提供較好的材料。
本發明的技術方案是，一種禽類精原干細胞的體外培養方法，其特征在于將雞胚SSCs接種到雞胚成纖維(CEF)飼養層上，再使用通過實驗摸索出的最適培養液進行培養。所用培養液為在DMEM高糖培養基中添加10％小牛血清、2％雞血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸鈉、5.5×10-5mol/L β-巰基乙醇、10μl/ml非必需氨基酸、15-20ng/mlhSCF、10U/ml mLIF、10-15ng/ml bFGF、0.04ng/ml hIL-11、10ng/ml IGF、100U/ml硫酸慶大霉素。
本發明獲得禽類精原干細胞長期體外培養的有效方法，為利用雞精原干細胞進行體外操作和雞胚胎精原干細胞的進一步建系奠定研究基礎。優點如下1、操作簡便，可重復性強，可以滿足一般利用SSCs進行體外操作的要求。
2、可以在體外對SSCs進行較長時間的培養，使其大量增殖，進行細胞與組織工程操作。
3、所獲得的SSCs可進行轉基因、動物克隆、嵌合體雞的制備。
圖1為原代SSCs培養48小時形成的集落×200。
圖2為原代SSCs培養96小時形成的集落×200。
圖3為第2代SSCs培養48小時形成的集落×200。
圖4為第2代SSCs的AKP染色×200。
圖5為雞SSCs的SSEA-1染色鑒定×200。
具體實施例方式
實施例步驟1雞胚胎SSCs的分離取出殼一周內的雛雞，無菌獲取雞睪丸，用PBS中浸洗三次，在解剖鏡下剝去白膜等。加入適量的PBS用力吹打。首先用10倍于組織塊體積的膠原酶(1mg/mL)消化，在37℃、5％CO2濃度條件下作用5～8分鐘，其作用除去精曲小管的間質細胞和一些血管成分，之后用透明質酸酶(1.5mg/mL)和胰蛋白酶(0.25％)的混合液消化3～5分鐘，獲取生精上皮上的SSCs和支持細胞，以消化液用量10％的FCS終止消化，未消化的組織成分用350目過濾篩過濾除去。過濾液以1000r/分鐘離心8分鐘，棄上清，用培養液重新懸浮細胞制成單細胞懸液，進行臺盼藍染色計算活細胞數，調整細胞濃度至104個/ml后接種到長有CEF飼養層的培養瓶中進行培養。
步驟2雞胚胎SSCs體外培養后的生物學特性檢測分別用形態學鑒定、堿性磷酸酶(AKP)染色、階段特異性胚胎表面抗原(SSEA-1)檢測鑒定雞胚胎SSCs。形態學鑒定如圖步驟3雞胚胎SSCs的體外培養制備培養液培養液DMEM高糖培養基，添加10％小牛血清、2％雞血清、2mmol/LL-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸鈉、5.5×10-5mol/L β-巰基乙醇、10μl/ml非必需氨基酸、15-20ng/ml hSCF、10U/ml mLIF、10-15ng/ml bFGF、0.04ng/ml hIL-11、10ng/ml IGF、100U/ml硫酸慶大霉素。
上述DMEM(Dulbecco’s modify Eagle’s medium)，即杜貝克氏改良的恩格氏培養液。
通過對SSCs進行體外原代培養及繼代培養，摸索出了適合SSCs在體外長期存活的較好培養體系，在有飼養層存在的條件下，在此培養體系中，SSCs生長良好，貼壁速度快，克隆形成率高，1-4代的SSCs有AKP陽性克隆形成，克隆形成率分別為47％、36％、26％、13％。由此說明，使用CEF飼養層和添別有細胞因子的培養液最適于雞SSCs的體外培養和增殖，是最佳的培養體。
權利要求
1.一種禽類精原干細胞的體外培養方法，其特征在于將禽類精原干細胞接種到雞胚成纖維飼養層上，再使用培養液進行培養；所述培養液為在DMEM高糖培養基中添加10％小牛血清、2％雞血清、2mmol/LL-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸鈉、5.5×10-5mol/Lβ-巰基乙醇、10μl/ml非必需氨基酸、15-20ng/ml hSCF、10U/ml mLIF、10-15ng/ml bFGF、0.04ng/ml hIL-11、10ng/ml IGF、100U/ml硫酸慶大霉素。
全文摘要
本發明公開了一種禽類精原干細胞的體外培養方法，涉及轉基因，動物克隆，珍稀動物的保存及組織與細胞工程等領域。將禽類精原干細胞接種到CEF飼養層上，再使用在DMEM高糖培養基中添加10％小牛血清、2％雞血清、2mmol/L L－谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸鈉、5.5×10
文檔編號C12N5/06GK1935984SQ200610096629
公開日2007年3月28日 申請日期2006年10月13日 優先權日2006年10月13日
發明者李碧春, 魏彩霞, 陳國宏, 孫思宇, 吳信生, 趙文明, 徐琪, 吳洪, 周冠月, 孫國波, 戴建明, 孫鵬翔, 葛劍輝 申請人:揚州大學