專利名稱：糜子抗旱基因s－腺苷甲硫氨酸合成酶基因及其用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術領域。特別涉及一個來源于糜子的抗旱基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因，其編碼蛋白及其在培育抗旱和水分高效利用植物中的用途。
背景技術：
分離抗旱相關基因，并獲得轉基因植物是植物抗旱性遺傳改良的一個重要途徑。通過多種分子生物學方法分離耐旱生物(如微生物、植物和動物)與生物水分缺失反應及其調節有關的蛋白質合成酶的相應基因是一種較好的選擇。脯胺酸合成酶基因、海藻糖合成酶基因、傳遞信號和調控基因表達的轉錄因子等基因已從微生物、昆蟲及植物(如山菠菜)等得到克隆，并導入部分植物(如甜菜、煙草、擬楠芥菜、小麥、玉米等)，獲得轉基因植物的耐旱性和耐寒性有所提高，展示了良好的應用潛力。
利用獲得的抗旱基因構建植物表達載體，轉化植物，獲得轉基因植物，為植物育種提供新的抗旱和水分高效利用的新種質，選育出抗旱和水分高效利用的新品種，是提高農業生產力和競爭力的一個重要方面。
糜子(Panicum miliaceum L.)，為禾本科黍屬(Panicum)，起源于我國，在華夏民族的發展中發揮過重要的作用。與其它禾本科作物如小麥、玉米相比，糜子具有耐旱、抗逆、水分利用效率高等特點，是植物抗旱性改良的優異基因資源。經檢索，未發現任何公開或報道糜子抗旱和水分高效利用相關的功能基因克隆的相關文獻。
發明內容
研究表明，利用糜子抗旱和水分高效利用機制提高其它作物(如小麥、玉米等)的抗旱性和水分利用效率，將對提高作物產量、緩解水分供需矛盾具有十分重要的作用。糜子在干旱和復水條件下表達的調控基因是糜子抗旱機制中最重要的成分之一。
本發明的目的在于，提供糜子抗旱基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因及其用途。
本發明通過抑制減法雜交(SSH)技術分別構建了糜子抗旱種質的復水與干旱、復水與正常灌水的cDNA文庫，對文庫中所獲克隆進行了隨機測序，分離獲得的糜子復水EST中有一條(RS-162，GenBank收錄號DW177307)與水稻S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因具有較高的同源性，氨基酸一致性為148/157(94％)，該EST包含有該基因的3’端序列。根據水稻及大麥的S-腺苷甲硫氨酸合成酶的核酸序列，設計了一條簡并的上游引物(5-AGATGGCYGMASTTGAWACC-3)，根據糜子的該EST序列設計了一條下游引物(5-TGAGGTCCACCGATGACAAA-3)。以糜子抗旱種質復水初期的葉片中提取的總RNA反轉錄得到的cDNA為模板，利用這對引物對進行PCR擴增，獲得了一個741bp的片段，克隆測序后，該片段為糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的5’端序列，將該片段與其3’端序列進行拼接，獲得了含有1293bp的糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的全長cDNA序列。該cDNA序列含有5’端非翻譯區的兩個核苷酸，3’端非翻譯區的103個核苷酸，編碼區為1188個核苷酸，編碼396個氨基酸。通過軟件預測，該蛋白的等電點為5.50，分子量為43243.02，定位在細胞骨架里。
本發明的糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的表達模式，經RT-PCR分析表明，該基因在正常情況下表達，在干旱脅迫下(土壤相對含水量為36％)誘導上調表達，重度脅迫下(土壤相對含水量24％)表達水平下降，復水后2h再次上調表達，且表達量最高，隨后下降到正常水平。表明該基因主要參與干旱脅迫初期信號傳導過程，調控相關干旱防御和復水生長的功能基因，是糜子抗旱的關鍵基因，利用它構建表達載體轉化小麥、玉米等作物或其它植物，提高其抗旱性和水分利用效率，具有很大的應用潛力。
圖1是本發明的糜子抗旱S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的全長cDNA序列及推導的該基因編碼蛋白質的氨基酸序列；圖2是糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的保守結構域；圖3是幾種植物S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因序列的多重比較；圖4是幾種植物S-腺苷甲硫氨酸合成酶的氨基酸序列的系統進化樹；圖5是糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因在不同水分處理和復水條件下表達的RT-PCR分析。
以下結合附圖和發明人給出的實施例對本發明作進一步的詳細說明。
具體實施例方式
1.糜子抗旱基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethionine synthetase，SAMS)催化甲硫氨酸和ATP反應生成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，S-腺苷甲硫氨酸參與甲硫氨酸的生物合成，甲硫氨酸是乙烯及多胺的前體，同時SAM還具有轉甲基、轉硫、轉氨丙基等作用，是一種重要的代謝中間物質。
本發明通過抑制減法雜交(SSH)技術分別構建了糜子抗旱種質的復水與干旱、復水與正常灌水的cDNA文庫，對文庫中所獲克隆進行了隨機測序，分離獲得的糜子復水EST中有一條(RS-162，GenBank收錄號DW177307)與水稻的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因具有較高的同源性，氨基酸一致性為148/157(94％)，該EST包含有該基因的3’端序列。根據水稻及大麥的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的核酸序列，設計了一條簡并的上游引物(5-AGATGGCYGMASTTGAWACC-3)，根據糜子的該EST序列設計了下游引物(5-TGAGGTCCACCGATGACAAA-3)。以糜子抗旱種質復水初期的葉片中提取的總RNA反轉錄得到的cDNA為模板，利用這對引物對進行PCR擴增，獲得了一個741bp的片段，克隆測序的序列分析表明該片段為糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的5’端序列，將該片段序列與3’端序列進行拼接，獲得了一個含有1293bp的糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的全長cDNA序列。
20μL PCR反應體系中包括cDNA第一鏈模板1μL，10×PCR Buffer 2μL，dNTP(2mmol/L)2μL，正向引物(10mmol/L)1μL，反向引物(10mmol/L)1μL，Taq DNA polymerase(5U/μL)0.2μL，ddH2O補齊至20μL。
PCR反應程序為95℃預變性3min，接著進行95℃40s，55℃40s，72℃90s，共35個循環；最后于72℃延伸8min，反應后于4℃保溫。1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。
獲得的糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的全長cDNA序列為1293bp，含有5’端非翻譯區的兩個核苷酸，3’端非翻譯區的103個核苷酸，該基因編碼396個氨基酸(附圖1)。通過軟件預測，該蛋白的等電點為5.50，分子量為43243.02，定位在細胞骨架里。
2.糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因編碼的氨基酸序列的初步分析利用http//wolfpsort.seq.cbrc.jp/對該基因編碼的氨基酸序列進行亞細胞定位分析，結果表明，該糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶定位在細胞骨架里。
利用NCBI的rpsblast對該糜子抗旱基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因編碼的氨基酸序列進行保守結構域比對分析，結果表明該基因含有S-腺苷甲硫氨酸合成酶的三個典型的結構域，N端結構域、中間結構域及C端結構域(附圖2)。
對來源于馬鈴薯(Solanum tuberosum)、擬楠芥菜(Arabidopsisthaliana)、甜菜(Beta vulgaris)、大麥(Hordeum vulgare)、荔枝(Litchichinensis)、番茄(Lycopersicon esculentum)、水稻(Oryza sativa)及糜子(Panicum miliaceum)等8種植物的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因進行了氨基酸序列的多重比較(見附圖3)，結果表明，不同植物的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因相似程度較高。
系統進化樹顯示，這8種植物的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因相似性在92％-97％，該基因在植物的進化中非常保守(見附圖4)。
3.糜子抗旱基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因表達的RT-PCR分析以珍珠粟(Pennisetum glaucum(L.)R.Br，pearl millet)組成型表達的肌動蛋白(actin)基因片段序列為依據，合成了一對擴增糜子組成型表達的肌動蛋白(actin)基因片段的引物，對糜子的mRNA進行RT-PCR擴增獲得了一個171bp的產物，測序比對表明，該片段與水稻肌動蛋白(actin)具有較高的同源性，為糜子actin基因片段，可以此作為內參確定不同處理的模板量。
采用引物(5-GCTGCCAAGAGCATTGTT-3和5-TGATAAGCGTGACAGACCA-3)，分別對糜子抗旱種質材料植株在土壤相對含水量為75％、36％、24％和復水后2h、6h、12h的葉片樣品提取的mRNA進行RT-PCR分析。
20μL反應體系中包括經內參調整的適宜體積的cDNA模板，10×PCRBuffer 2μL，dNTP(2mmol/L)2μL，正向引物(10mmol/L)0.5μL，反向引物(10mmol/L)0.5μL，Taq DNA polymerase(5U/μL)0.2μL，ddH2O補齊至20μL。
PCR反應程序為95℃預變性3min，接著進行95℃40s，55℃45s，72℃40s，共35個循環；72℃延伸8min，反應后于4℃保溫。1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。
RT-PCR分析表明(見附圖5)，該糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因在正常情況下有一定量的表達，在干旱脅迫下(土壤相對含水量為36％)誘導表達，重度脅迫下(土壤相對含水量24％)表達受到抑制，復水后2h表達量最高，隨后下降到比正常生長還低的水平。說明該基因主要參與干旱脅迫初期信號傳導過程，從而調控相關干旱防御的功能基因。
本發明的糜子抗旱基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因來源于最抗旱的禾本科作物糜子，為改良禾本科作物的抗旱性和水分利用效率提供了更好的基因。
該基因屬于信號傳導相關基因，可以啟動下游一系列與抗旱及水分高效利用基因的表達，更便于應用到植物抗旱性和水分利用效率的改良，有效地提高植物的抗旱性和水分利用效率。
發明人給出了以下具體的實施例。
實施例1以該基因與含有相應植物啟動子(如CaMV 35，actin啟動子等)的表達載體連接，構建糜子抗旱基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的表達載體，轉化大腸桿菌等獲得含有該基因的菌株；或者將該基因與含有相應植物啟動子(如CaMV 35，actin啟動子等)的T-DNA雙元載體等連接，構建糜子抗旱基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的T-DNA表達載體，轉化大腸桿菌等獲得含有該基因的菌株，與相應的農桿菌株系進行融合，獲得含有該基因的農桿菌菌株。
實施例2對實施例1中獲得的大腸桿菌菌株或農桿菌菌株進行繁殖，提取含有糜子抗旱基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的表達載體的DNA或直接利用繁殖獲得的菌液，采用本領域工作人員共知的方法(如花粉管通道法、基因槍法、農桿菌介導法等)轉化小麥、玉米等作物或其它植物；篩選獲得該基因恰當表達的轉基因植株，改良現有作物或植物品種的抗旱性和水分利用效率。
糜子抗旱基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的cDNA序列1 AG GCTGAAGTTGAAACCTTCCTCTTCACCTCGGAGTCTGTGAACGAGGGACACCCTGAC63AAGCTCTGCGATCAGGTCTCAGATGCCGTGCTCGACGCTTGCCTTGCTGAGGACCCTGAC123 AGCAAGGTTCCTTGCGAGACATGCACCAAGACTAACATGGTCATGGTCTTTGGTGAGATC183 ACCACCAAGGCCAATGTCGACTACGAGAAGATTGTCAGGGAGACTTGCCGCAACATTGGT243 TTCGTGTCAGCAGATGTTGGGCTTGACGCTGACCACTGCAAGGTGCTCGTGAACATTGAG303 CAGCAGTCCCCTGATATTGCTCAGGGTGTGCATGGTCACTTCACAAAGCGCCCTGAGGAG363 ATTGGAGCTGGTGACCAGGGACACATGTTTGGGTATGCGACTGATGAAACCCCTGAGCTG423 ATGCCCCTCAGCCATGTCCTTGCAACCAAGCTTGGTGCTCGCCTCACTGAGGTGCGCAAG483 AACGGGACCTGCCCCTGGCTCAGGCCTGATGGAAAGACCCAGGTGACTGTTGAGTACCGC543 AATGAGGGTGGTGCCATGGTGCCCATCCGCGTCCACACTGTCCTCATCTCTACCCAGCAC603 GACGAGACAGTCACCAACGATGAGATTGCCGCTGACCTCAAGGAGCACGTCATCAAGCCT663 GTCATCCCTGAGCAGTACCTTGATGAGAAGACCATCTTCCACCTTAACCCATCTGGTCGC723 TTTGTCATCGGTGGACCTCATGGTGATGCTGGTCTCACTGGCCGGAAGATCATCATTGAT783 ACCTATGGTGGCTGGGGAGCCCACGGTGGTGGTGCTTTCTCTGGCAAGGACCCGACCAAG843 GTTGACCGCAGTGGAGCCTACATTGCAAGGCAGGCTGCCAAGAGCATTGTTGCTAACGGC903 CTTGCTCGCCGCGCCATCGTCCAGGTCTCCTACGCCATTGGTGTGCCAGAGCCGCTCTCC963 GTGTTTGTGGACACATACGGCACTGGCACGATCCCCGACAAGGAGATCCTCAAGATTGTG1023 AAGGAGAACTTTGACTTCAGGCCTGGCATGATCATCATCAACCTCGACCTCAAGAAAGGT1083 GGCAACGGGCGCTACCTTAAGACAGCGGCCTACGGTCACTTCGGAAGGGATGACCCTGAC1143 TTCACCTGGGAGGTGGTGAAGCCCCTCAAGTGGGAGAAGCCTTCTGCC GGTGCCCTT1203 TTGGAAGAAGCTTTTGGTCTGTCACGCTTATCATGTTTTGTGGCTTCTGTGTTGTGCTTC1263 TTGATCTGCCCCTTGCTGTCATTTGTATTGT
權利要求
1.糜子抗旱基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因，其特征在于，編碼該基因的cDNA序列為1293bp，含有5’端非翻譯區的兩個核苷酸，3’端非翻譯區的103個核苷酸，編碼框為1188個核苷酸，編碼396個氨基酸；該基因的cDNA序列為 63AAGCTCTGCGATCAGGTCTCAGATGCCGTGCTCGACGCTTGCCTTGCTGAGGACCCTGAC123 AGCAAGGTTCCTTGCGAGACATGCACCAAGACTAACATGGTCATGGTCTTTGGTGAGATC183 ACCACCAAGGCCAATGTCGACTACGAGAAGATTGTCAGGGAGACTTGCCGCAACATTGGT243 TTCGTGTCAGCAGATGTTGGGCTTGACGCTGACCACTGCAAGGTGCTCGTGAACATTGAG303 CAGCAGTCCCCTGATATTGCTCAGGGTGTGCATGGTCACTTCACAAAGCGCCCTGAGGAG363 ATTGGAGCTGGTGACCAGGGACACATGTTTGGGTATGCGACTGATGAAACCCCTGAGCTG423 ATGCCCCTCAGCCATGTCCTTGCAACCAAGCTTGGTGCTCGCCTCACTGAGGTGCGCAAG483 AACGGGACCTGCCCCTGGCTCAGGCCTGATGGAAAGACCCAGGTGACTGTTGAGTACCGC543 AATGAGGGTGGTGCCATGGTGCCCATCCGCGTCCACACTGTCCTCATCTCTACCCAGCAC603 GACGAGACAGTCACCAACGATGAGATTGCCGCTGACCTCAAGGAGCACGTCATCAAGCCT663 GTCATCCCTGAGCAGTACCTTGATGAGAAGACCATCTTCCACCTTAACCCATCTGGTCGC723 TTTGTCATCGGTGGACCTCATGGTGATGCTGGTCTCACTGGCCGGAAGATCATCATTGAT783 ACCTATGGTGGCTGGGGAGCCCACGGTGGTGGTGCTTTCTCTGGCAAGGACCCGACCAAG843 GTTGACCGCAGTGGAGCCTACATTGCAAGGCAGGCTGCCAAGAGCATTGTTGCTAACGGC903 CTTGCTCGCCGCGCCATCGTCCAGGTCTCCTACGCCATTGGTGTGCCAGAGCCGCTCTCC963 GTGTTTGTGGACACATACGGCACTGGCACGATCCCCGACAAGGAGATCCTCAAGATTGTG1023 AAGGAGAACTTTGACTTCAGGCCTGGCATGATCATCATCAACCTCGACCTCAAGAAAGGT1083 GGCAACGGGCGCTACCTTAAGACAGCGGCCTACGGTCACTTCGGAAGGGATGACCCTGAC 1203 TTGGAAGAAGCTTTTGGTCTGTCACGCTTATCATGTTTTGTGGCTTCTGTGTTGTGCTTC1263 TTGATCTGCCCCTTGCTGTCATTTGTATTGT。
2.權利要求1所述的糜子抗旱基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因，用于與相應的植物啟動子連接，構建糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的表達載體或轉化獲得糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的宿主菌的用途。
3.如權利要求2所述的用途，其特征在于，通過基因槍、農桿菌介導或花粉管通道等方法進行遺傳轉化將糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的表達載體導入小麥、玉米等作物或其它植物，獲得抗旱性和水分利用效率得到改良的轉基因植物細胞系及轉基因植株。
全文摘要
本發明公開了糜子抗旱基因S－腺苷甲硫氨酸合成酶基因及其用途，該基因的cDNA序列為1293bp，包含5’端非翻譯區的兩個核苷酸，3’端非翻譯區的103個核苷酸，編碼396個氨基酸。該基因編碼蛋白的等電點為5.50，分子量為43243.02，定位在細胞骨架里。RT－PCR表達模式分析表明，該基因在正常情況下有一定量的表達，在干旱脅迫下(土壤相對含水量為36％)誘導表達，重度脅迫下(土壤相對含水量24％)表達受到抑制，復水后2h表達量最高，隨后下降到正常生長水平。表明該基因主要參與干旱脅迫和復水初期的信號傳導過程，調控與干旱防御和復水生長相關的功能基因，是糜子抗旱的關鍵基因，利用其轉化小麥、玉米等作物和其它作物，提高其水分利用效率，具有很大的應用潛力。
文檔編號C12N9/00GK1908173SQ20061010447
公開日2007年2月7日 申請日期2006年8月7日 優先權日2006年8月7日
發明者胡銀崗, 林凡云 申請人:西北農林科技大學