專利名稱：用于生物合成7α,15α-二羥基雄烯醇酮的發酵培養基的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物留體轉化培養基，具體涉及一種用于生物合成 7a，15a-二羥基雄烯醇酮的微生物發酵培養基。
背景技術：
甾體類中間體往往可用于生產臨床上各種藥物。7a，15a-二羥基雄烯醇 酮(其結構如下式I )<formula>formula see original document page 3</formula>I
是一種重要的甾體中間體，可用于合成內酯類醛固酮受體拮抗劑、利尿劑 和婦科藥物等多種藥物。例如，I是合成口服避孕藥Yasmin活性成分屈 螺酮的重要中間體。
微生物轉化在甾體藥物的合成中具有重要地位，幾種重要的甾體微生 物轉化反應如羥化、脫氫和邊鏈降解己成為工業上生產甾體激素及其類似 物的重要方法。化合物I的制備很難用化學的方法合成，目前主要由微生 物轉化合成。
i可以由去氫表雄酮(其結構如下式n)經微生物轉化合成。
Kieslich(German Patent No. DE 2746298 1979-04-19)描述了以辣椒刺盤孢 (Co〃e驗/c/2謂—moz'cfes ifo 5257)為菌種將II轉化為I的方法；而 Petzoldt等(Angew. Chem. 95(5)， 413—414， 1983; U. S. Patent No. 4435327 1984-03-06)則描述了以亞麻剌盤孢(Co〃e敏/c/z"w cbs 112.21)為菌 種將II轉化為I的方法。但是兩種方法底物的投料濃度很低，只有lg/L，
所以轉化效率很低，工業生產的成本很高。尚珂等(中國醫學生物技術應
用雜志.2， 30 34，2004)報道亞麻刺盤孢(CW/e齢/c/z謂//"/AS 3.4486) 可將II轉化為I ，但是底物投料濃度很低只有2g/L,收率低只有58.8%, 轉化率也較低，約為70%。可見已有的轉工藝不能高效的合成I ，急需更 為有效的轉化工藝，以提高底物的投料濃度和轉化率，以降低生產成本。
<formula>formula see original document page 4</formula>
發明內容
為解決上述技術問題，本發明的目的是提供一種以亞麻刺盤孢 (Co〃etoWc/2畫//m'AS 3.4486，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心， 編號AS 3.4486)為菌種，生物合成7a，15ct-二羥基雄烯醇酮的發酵培養基， 包含有機氮源、碳源、無機鹽和金屬離子，其特征在于，所述的有機氮源 為蛋白胨、酵母提取物、牛肉膏、酵母膏。
所述的有機氮源的含量為6g/L 30g/L，優選10g/L 15g/L，更優選 12g/L。
優選地，所述的有機氮源為酵母提取物。 所述的碳源為多糖類碳源。
所述多糖類碳源為糊精、麥芽糊精、淀粉、可溶性淀粉、玉米粉等， 優選為麥芽糊精和可溶性淀粉，更優選麥芽糊精；其含量為20g/L 50g/L， 優選為35g/L。
本發明的發酵培養基還可以含有天然油脂。
所述天然油脂可以為豆油、菜籽油、玉米胚胎油、葵花籽油和棉籽油 等植物油，豬油、羊油、牛油和魚油等動物油脂，以及卵磷脂、磷脂酰甘 油、磷脂酸等磷脂，其含量為0.5g/L 10g/L，較優為2g/L 5g/L，最優為 3g/L。
培養基中還需加入鉀鹽、磷酸鹽、銨鹽和硝酸鹽等無機鹽和鎂等金屬 離子。
不同有機氮源對轉化的影響是很大的，實驗考察了花生餅粉、豆餅粉、 棉籽粉、豆粕、蛋白胨、酵母提取物、牛肉膏和酵母膏九種常用有機氮源，
添加的濃度均為10g/L，底物的投料濃度相同，轉化結束后HPLC檢測各 有機氮源發酵液中產物的濃度(見附圖1)。從圖可以看出有機氮源采用 蛋白胨、酵母提取物、牛肉膏、酵母膏是產物的含量高，其中又以酵母提 取物最高。
不同碳源對轉化也具有明顯的影響，實驗考察了糊精、麥芽糊精、淀 粉、可溶性淀粉、玉米粉、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖和果糖等碳源，添加的 濃度均為30g/L，底物的投料濃度相同，轉化結束后HPLC檢測各碳源發 酵液中產物的濃度(見附圖2)。從圖可以看出糊精、麥芽糊精、淀粉、 可溶性淀粉和玉米粉等多糖類碳源作為碳源時菌種轉化能力較強，而以蔗 糖和麥芽糖等二糖，或葡萄糖和果糖等單糖碳源作為碳源時轉化能力則較 低。
在培養基中加入少量的天然油脂可以促進菌體的生長，同時更好的促 進底物在發酵液中的轉化，實驗選取了豆油、菜籽油、玉米胚胎油、葵花 籽油、豬油、魚油、卵磷脂和磷脂酰甘油等多種天然油脂分別加入培養基， 加入量度為3g/L，以沒有加入天然油脂的培養基作為對照，底物的投料濃 度相同，轉化結束后HPLC檢測各培養基中產物的濃度(見附圖3)。從 圖可以看出加入各類天然油脂后，轉化率都有明顯的提高。
采用本發明發酵培養基合成產物I時，底物投料濃度可以達到8g/L
(底物重量/發酵液體積)，轉化率可以到達85%。而采用現有技術的發酵 培養基合成產物I時，底物投料濃度只有2g/L，轉化率約為70%左右。 因此，通過本發明經過組分優化的發酵培養基來進行I的轉化合成可以很 好地解決現有技術底物投料濃度低和轉化率不高的缺點，從而降低I的工 業生產成本。
圖1表示不同有機氮源對轉化反應的影響；
圖2表示不同碳源對轉化反應的影響；
圖3表示加了天然油脂的培養基對轉化反應的促進作用。
具體實施例方式
以下通過具體的實施例來進一步闡明本發明，但這些實施例不構成對 本發明的限制。其中，酵母提取物為湖北安琪酵母股份有限公司生產，蛋 白胨為上海東海制藥廠生產，牛肉膏為成都市華西生化制品廠生產，酵母 膏、糊精、淀粉、可溶性淀粉、卵磷脂為中國醫藥集團上海化學試劑公司 生產，花生餅粉為北京康明威培養基技術有限責任公司生產，麥芽糊精為 海鹽六和淀粉化工有限公司生產，玉米粉為諸城裕豐制粉有限公司生產， 葵花籽油為青島嘉里植物油有限公司生產，豆油為上海嘉里糧油工業有限 公司生產。
實施例1
i肯養基
斜面培養基PDA培養基(200g土豆煮汁1000ml，葡萄糖20g，瓊 脂20g) ， 12rC滅菌20min。
種子培養基花生餅粉10g/L;糊精30g/L;KCl 1 g/L; (NH4)2HP04 lg/L; K2HP04 lg/L; MgS04.6H20 lg/L。 pH5.5， 121。C滅菌20min。
發酵培養基酵母提取物10g/L;麥芽糊精35g/L;葵花籽油5g/L; KC1
lg/L; (NH4)2HP04 lg/L; K2HP04lg/L; MgS04.6H20 lg/L。 pH5.5， 121 。C滅菌20min。
轉化過程將接種菌種的斜面置于28'C恒溫培養箱中，培養6天，得 到成熟的孢子，然后成熟的孢子接種于裝有30ml種子培養基的250ml搖 瓶中，在3(TC、 230rpm搖床上培養3天，得到成熟的種子，得到的種子 以10%的接種量接入裝有100ml發酵培養基的750ml搖瓶中，置于30°C 、 230r/min搖床繼續培養20小時，以每升發酵液8g底物的量加入底物，置 于28°C 、 240r/min搖床繼續轉化至48小時時放瓶，取發酵液2ml加入8ml 甲醇浸泡過夜，離心取上清用HPLC進行分析，采用外標法對樣品進行定 量，計算轉化率為86.5。％。 HPLC條件為色譜儀Waters510型高效液相色
譜儀；色譜柱C18柱；檢測器Waters 996 Photodiode Array Detector; 流動相甲醇:水二50:50;流速0.8ml/min;進樣量5^1;柱溫室溫。
實施例2
斜面培養基和種子培養基同實施例1。
發酵培養基蛋白胨20g/L;麥芽糊精30g/L;豬油5g/L; KCllg/L;
(NH4)2HP04 lg/L; K2HP04lg/L; MgS04.6H20 lg/L。 pH5.5， 121。C滅菌 20min。
轉化過程同實施例l，最后的轉化率為85.1%。 實施例3
斜面培養基和種子培養基同實施例1。
發酵培養基牛肉膏30g/L;糊精20g/L;卵磷脂lg/L; KC1 lg/L;
(NH4)2HP04 lg/L; K2HP04 lg/L; MgS04.6H20 lg/L。 pH5.5， 121。C滅菌 20min。
轉化過程同實施例1，最后的轉化率為85.3%。
斜面培養基和種子培養基同實施例1。
發酵培養基酵母提取物6g/L;玉米粉50g/L;卵磷脂2g/L; KC1 lg/L;
(NH4)2HP04 lg/L; K2HP04 lg/L; MgS04'6H20 lg/L。 pH5.5， 121。C滅菌 20min。
轉化過程同實施例1，最后的轉化率為84.3。％。
實施例5
斜面培養基和種子培養基同實施例1。
發酵培養基酵母提取物12g/L;麥芽糊精35g/L;豆油0.5g/L; KC1 lg/L; (NH4)2HP04 lg/L; K2HP04 lg/L; MgS04,6H20 lg/L。 pH5.5， 121 。C滅菌20min。
轉化過程同實施例l，最后的轉化率為84.1%。
實施例6
斜面培養基和種子培養基同實施例1。
發酵培養基酵母提取物12g/L;可溶性淀粉35g/L;豆油5g/L; KC1 lg/L; (NH4)2HP04 lg/L; K2HP04lg/L; MgS04.6H20 lg/L。 pH5.5， 121 。C滅菌20min。
轉化過程同實施例l，最后的轉化率為86.1%。
實施例7
斜面培養基和種子培養基同實施例1。
發酵培養基酵母提取物12g/L;麥芽糊精35g/L;豆油10g/L; KC1 lg/L; (NH4)2HP04 lg/L; K2HP04 lg/L; MgS04.6H20 lg/L。 pH5.5， 121 。C滅菌20min。
轉化過程同實施例l，最后的轉化率為87.1%。
實施例8
7.5L發酵罐轉化合成I 各培養基同實施例4
轉化過程將接種菌種的斜面置于28t:恒溫培養箱中，培養6天，得 到成熟的孢子，然后成熟的孢子接種于裝有100ml種子培養基的750ml搖 瓶中，在30。C、 230rpm搖床上培養3天，得到成熟的種子，得到的種子 以10X的接種量接入4.5L的發酵培養基中(裝于7.5L發酵罐中)，溫度 30°C，通氣量0.4VVM，轉速180rpm進行培養。培養20小時后，以每升發 酵液8g底物的量加入底物，然后溫度調至28"C開始轉化，在轉化過程中 通過增加轉速和通氣量控制溶氧在20%飽和度以上。轉化過程中用薄層層 析法確定轉化程度，分析方法取少量轉化液于離心管中，加入等體積乙 酸乙酯，經超聲波細胞破碎后于4000r/min、 25。C離心6min，取少量上清 點板，展開劑為三氯甲烷:無水乙醇二10: 1(V/V),以10%硫酸溶液噴灑 后加熱顯色，觀察斑點情況，確定轉化程度。到48小時時產物停止積累， 結束轉化放罐，HPLC分析轉化率為85.4%。
權利要求
1.一種以亞麻刺盤孢(Colletotrichum lini AS 3.4486)為菌種，生物合成7α，15α-二羥基雄烯醇酮的發酵培養基，包含有機氮源、碳源、無機鹽和金屬離子，其特征在于，所述的有機氮源為蛋白胨、酵母提取物、牛肉膏、酵母膏。
2. 如權利要求1所述的發酵培養基，其特征在于，所述的有機氮源的 含量為6g/L 30g/L。
3. 如權利要求1或2所述的發酵培養基，其特征在于，所述的有機氮源 為酵母提取物，其含量為10g/L 15g/L。
4. 如權利要求1所述的發酵培養基，其特征在于，所述的碳源為多糖 類碳源。
5. 如權利要求4所述的發酵培養基，其特征在于，所述多糖類碳源為 糊精、麥芽糊精、淀粉、可溶性淀粉、玉米粉；其含量為20g/L 50g/L。
6. 如權利要求5所述的發酵培養基，其特征在于，所述多糖類碳源為 為麥芽糊精或可溶性淀粉，其含量為35g/L。
7. 如權利要求1所述的發酵培養基，其特征在于，所述培養基還含有 天然油脂。
8. 如權利要求7所述的發酵培養基，其特征在于，所述天然油脂為植 物油、動物油脂或磷脂。
9. 如權利要求8所述的發酵培養基，其特征在于，所述植物油為豆油、 菜籽油、玉米胚胎油、葵花籽油、棉籽油；所述動物油脂為豬油、羊油、 牛油、魚油；所述磷脂為卵磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酸。
10. 如權利要求7所述的發酵培養基，其特征在于，所述天然油脂的含 量為0.5g/L 10g/L。
11. 如權利要求10所述的發酵培養基，其特征在于，所述天然油脂的 含量為2g/L 5g/L。
全文摘要
本發明公開了一種以亞麻刺盤孢(Colletotrichum lini AS 3.4486)為菌種，生物合成7α，15α-二羥基雄烯醇酮的發酵培養基，包含有機氮源、碳源、無機鹽和金屬離子，其特征在于，所述的有機氮源為蛋白胨、酵母提取物、牛肉膏、酵母膏。采用本發明發酵培養基合成產物I時，底物投料濃度可以達到8g/L(底物重量/發酵液體積)，轉化率可以到達85％。因此，可以很好地解決現有技術底物投料濃度低和轉化率不高的缺點，從而降低I的工業生產成本。
文檔編號C12P33/06GK101191141SQ200610118510
公開日2008年6月4日 申請日期2006年11月20日 優先權日2006年11月20日
發明者琴 張, 胡海峰, 陶榮盛 申請人:上海醫藥工業研究院