專利名稱：微生物酶法制備大豆異黃酮苷元的方法
技術領域：
本發明涉及同大豆異黃酮制作大豆異黃酮苷元的方法，特別是涉及微生物酶法由β-葡萄糖苷酶轉化為大豆異黃酮苷元的制備方法。
背景技術：
大豆異黃酮(sorbean isoflovone)是指以3-苯基色原酮為母核的一類化合物，是具有多種生物活性的大豆營養成份。目前，科學家已經發現的大豆異黃酮共有15種異構體，分為游離型的苷元和結合型的糖苷兩大類。其中糖苷約占大豆異黃酮總量的95-98％(w/w)，苷元占大豆異黃酮總量的2-5％(w/w)。日本東京rakult微生物研究中心最新研究表明游離型的苷元相對于結合型糖苷分子較小，疏水性更強，所以生物利用性更好。研究還表明大豆中只含有0.5-2.5％的大豆異黃酮，而大豆異黃酮的生物利用率也只有10-40％，這主要是由于糖苷型或其衍生物很難被人體直接吸收。只有生成苷元形式，才易被吸收利用。由此可見，把大豆異黃酮糖苷型及糖苷衍生物轉化成苷元形式，是提高其生物利用率的前提。近年來國外學者的專利報道了制備大豆苷元的方法有利用商品酶(如β-葡萄糖苷酶、酯酶等)將異黃酮水解成苷元，利用化學方法合成、提取大豆苷元，強酸、強堿水解方法制備大豆苷元，這些方法由于存在著操作復雜、收率低、反應條件劇烈、成本高、有機溶劑殘留造成環境污染等缺點，都未能得到廣泛的應用。已經公開的黑龍江雙河松嫩大豆生物工程有限責任公司的200410058379.3號專利申請，披露了用β-葡萄糖和膜技術生產大豆異黃酮苷元的工藝方法，該方法是以大豆異黃酮粉為基本原料，以大豆蛋白和大豆異黃酮作誘導劑，用培養霉菌釋放的胞外酶β-葡萄糖苷酶水解大豆異黃酮，并利用選自超濾和透析的膜技術進行酶水解液的后處理，得到大豆異黃酮苷元。該方法在原料適用性和工藝方面還存在一定缺陷1、由于采用含量20％以上的大豆異黃酮粉，轉化率達90％以上，實驗表明，如大豆異黃酮粉含量低于20％，轉化率會明顯降低；特別是原料含量低于10％時，如果采用上述工藝，會因為雜質多，大大增加過濾精制成本；2、工藝流程較長，發酵制備β-葡萄糖苷酶原料較多，對過濾設備及技術條件要求較苛刻。本發明與現有技術相比，不受原料純度的限制，其工藝條件的設計同樣適應低于20％的原料純度，轉化率均達到90％以上，在制作成本和原料的適應性方面具有更大的優勢。
發明內容
本發明的目的是克服現有技術存在的不足，提供一種微生物酶法制備大豆異黃酮苷元的方法，該方法不受原料純度限制，在原料成份低于20％，甚至更低時，仍然具有較高轉化率，并且工藝流程縮短，轉化成本低，生物利用率明顯提高，可直接用作醫藥、保健食品原料。
本發明方法即微生物酶法制備大豆異黃酮苷元的方法，是以大豆異黃酮粉為原料，用培養米曲霉菌發酵制備β-葡萄糖苷酶，將大豆異黃酮苷轉化為大豆異黃酮苷元，其特征是該制備方法包括以下步驟a)所述原料為2～90％的大豆異黃酮粉；b)篩選的菌種為米曲霉菌3042，用該菌種制備種子培養液；c)制備固體發酵培養基，得到含有β-葡萄糖苷酶的發酵物；d)將大豆異黃酮粉加入到經發酵提取的β-葡萄糖苷酶溶液中制取酶的轉化液，再進行離心固液分離，沉淀物低溫干燥得到大豆異黃酮苷元。
本發明更詳細的制備大豆異黃酮苷元的方法包括以下步驟一、原料基本原料為2～90％的大豆異黃酮粉，本發明工藝也同樣適于含量為5～20％的大豆異黃酮粗粉。
二、菌種篩選用菌種為米曲霉菌(Aspergillus oryzae)3042菌種斜面傳代培養基制備方法PDA培養基制備法三、固體發酵法制備β-葡萄糖苷酶及純化、酶活力測定
1、種子培養液的制備及培養方法可溶性淀粉2％，葡萄糖1％，磷酸二氫鉀0.1％，硫酸鎂0.1％，酵母膏0.5％，硝酸鈉0.2％，PH自然，于121℃滅菌15min；無菌操作，挑取適量新鮮斜面上的孢子轉入到80ml種子培養基中，于20～28℃、160～180r/min震蕩培養38～48hr。
2、固體發酵培養基及培養方法將麩皮∶水按照1∶1.5～3.0的重量比配合，PH自然，121℃滅菌30min，以1～7％的接種量將制備好的種子接入固體培養基中發酵培養，培養20～28℃，濕度60～70％，培養時間60～84hr，得到含β-葡萄糖苷酶的固體發酵物；3、β-葡萄糖苷酶粗酶液的提取將上述固體發酵物加入10倍量的蒸餾水，攪拌均勻浸泡2～6hr，于4～10℃，5000～10000r/min條件下離心進行液固分離，所得上清液為β-葡萄糖苷酶粗酶液。
4、β-葡萄糖苷酶初步純化為便于保存，需對粗酶液進行純化處理，將粗酶液用75％的乙醇，于4～10℃下進行醇沉過夜，在此溫度下以5000～10000r/min離心分離，沉淀物用蒸餾水溶解得到初步純化的β-葡萄糖苷酶液，或在-40～-50下冷凍干燥獲得固體β-葡萄糖苷酶。初步純化后，用DEAE-sephadexA-50離子交換樹脂純化，用SDS測定β-葡萄糖苷酶的分子量為45kb。
5、β-葡萄糖苷酶的活力測定方法(1)葡萄糖標準曲線的制作采用分光光度法。取8只帶有刻度的比色管，精密吸取葡萄糖標準使用液(1mg/ml)0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4ml；用蒸餾水補充2ml；分別加入1.5mlDNS試液，沸水浴5min，用蒸餾水定溶至10ml，于540nm比色，繪制標準曲線。
(2)樣品中β-葡萄糖苷酶活力的測定取4只帶有刻度的比色管，分別加入0.5％的水楊苷0.5ml，對照管加入DNS試液1ml，將樣品管與對照管同時放在50℃環境下水浴5min；各管分別加入酶液0.5ml，50℃水浴30min后，樣品管加入DNS試液1ml，沸水浴5分鐘，用蒸餾水定容至10ml，于540nm波長測定吸光度值。酶活單位規定為每小時由底物生成1umol的葡萄糖所需要的酶量為一個酶活單位(U)。
四、大豆異黃酮的β-葡萄糖苷酶生物轉化本步驟用以轉化的酶液可以是上述步驟中制取的粗酶液或經過純化的酶液。
1、大豆異黃酮苷元的制備原料與β-葡萄糖苷酶的比例為1000～4000U/g，轉化溫度40～50℃，PH4.5～7.0，攪拌速度為160～180r/min，轉化時間6～10hr，得到酶的轉化液，再將該轉化液于4～10℃，5000～10000r/min的條件下離心進行液固分離，沉淀物低溫干燥得到大豆異黃酮苷元。
2、分離液的處理轉化液進行液固分離后的上清液用75％食用乙醇進行醇沉淀過夜，在4～10℃，5000～10000r/min條件下離心進行液固分離，沉淀的β-葡萄糖苷酶，用蒸餾水溶解，測定酶活力后重新利用；回收上清液中乙醇，獲得浸膏于50～80℃減壓干燥得大豆異黃酮苷元，與轉化后第一次液固分離得到的大豆異黃酮苷元合并。
本發明與現有技術相比具有如下優點1、不受原料純度限制，在原料含量2～20％時，轉化率仍能達到90％以上，工藝流程明顯縮短，轉化成本低，生物利用率提高數10倍，可直接用作醫藥、保健食品原料；2、利用米曲3042發酵生產的Bata-葡萄糖苷酶進行大豆異黃酮的轉化無有機溶劑殘留，工藝簡單、操作性強、可規模化生產；3、培養基成份簡單，培養條件易控制，轉化所用的酶及乙醇都可重復回收利用，無環境污染；4、提高了大豆異黃酮的生物利用率及生物活性，填補了高活性大豆異黃酮制備工藝的空白。
下面用具體的實施例說明本發明的方法，本發明的具體實施例中的實施方式不會構成對本發明保護范圍的任何限制。
附圖
為本發明的工藝流程示意圖。
實施例1原料采用含量10％的大豆酮黃酮粗粉(天津尖峰天然產物有限公司產品)菌種米曲霉菌(Aspergillus oryzae)3042上海釀造研究所菌種斜面傳代培養基制備方法PDA培養基制備1、固體發酵法β-葡萄糖苷酶的制備及酶活力測定(1)種子培養基的制備及其菌種培養精密稱取可溶性淀粉10.0g，葡萄糖5.0g，磷酸二氫鉀0.5g，硫酸鎂0.5g，酵母膏2.5g，硝酸鉀1.0g，用蒸餾水溶解并稀釋至500ml，PH6.5，分裝到500ml三角瓶中，每瓶80ml，121℃滅菌15min。無菌操作，挑取適量的新鮮斜面上米曲3042的孢子轉入到種子培養基中，于27℃、160r/min震蕩培養42h。即得到固體發酵所需要的液體菌種。(注釋以上所需要的化學試劑均為分析純)(2)固體發酵培養基的制備及其菌種的培養稱取麩皮1000g，按照麩皮∶水1∶2(w/v)的比例進行配置固體發酵培養基，PH自然，121℃滅菌30min。無菌操作以5％的接種量將制備好的液體菌種接入固體培養基中，混勻后裝入培養槽內，培養基的厚度約為3cm，在無菌發酵室內發酵培養。培養溫度為27℃，濕度保持在65-70％，培養時間為84小時。
(3)β-葡萄糖苷酶提取及初步純化將上述固體發酵物按照1∶10的比例加入蒸餾水，攪拌均勻，于4℃條件條件下浸泡4小時，在4℃，5000r/min條件下離心，收集上清液即為β-葡萄糖苷酶粗酶液。
取粗酶液500ml，緩慢加入食用酒精，使酒精濃度達75％，4℃條件下醇沉過夜，10000r/min、4℃條件下離心，收集沉淀，用500ml蒸餾水溶解或者在-40℃的條件下冷凍干燥保存。用初步純化的酶液經過DEAE-sephadexA-50離子交換樹脂吸附、氯化鈉溶液梯度洗脫、透析、濃縮后用12％的SDS電泳測定米曲3042β-葡萄糖苷酶分子量在45kb。
(4)β-葡萄糖苷酶活力測定方法a)葡萄糖標準曲線的制作采用分光光度法。取8只帶有刻度的比色管，精密吸取葡萄糖標準使用液(1mg/ml)0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4ml；用蒸餾水補足2ml；分別加入1.5mlDNS試液，沸水浴5min，用蒸餾水定容至10ml，于540nm比色，繪制標準曲線。
b)樣品中β-葡萄糖苷酶活力的測定取4只帶有刻度的比色管，分別加入0.5％的水楊苷0.5ml，對照管加入DNS試液1ml，將樣品管與對照管同時放在50℃環境下水浴5min；各管分別加入酶液0.5ml，50℃水浴30min后，樣品管加入DNS試液1ml，沸水浴5分鐘，用蒸餾水定容至10ml，于540nm波長測定吸光度值。酶活單位規定為每小時由底物生成1umol的葡萄糖所需要的酶量為一個酶活單位(U)。
按照實施案例中的方法制備5批的β-葡萄糖苷酶粗酶液的平均酶活力為1201U/ml，初步純化后的平均酶活力為4750U/ml。
2、大豆異黃酮苷元的制備水解所用的酶液如上所述的粗酶液或者初步純化的酶，所用原料為10％的大豆異黃酮(華北制藥股份有限公司)轉化前大豆苷含量為6.42％、染料木苷含量為2.02％、黃豆苷2.24％、大豆苷元0.46％、木素0.03％、黃豆黃素0.10％。
(1)稱取10％的大豆異黃酮100g，按照底物與酶2250U/g的比例加入粗酶液187.3ml，加入蒸餾水至1000ml(底物濃度為0.1g/ml)，PH自然，在溫度45℃攪拌速度180轉/分條件下，轉化8小時，終止反應，將酶轉化液在10000r/min，4℃條件下離心，收集沉淀于70℃，-0.1Mpa條件下減壓干燥，粉碎后即可得到轉化后的大豆異黃酮粉末80.1g。
(2)向“(1)”步驟中離心收集的上清液中緩慢加入食用酒精至75％，4℃條件下醇沉過夜，10000rmin、4℃條件下離心，收集上清液回收乙醇，獲得的膏體同上述條件減壓干燥，粉碎后得到轉化后的大豆異黃酮粉10.4g。
(3)將兩次得到的產品合并共得到轉化后的大豆異黃酮粉90.5g，用HPLC法測定主要活性成份大豆苷0.347％、染料木苷0.094％、大豆苷元4.667％、染料木素1.227％；大豆苷轉化率為95.1％，染料木苷轉化率95.8％。
3、β-葡萄糖苷酶的回收利用將本制備工序中的第“(2)”步驟中離心后獲得的沉淀部分用適量的蒸餾水溶解與第1工序中第(3)步驟中獲得的粗酶液合并使用。
實施例21、5％大豆異黃酮粉水解制備大豆異黃酮苷元水解所用的酶液同10％大豆異黃酮粉水解實驗所用原料5％大豆異黃酮(用華北制藥股份有限公司生產的10％的大豆異黃酮粉添加1倍量的提取大豆異黃酮后干燥的脫脂豆粉調配而成)轉化前大豆苷含量為3.37％、染料木苷含量為1.12％、黃豆苷1.21％、大豆苷元0.25％、染料木素0.02％、黃豆黃素0.04％。
(1)稱取5％的大豆異黃酮100g，按照底物與酶2300U/g的比例加入粗酶液192ml，加入蒸餾水至1000(底物濃度為0.1g/ml)，PH自然，在溫度45℃攪拌速度180轉/分條件下，轉化8小時，終止反應，將酶轉化液在10000r/min，4℃條件下離心，收集沉淀于70℃。-0.1Mpa條件下減壓干燥，粉碎后即可得到轉化后的大豆異黃酮粉末80.6g。
(2)向“(1)”步驟中離心收集上清液中緩慢加入食用酒精，使酒精濃度至75％，4℃條件下醇沉過夜，10000rmin、4℃條件下離心，收集上清液回收乙醇，獲得的膏體同上述條件減壓干燥，粉碎后得到轉化后的大豆異黃酮粉9.7g。
(3)將兩次得到的產品合并共得到轉化后的大豆異黃酮粉91.3g，用HPLC法測定主要活性成份大豆苷0.236％、染料木苷0.071％、大豆苷元2.112％、染料木素0.731％；大豆苷轉化率為93.6％，染料木苷轉化率94.2％。
2、β-葡萄糖苷酶的回收利用與實施例1中10％大豆異黃酮水解實驗中的回收步驟相同。
實施例31、20％大豆異黃酮粉水解制備大豆異黃酮苷元水解所用的酶液同10％大豆異黃酮粉水解實驗所用原料為20％大豆異黃酮粉(天津尖峰天然產物有限公司)中的大豆苷含量為7.98％、染料木苷含量為9.51％、黃豆苷2.62％、大豆苷元0.72％、染料木素0.61％、黃豆黃素0.19％。
(1)稱取20％的大豆異黃酮100g，按照底物與酶3000U/g的比例加入粗酶液250ml，加入蒸餾水至1000(底物濃度為0.1g/ml)，PH自然，在溫度45℃攪拌速度180轉/分條件下，轉化8小時，終止反應，將酶轉化液在10000r/min，4℃條件下離心，收集沉淀于70℃。-0.1Mpa條件下減壓干燥，粉碎后即可得到轉化后的大豆異黃酮粉末82.3g。
(2)向“(1)”步驟中離心收集的上清液中緩慢加入食用酒精，使酒精濃度至75％，4℃條件下醇沉過夜，10000rmin、4℃條件下離心，收集上清液回收乙醇，獲得的膏體同上述條件減壓干燥，粉碎后得到轉化后的大豆異黃酮粉10.3g。
(3)將兩次得到的產品合并共得到轉化后的大豆異黃酮粉92.6g，用HPLC法測定主要活性成份大豆苷0.370％、染料木苷0.359％、大豆苷元5.874％、染料木素5.709％；大豆苷轉化率為95.7％，染料木苷轉化率96.5％。
2、β-葡萄糖苷酶的回收利用與10％大豆異黃酮水解實驗中的回收步驟相同。
權利要求
1.微生物酶法制備大豆異黃酮苷元的方法，是以大豆異黃酮粉為原料，用培養米曲霉菌發酵制備β-葡萄糖苷酶，將大豆異黃酮苷轉化為大豆異黃酮苷元，其特征是該制備方法包括以下步驟a)所述原料為2～90％的大豆異黃酮粉；b)篩選的菌種為米曲霉菌(Aspergillus oryzae)3042，用該菌種制備種子培養液；c)制備固體發酵培養基，得到含有β-葡萄糖苷酶的發酵物；d)將大豆異黃酮粉加入到經發酵提取的β-葡萄糖苷酶溶液中制取酶的轉化液，再進行離心固液分離，沉淀物低溫干燥得到大豆異黃酮苷元。
2.按照權利要求1所述的方法，其特征是原料與β-葡萄糖苷酶的比例為1000～4000U/g，轉化溫度40～50℃，PH4.5～7.0，攪拌速度為160～180r/min，轉化時間6～10hr，得到酶的轉化液，再將該轉化液于4～10℃，5000～10000r/min的條件下離心進行液固分離，沉淀物低溫干燥得到大豆異黃酮苷元。
3.按照權利要求2所述的方法，其特征是轉化液進行液固分離后的上清液用75％食用乙醇進行醇沉淀過夜，在4～10℃，5000～10000r/min條件下離心進行液固分離，沉淀的β-葡萄糖苷酶，用蒸餾水溶解，測定酶活力后重新利用；回收上清液中乙醇，獲得浸膏于50～80℃減壓干燥得大豆異黃酮苷元。
4.按照權利要求1所述的方法，其特征是固體發酵法制備含β-葡萄糖苷酶的步驟如下a)種子培養液的制備及培養方法可溶性淀粉2％，葡萄糖1％，磷酸二氫鉀0.1％，硫酸鎂0.1％，酵母膏0.5％，硝酸鈉0.2％，PH自然，于121℃滅菌15min；挑取適量斜面上的孢子轉入到種子培養基中，于20～28℃、160～180r/min震蕩培養38～48hr；b)固體發酵培養基的制備及培養方法將麩皮∶水按照1∶1.5～3.0的重量比配合，PH自然，121℃滅菌30min，以1～7％的接種量將制備好的種子接入固體培養基中發酵培養，培養20～28℃，濕度60～70％，培養時間60～84hr，得到含β-葡萄糖苷酶的固體發酵物；c)β-葡萄糖苷酶粗酶液的提取將上述固體發酵物加入10倍量的蒸餾水，攪拌均勻浸泡2～6hr，于4～10℃，5000～10000r/min條件下離心進行液固分離，所得上清液為β-葡萄糖苷酶粗酶液。
5.按照權利要求4所述的方法，其特征是所述c)步驟中的粗酶液的初步純化法是將粗酶液用75％的乙醇，于4～10℃下進行醇沉過夜，在此溫度下以5000～10000r/min離心分離，沉淀物用蒸餾水溶解得到初步純化的β-葡萄糖苷酶液，或在-40～-50℃下冷凍干燥獲得固體β-葡萄糖苷酶，初步純化后，用DEAE-sephadexA-50離子交換樹脂純化，用SDS電泳測定其分子量在45kb。
6.按照權利要求1所述的方法，其特征是原料大豆異黃酮粉的純度選用5～20％。
7.按照權利要求1或4所述的方法，其特征是用以轉化的β-葡萄糖苷酶溶液是粗酶液或經過純化的酶液。
全文摘要
微生物酶法制備大豆異黃酮苷元的方法，是以大豆異黃酮粉為原料，用培養米曲霉菌發酵制備β－葡萄糖苷酶，將大豆異黃酮苷轉化為大豆異黃酮苷元，其特征是該制備方法包括以下步驟所述原料為2～90％的大豆異黃酮粉；篩選的菌種為米曲霉菌3042，用該菌種制備種子培養液；制備固體發酵培養基，得到含有β－葡萄糖苷酶的發酵物；將大豆異黃酮粉加入到經發酵提取的β－葡萄糖苷酶溶液中制取酶的轉化液，再進行離心固液分離，沉定物低溫干燥得到大豆異黃酮苷元。本發明不受原料純度限制，在原料含量2～20％時、轉化率仍能達到90％以上，工藝流程明顯縮短，制作成本低，生物利用率明顯提高。
文檔編號C12R1/69GK1966705SQ20061013413
公開日2007年5月23日 申請日期2006年10月30日 優先權日2006年10月30日
發明者李劍梅, 劉艷玲, 李莉, 王振麗, 宗玉麗 申請人:遼寧省微生物科學研究院