專利名稱：：一種提高禽流感病毒分離率的雞胚尿囊腔接種方法
技術領域：
：本發明涉及病毒的分離接種技術，特別提供了一種提高禽流感病毒分離率的雞胚^^腔接種方法。
背景技術：
：禽流感病毒是禽，一些哺乳類動物的呼吸系統疾病的重要病源，是由正粘病毒科A型病毒特定亞型引起的一種急性、烈性傳染病，嚴重危害養禽業和人類健康。禽流感病毒的變異頻繁，血清亞型眾多，包括H1-H15，Nl-9，幾乎感染所有的禽類。從樣品中分離獲得致病病原體(病毒)，是診斷病毒性傳染性病(禽流感)的重要依據。目前分離禽流感病毒株一般是采集禽類(雞、鴨等)泄殖腔棉拭子，然后，通常采用雞胚接種分離病毒。通過雞胚尿囊腔培養分離禽流感病毒是一種傳統經典方法。一般采用孵化9-11日齡的雞胚，暗室內畫出氣室邊緣和胚頭位置，氣室朝上立于卵架上，消毒操作部位，在胚頭一側氣室邊緣上方0.5cm處打一針孔；進針至尿囊腔內接種樣品0.1力.21111/胚，以融化的石蠟封孔，氣室朝上立于卵架上繼續孵化，棄去24h內死亡雞胚，至96小時全部取出于4"冰箱過夜。收毒無菌操作打開氣室部位蛋殼，撕開殼膜、尿囊膜和羊膜,吸出尿囊液，肉眼觀察雞胚病理變化，尿囊行HA效價測定。在長期的應用過程中，該接種法存在接種量不能超過0.2ml缺陷，接種量大于或等于(》0.3ml/胚時，即出現液體外溢(內壓增高)并在24小時內死胚增加。
發明內容本發明的目的是提供一種提高禽流感病毒分離率的雞胚尿囊腔接種方法。本發明具體提供了一種提高禽流感病毒分離率的雞胚尿囊腔接種方法，其特征在于在雞胚的氣室側方打一針孔作為減壓孔；在雞胚的胚體接近尿囊腔處打一針孔作為進針孔，直接進針尿囊腔內，接種樣品0.51.0ml/胚。通常情況下，接種樣品內所含的病毒量與分離率成正比。待檢樣品內病毒的含量是有限的，本發明采用"二孔法"是通過加大接種量而達到增加病毒量的目的，因此提高了病毒的分離率。圖1為傳統雞胚尿囊腔接種法示意；圖2為本發明雞胚尿囊腔接種法示意。具體實施例方式實施例1采用傳統雞胚尿囊接種法和本發明雞胚尿囊接種法，進，m流感病毒分離率比較(操作方法分別如圖l，2所示)。同一份樣品同時采用兩種方法，分另恪接種一鵬胚。樣品為2005年湖北某縣疑似禽流感鴨樣品82份。具^W作方法如圖2所示采用孵化9-11日齡的雞胚82枚，經照視后劃出氣室及胚胎位置，于氣室側方打--針孔(減壓孔)；胚胎位置朝上橫置卵架上，避開胚體0,34).5cm處打一針孔(進針孔)，直接進針尿囊腔內接種樣品0.5-1.0ml/胚，以融化的石蠟封孔閉兩個針孔，氣室朝上立于卵架上繼續孵化，棄去24小時內死亡雞胚，至96小時全部取出于4'C冰箱過夜。收毒無菌操作打開氣室部位蛋殼，撕開殼膜、尿囊膜和羊膜,吸出尿囊液，觀察雞胚肉眼變化，尿囊液進行HA效價測定。結果見表l。比較例1樣品為2005年湖北某縣疑似禽流感鴨樣品82份。每一份樣品同時采用兩種方法分別各接種一枚雞胚。具作方法如圖1所示采用孵化9-ll日齡的雞胚82枚，暗室內畫出氣室纖和胚頭位置，氣室朝上立于卵架上，消毒操作部位，在胚頭一側氣室邊緣上方0.5cm處打一針孔；進針至尿囊腔內接種樣品0.1-0.21111/胚，以融化的石蠟封孔，氣室朝上立于卵架上繼續孵化，棄去24h內死亡雞胚，至％小時全部取出于4"冰箱過夜。收毒無菌操作打開氣室部位蛋殼，撕開殼膜、尿囊膜和羊膜,吸出尿囊液，肉眼觀察雞胚病理變化，尿囊液進行HA效價測定。結果見表1。表1:2005年湖北某縣疑似禽流感鴨樣品病毒分離方法比較實驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注1.傳統接種方法簡稱'單孔密'，新接種方法簡稱'二孔法"。2.n為待檢樣品的數量。3.結果判斷HA效價^1:32判為分離獲得流感病毒。實施例2采用傳統雞胚尿囊接種法和本發明雞胚尿囊接種法，進fi^流感病毒分離率比較(操作方法分別如圖，2所示)。同一份樣品同時采用兩種方法，分別各接種一枚雞胚。樣品為2005年浙江某縣疑似禽流感雞樣品69份。每一份樣品同時采用兩種方法分別各接種一枚雞胚。具體操作方法如圖2所示采用孵化9-ll日齡的雞胚69枚，經照視后劃出氣錢胚胎位置，于氣室側方打一針孔(減壓孔)；胚胎位置朝上橫置卵架上，避開胚體0.3-0.50處打一針孔(進針孔)，直接進針尿囊腔內接種樣品0.5-1.01111/胚，以融化的石蠟封孔閉兩個針孔，氣室朝上立于卵架上繼續孵化，棄去24小時內死亡雞胚，至96小時全部取出于4"C冰箱過夜。收毒無菌操作打開氣室部位蛋殼，撕開殼膜、尿囊膜和羊膜,吸出尿囊液，觀察雞胚肉眼變化，尿囊^ift行HA效價測定。結果見表2。比較例2樣品為2005年浙江某縣疑似禽流感雞樣品69份。每一份樣品同時采用兩種方法分別各接種一枚雞胚。具體操作方法如圖l所示采用孵化9-11日齡的雞胚69枚，，暗室內畫出氣室邊緣和胚頭位置，氣室朝上立于卵架上，消毒操作部位，在胚頭一側氣室,上方0.5011處打一針孔；進針至尿囊腔內接種樣品0.1-0.2ml/K，以融化的石蠟封孔，氣室朝上立于卵架上繼續孵化，棄去24h內死亡雞胚，至％小時全部取出于4。C冰箱過夜。收毒無菌操作打開氣室部位蛋殼，撕開殼膜、尿囊膜和羊膜,吸出尿驗，肉眼觀察雞胚病理變化，尿囊液進行HA效價測定。結果見表2。表2:2005年浙江省某縣疑似禽流感雞樣品病毒分離方法比較實驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例3采用傳統雞EM囊接種法和本發明雞胚尿囊接種法，進行禽流感病毒分離率比較(操作方法分別如圖l，2所示)。同一份樣品同時采用兩種方法，分別各接種一鵬胚。樣品為2004年湖南省某縣疑似禽流感雞樣品55份。具體操作如圖2所示，采用孵化9-11日齡的雞胚55枚，經照視后劃出氣室及腳臺位置，于氣室側方打一針孔(減壓孔)；胚胎位置朝上橫置卵架上，避開胚體0.3"0.511處打一針孔(進針孔)，直接進針尿囊腔內接種樣品0.5-1.Oml/胚，以融化的石蠟封孔閉兩個針孔，氣室朝上立于卵架上繼續孵化，棄去24小時內死亡雞胚，至96小時全部取出于4i:冰箱過夜。收毒無菌操作打開氣室部位蛋殼，撕開殼膜、尿囊膜和羊膜，吸出尿囊液，觀察雞胚肉眼變化，尿囊液進行HA效價測定。結果見表3。比較例3樣品為2004年湖南省某縣疑似禽流感雞樣品55份。具體操作如圖1所示，采用孵化9-11日齡的雞胚55枚，暗室內畫出氣室邊緣和胚頭位置，氣室朝上立于卵架上，消毒操作部位，在胚頭一側氣室邊緣上方0.5cm處打一針孔；進針至尿囊腔內接種樣品0.1-0.2ml/K，以融化的石蠟封孔，氣室朝上立于卵架上繼續孵化，棄去24h內死亡雞胚，至96小時全部取出于4X:冰箱過夜。收毒無菌操作打開氣室部位蛋殼，撕開殼膜、尿和羊膜,吸出尿囊液，肉眼觀察雞胚病理變化，尿囊液進行HA效價測定。結果見表3。表3:2004年湖南省某1M似禽流感雞樣品病毒分離方法比較實驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>從以上實施例可以看出，采用本發明"二孔法"分離病毒增加了尿囊腔接種量0.8-ml/胚。結果顯著提高了病毒分離率，經統計學分析(表l，表2，表3)"二孔法"病毒分離率比傳統接種方法提高了3.03.75倍。權利要求1、一種提高禽流感病毒分離率的雞胚尿囊腔接種方法，其特征在于在雞胚的氣室側方打一針孔作為減壓孔；在雞胚的胚體接近尿囊腔處打一針孔作為進針孔，直接進針尿囊腔內，接種樣品0.5～1.0ml/胚。全文摘要一種提高禽流感病毒分離率的雞胚尿囊腔接種方法，其特征在于在雞胚的氣室側方打一針孔作為減壓孔；在雞胚的胚體接近尿囊腔處打一針孔作為進針孔，直接進針尿囊腔內，接種樣品0.5-1.0ml/胚。本發明通過加大接種量而達到增加病毒量的目的，因此提高了病毒的分離率。文檔編號C12N7/00GK101191125SQ20061013441公開日2008年6月4日申請日期2006年11月29日優先權日2006年11月29日發明者霜唐,錚寇,忠張,李天憲,李永東,范兆軍,陳繩亮申請人:中國科學院武漢病毒研究所