專利名稱：：具有內切葡聚糖酶活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸的制作方法具有內切葡聚糖酶活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸對于在聯邦資助的研究和開發下所進行發明的權利聲明本發明依據能源部(D印artmentofEnergy)授予的基本合同(PrimeContract)DE-AC36-98GO10337、NREL轉包合同(Subcontract)No.ZCO-30017-02在政府支持下完成。政府對本發明具有一定的權利。發明背景發明領域本發明涉及具有內切葡聚糖酶活性的分離的多肽和編碼所述多肽的分離的多核苷酸。本發明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構建體、載體和宿主細胞，以及用于產生和使用所述多肽的方法。相關領域描述纖維素是單糖葡萄糖通過(3-1，4-鍵共價連接的聚合物。許多微生物產生水解P-連接的聚糖的酶。這些酶包括內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和(3-葡糖苷酶。內切葡聚糖酶在隨機位置消化纖維素聚合物，將其打開(openingit)以受到纖維二糖水解酶攻擊(attack)。纖維二糖水解酶繼而從纖維素聚合物的末端釋放纖維二糖的分子。纖維二糖水解酶I是1，4-D-葡聚糖纖維二糖水解酶(E.C3.2.1.91)活性，其催化纖維素、cellotetriose或任何含有P-l,4-連接的葡萄糖的聚合物中1，4-J3-D-糖苷鍵的水解，從鏈的還原性末端釋放纖維二糖。纖維二糖水解酶II是1,4-D-葡聚糖纖維二糖水解酶(E.C.3.2丄91)活性，其催化纖維素、cellotetriose或任何含有卩-l,4-連接的葡萄糖的聚合物中1，4-(3-D-糖芬鍵的水解，從鏈的非還原性末端釋放纖維二糖。纖維二糖是水溶性的(3-1,4-連接的葡萄糖二聚體。(3-葡糖苷酶將纖維二糖水解成葡萄糖。將纖維素原料轉化為乙醇具有以下優勢大量原料現成可用，避免燃燒或填埋材料的愿望，和乙醇燃料的清潔性。木材、農業殘余物、草本作物和城市固體廢物被認為是用于乙醇生產的原料。這些材料主要由纖維素、半纖維素和木質素組成。一旦將纖維素轉化成葡萄糖，葡萄糖將容易地由酵母發酵成乙醇。Kvesitadaze&"/.，1995,^//fe(i5/oc/，&^j歷她c/wo/ogv50:137-143描述了來自土生梭孢霉(77z/e/av/afwm^/力嗜熱突變菌抹的熱穩定內切葡聚糖酶的分離和性質。Gilbert&a/.,1992,rec/mo/ogy39:147-154描述了對土生梭孢霉255B的纖維素體系中存在的酶的表征。Breuil^a/.,1986,歷ofec/z"o/ogv8:673-676描述了來自土生梭孢霉菌抹C464和NRRL8126的纖維素酶和p-葡糖苷酶的產生和定位。本領域中有利的是鑒定新的具有改進性質的內切葡聚糖酶，例如改進的水解速率、更好的熱穩定性、對木質素的吸附減少，和除水解纖維素之外水解生物質的非纖維素成分例如半纖維素的能力。對半纖維素具有廣泛副活性(sideactivity)的內切葡聚糖酶能夠特別有益于改進復雜的、富含半纖維素的生物質底物的總水解產率。本發明的目的是提供改進的具有內切葡聚糖酶活性的多肽和編碼該多肽的多核苦酸。發明概述本發明涉及具有內切葡聚糖酶活性的分離的多肽，所述多肽選自下組(a)多肽，其包含與SEQIDNO:2的成熟多肽編碼序列具有至少60%同一性的氨基酸序列；(b)多肽，其由在至少中嚴緊條件下與以下序列雜交的核苷酸序列編碼(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈；和(c)SEQIDNO:2的成熟多肽包含一個或多個氨基酸的保守取代、缺失和/或插入的變體。本發明還涉及分離的多核苷酸，其編碼具有內切葡聚糖酶活性的多肽，所述多核苷酸選自下組(a)多核苷酸，其編碼的多肽包含與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少60%同一性的氨基酸序列；(b)多核苷酸，其與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有至少60%同一性；和(c)多核香酸，其在至少低嚴緊條件下與以下序列雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈。在優選的方面，所述成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸18至336。在另一個優選的方面，所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:1的核苷酸52至1008。本發明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構建體、重組表達載體和重組宿主細月包。本發明還涉及用于產生這些具有內切葡聚糖酶活性的多肽的方法，其包括(a)在有益于產生該多肽的條件下培養包含核酸構建體的重組宿主細胞，所述核酸構建體包含編碼所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。本發明還涉及在洗滌劑中和在纖維素到葡萄糖的轉化中使用具有內切葡聚糖酶活性的多肽的方法。本發明進一步涉及包含編碼蛋白質的基因的核酸構建體，其中將所述基因可操作地連接于編碼信號肽的核苷酸序列，該信號肽包含SEQIDNO:2的氨基酸1至17或由SEQIDNO:2的氨基酸1至17組成，其中所述基因對于所述核苷酸序列是外源的。附圖簡述圖1A和IB顯示土生梭孢霉NRRL8126內切葡聚糖酶(CEL7F)的cDNA序列和推導的氨基酸序列(分別為SEQIDNO:1和2)。圖2顯示pTter7F的限制圖語。圖3顯示pAlLol的限制圖譜。圖4顯示pBANe10的限制圖i普。圖5顯示pAlLo2的限制圖譜。圖6顯示pAlLo22的限制圖譜。圖7顯示在pH5.5和60。C水解2小時之后，|3-葡聚糖(1%w/v)的相對轉化率。圖8顯示在pH5.5和60。C水解24小時之后，(3-葡聚糖(1%w/v)的相對轉化率。定義內切葡聚糖酶活性術語"內切葡聚糖酶活性"在本文中定義為內-l,4-P-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-l，4-P-D-glucan4-glucanohydrolase)(E.C.No.3.2丄4)，其催化纖維素、纖維素衍生物(例如羧曱基纖維素和羥乙基纖維素)、地衣淀粉(lichenin)中的1，4-P-D-糖苷鍵、混合的卩-1，3葡聚糖例如谷類P-D-葡聚糖或木葡聚糖中的(3-1,4鍵和含有纖維素成分的其它植物材料的內水解(endohydrolysis)。就本發明而言，才艮氺居Ghose,1987，Pwew(i^p/.CTzew.59:257-268的方法，使用羧曱基纖維素(CMC)水解來測定內切葡聚糖酶活性。將一單位的內切葡聚糖酶活性定義為在50。C、pH4.8，每分鐘產生1.0微摩爾還原糖。在優選的方面，具有內切葡聚糖酶活性的本發明的多肽還對選自下組的一種或多種底物具有酶活性木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖、半乳聚糖、半乳甘露聚糖、葡聚糖和殼多糖。將具有內切葡聚糖酶活性的多肽對于這些多糖底物的活性測定為將所述底物(5g每升)與本發明的具有內切葡聚糖酶活性的多肽(lmg蛋白質每g底物)一起在pH5.0(50mM乙酸鈉)和50。C無攪拌溫育1和92小時之后，從不同AZCL染色的底物釋放的染料的相對量。通過測量5卯nm的吸光度測定染料的釋放。在更優選的方面，具有內切葡聚糖酶活性的本發明的多肽進一步對木聚糖具有酶活性。在另外的更優選的方面，具有內切葡聚糖酶活性的本發明的多肽進一步對木葡聚糖具有酶活性。在另外的更優選的方面，具有內切葡聚糖酶活性的本發明的多肽進一步對阿拉伯木聚糖具有酶活性。在另外的更優選的方面，具有內切葡聚糖酶活性的本發明的多肽進一步對半乳聚糖具有酶活性。在另外的更優選的方面，具有內切葡聚糖酶活性的本發明的多肽進一步對半乳甘露聚糖具有酶活性。在另外的更優選的方面，具有內切葡聚糖酶活性的本發明的多肽進一步對葡聚糖具有酶活性。在另外的更優選的方面，具有內切葡聚糖酶活性的本發明的多肽進一步對殼多糖具有酶活性。在另外的更優選的方面，具有內切葡聚糖酶活性的本發明的多肽進一步對木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖、半乳聚糖、半乳甘露聚糖、葡聚糖和殼多糖具有酶活性。本發明的多肽具有的內切葡聚糖酶活性是由SEQIDNO:2的氨基酸18至336所示氨基S交序列組成的多肽的內切葡聚糖酶活性的至少20%，優選至少40%,更優選至少50%,更優選至少60%,更優選至少70%,更優選至少80%,甚至更優選至少90%,最優選至少95%,并且甚至最優選至少100%。家族7糖苷水解酶或家族GH7:術語"家族7糖苦水解酶"或"家族GH7"或"CEL7F，，在本文中定義為根據HenrissatB.,1991，Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities,歷oc/ze肌《/280:309-316，和HenrissatB.，andBairochA.,1996，Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,5&c/;ew./316:695-696屬于糖普水解酶家族7的多肽。分離的多肽術語"分離的多肽"用于本文中指，如通過SDS-PAGE測定的，其為至少20%純，優選至少40%純，更優選至少60%純，甚至更優選至少80%純，最優選至少90%純，并且甚至最優選至少95%純的多肽。基本上純的多肽術語"基本上純的多肽"在本文表示多肽制備物，所述多肽制備物按重量計含有至多10%,優選至多8%，更優選至多6%,更優選至多5%,更優選至多4%，更優選至多3%，甚至更優選至多2%，最優選至多1%,并且甚至最優選至多0.5。/。的與其天然結合的(associated)的其它多肽材料。因此，優選所述基本上純的多肽是按存在于制備物中的全部多肽材料的重量計至少92%純，優選至少94%純，更優選至少95%純，更優選至少96%純，更優選至少96°/。純，更優選至少97%純，更優選至少98%純，甚至更優選至少99%純，最優選至少99.5%純，并且甚至最優選100%純。本發明的多肽優選是基本上純的形式。具體而言，優選所述多肽是"基本上(essentially)純的形式"，即，所述多肽制備物基本上(essentially)不含與其天然結合的其它多肽材料。這能夠通過以下方法實現，例如，通過公知的重組方法或由經典純化方法制備多肽。在本文中，術語"基本上純的多肽"與術語"分離的多肽"和"分離形式的多肽"同義。成熟多肽術語"成熟多肽"在本文中定義為具有內切葡聚糖酶活性的多肽，所述多肽以其在翻譯和任何翻譯后修飾之后的最終形式存在，所述修飾例如N-末端加工、C-末端截斷、糖基化等。同一性參數"同一性"描述兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關性。就本發明而言，兩個氨基酸序列之間的同一性程度通過Clustal方法(Higgins,1989,C4S/OS5:151-153)使用LASERGENEMEGALIGNtm軟件(DNASTAR，Inc.,Madison,WI)來測定，使用同一性表和以下多重比對參數缺口罰分(gappenalty)10和缺口長度罰分(gaplengthpenalty)10。配對比對參數是K元組(Ktuple)=l,缺口罰分=3,窗口(windows)=5，并且對角線(diagonals)=5。就本發明而言，兩個核苷酸序列之間的同一性程度通過Wilbur-Lipman方法(WilburandLipman,1983,/VoceW"gs7Va"'owa/Jcac/em_v5Wewce"W80:726-730)使用LASERGENEMEGALIGNtm軟件(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)來測定，使用同一性表和以下多重比對參數缺口罰分10和缺口長度罰分10。配對比對參數是K元組二3，缺口罰分=3，和窗口=20。多肽片段術語"多肽片段"在本文中定義為從SEQIDNO:2的氨基和/或羧基末端缺失一個或多個氨基酸的多肽，或其同源序列；其中所述片段具有內切葡聚糖酶活性。優選地，片段含有至少270個氨基酸殘基，更優選至少285個氨基酸殘基，并且最優選至少300個氨基酸殘基，例如，SEQIDNO:2的氨基酸18至336。亞序列術語"亞序列(subs叫uence)"在本文中定義為從SEQIDNO:l的5'和/或3，端缺失一個或多個核普酸的核苷酸序列，或其同源序列；其中所述亞序列編碼具有內切葡聚糖酶活性的多肽片段。優選地，亞序列含有至少810個核芬酸，更優選至少855個核苷酸，并且最優選至少900個核苷酸。等位變體(allelicvariant):術語"等位變體"在本文中表示占據相同染色體基因座的基因的任何兩種或兩種以上可選形式。等位變異通過突變天然地發生，并且可導致種群內的多態性。基因突變可以是沉默的(在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。分離的多核苷酸術語"分離的多核苷酸"用于本文中指，如通過瓊脂糖電泳測定的，其為至少20°/。純，優選至少40%純，更優選至少60%純，甚至更優選至少80%純，最優選至少90%純，并且甚至最優選至少95%純的多核苦酸。基本上純的多核苷酸術語"基本上純的多核苷酸"用于本文指不含其它外來的或不期望的核苷酸的多核苷酸制備物，并且所述多核苷酸制備物處于適合于在遺傳工程的蛋白質生產體系中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸按重量計含有至多10%,優選至多8%,更優選至多6%，更優選至多5%，更優選至多4%，更優選至多3%,甚至更優選至多2%，最優選至多1%，并且甚至最優選至多0.5%的與其天然結合的其它多核苷酸材料。然而，基本上純的多核香酸可以包括天然存在的5，和3，非翻譯區，例如啟動子和終止子。優選基本上純的多核普酸是按重量計至少90%純，優選至少92%純，更優選至少94%純，更優選至少95°/。純，更優選至少96%純，更優選至少97%純，甚至更優選至少98%純，最優選至少99%,并且甚至最優選至少99.5%純的。本發明所述多核苷酸優選為基本上純的形式。具體而言，優選在本文公開的多核苦酸是"基本上(essentially)純的形式"，即，所述多核苷酸制備物基本上不含與其天然結合的其它多核苷酸材料。在本文中，術語"基本上純的多核苷酸"與術語"分離的多核苷酸"和"分離形式的多核苷酸"同義。所述多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或它們的任何組合。成熟多肽編碼序列術語"成熟多肽編碼序列"在本文中定義為核苷酸序列，其編碼具有內切葡聚糖酶活性的成熟多肽。cDNA:術語"cDNA"在本文中定義為能夠通過反轉錄從得自真核細胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制備的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相應基因組DNA中的內含子序列。起始的(initial)、初級的RNA轉錄物是mRNA的前體，其通過一系列的步驟加工然后作為成熟的已剪接的mRNA出現。這些步驟包括通過稱為剪接的過程去除內含子序列。因而源自mRNA的cDNA沒有任何內含子序列。核酸構建體術語"核酸構建體，，用于本文指單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分子分離自天然存在的基因，或將所述核酸分子以本來不存在于(nototherwiseexist)自然界中的方式修飾以含有核酸的片段。當所述核酸構建體含有本發明的編碼序列表達所需的調控序列時，術語核酸構建體與術語"表達盒"同義。調控序列(controls叫uence):術語"調控序列"在本文定義為包括對編碼本發明多肽的多核苷酸表達是必需的或有利的所有成分。各種調控序列對于編碼所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各種調控序列對于彼此可以是天然的或外源的。這些調控序列包括但不限于前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉錄終止子。最少的情況，調控序列包括啟動子和轉錄和翻譯的終止信號。調控序列可以和用于引入特異性限制位點的接頭一起提供，所述特異性限制位點促進調控序列與編碼多肽的核普酸序列編碼區的連接。可操作地連接術語"可操作地連接"在本文表示這樣的構型，其中將調控序列置于相對于多核苷酸序列的編碼序列的合適位置，使得調控序列指導多肽編碼序列的表達。編碼序列當用于本文時術語"編碼序列"的意思是直接指定其蛋白產物的氨基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開讀框決定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子例如GTG和TTG開始，并且以終止密碼子例如TAA、TAG和TGA結束。編碼序列可以是DNA、cDNA或重組核苷酸序列。表達術語"表達"包括涉及多肽產生的任何步驟，其包括但不限于轉錄、轉錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。表達載體術語"表達載體"在本文定義為線性的或環狀的DNA分子，其包含編碼本發明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸與提供用于其表達的額外核苷酸可操作地連接。宿主細胞如本文中所使用的術語"宿主細胞"包括任何細胞類型，所述細胞類型對于使用包含本發明多核苷酸的核酸構建體或表達載體的轉化、轉染、轉導等是易感的(susceptible)。修飾術語"修飾"在本文的意思是，對由SEQIDNO:2的成熟多肽或其同源序列組成的多肽的任何化學修飾，以及對編碼所述多肽的DNA的遺傳操作。所述修飾可以是一個或多個氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一個或多個氨基酸側鏈的置換。人工變體當用在本文時，術語"人工變體"的意思是具有內切葡聚糖酶活性的多肽，所述多肽由表達SEQIDNO:1或其同源序列的修飾的核苷酸序列或其成熟編碼區的生物體產生。所述修飾的核苷酸序列通過人為干預(humanintervention),通過修飾公開于SEQIDNO:1或其同源序列的核苷酸序列或其成熟編碼區來獲得。發明詳述具有內切葡聚糖酶活性的多肽在第一個方面，本發明涉及包含下述氨基酸序列的分離的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少60%，優選至少65%,更優選至少70%,更優選至少75%，更優選至少80%,更優選至少85%，甚至更優選至少90%,最優選至少95%，并且甚至最優選至少97%、98%或99%的同一性程度，所述多肽具有內切葡聚糖酶活性(下文中的"同源多肽")。在優選的方面，所述同源多肽具有的氨基酸序列與SEQIDNO:2的成熟多肽相差十個氨基酸，優選相差五個氨基酸，更優選相差四個氨基酸，甚至更優選相差三個氨基酸，最優選相差兩個氨基酸，并且甚至最優選相差一個氨基酸。本發明的多肽優選包含SEQIDN0:2的氨基酸序列或其等位變體；或其具有內切葡聚糖酶活性的片段。在優選的方面，多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。在另外的優選方面，多肽包含SEQIDNO:2的成熟多肽。在另外的優選方面，多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸18至336,或其等位變體；或其具有內切葡聚糖酶活性的片段。在另外的優選方面，多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸18至336。在另外的優選方面，多肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列或其等位變體組成；或由其具有內切葡聚糖酶活性的片段組成。在另外的優選方面，多肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列組成。在另外的優選方面，多肽由SEQIDNO:2的成熟多肽組成。在另外的優選方面，多肽由SEQIDNO:2的氨基酸18至335或其等位變體組成；或由其具有內切葡聚糖酶活性的片段組成。在另外的優選方面，多肽由SEQIDNO:2的氨基酸18至336組成。在第二個方面，本發明涉及具有內切葡聚糖酶活性的分離的多肽，所述分離的多肽由多核芬酸編碼，所述多核苷酸在非常低嚴緊條件下，優選低嚴緊條件下，更優選中嚴緊條件下，更優選中-高嚴緊條件下，甚至更優選高嚴緊條件下，并且最優選非常高嚴緊條件下，與以下序列雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，(iii)(i)或(ii)的亞序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互補鏈(J.Sambrook，E.F.Fritsch,andT.Maniatis,1989,Afo/ecw/arC7om."g，爿丄a60rato7jWawwa/，2dedition,ColdSpringHarbor,NewYork)。SEQIDNO:l的亞序列含有至少100個連續的核芬酸或優選至少200個連續的核苷酸。此外，所述亞序列可編碼具有內切葡聚糖酶活性的多肽片段。在優選的方面，所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:1的核苷酸52至1008。SEQIDNO:1的核苷酸序列或其亞序列，以及SEQIDNO:2的氨基酸序列或其片段，可用于設計核酸探針，以根據本領域內公知的方法從不同屬和種的菌抹鑒定和克隆編碼具有內切葡聚糖酶活性的多肽的DNA。具體而言，根據標準的Southern印跡方法，可將這些探針用于與感興趣的屬或種的基因組或cDNA雜交，以鑒定和從其中分離相應的基因。這些探針可明顯短于完整序列，但長度上應為至少14，優選至少25，更優選至少35，并且最優選至少70個核苷酸。然而，優選所述核酸探針是至少100個核苷酸長度。例如，所述核酸探針長度上可以是至少200個核苦酸，優選至少300個核苷酸，更優選至少400個核苷酸，或最優選至少500個核普酸。甚至可以-使用更長的探針，例如，長度是至少600個核芬酸，至少優選至少700個核苦酸，更優選至少800個核苷酸，或最優選至少900個核苷酸的核酸4罙針。DNA和RNA探針二者均可使用。通常將探針標記以探測相應的基因(例如，用32p、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標記)。將這些探針包含于本發明中。因而，可從由這些其它生物體制備的基因組DNA或cDNA文庫中篩選DNA，所述DNA與上述探針雜交并且編碼具有內切葡聚糖酶活性的多肽。可以通過瓊脂糖或聚丙歸酰胺凝膠電泳，或通過其它分離技術分離來自這些其它生物體的基因組或其它DNA。可以將來自文庫的DNA或分離的DNA了鑒定與SEQIDNO:l或其亞序列同源的克隆或DNA,將所述載體材料用在Sounthern印跡中。就本發明而言，雜交表示核苷酸序列在非常低至非常高的嚴緊條件下與標記的核酸探針雜交，所述核酸探針對應于SEQIDNO:l所示的核苷酸序列、包含SEQIDNO:1的基因組DNA序列、它的互補鏈或其亞序列。可使用例如X射線片(X-rayfilm)檢測在這些條件下與核酸探針雜交的分子。在優選的方面，核酸4罙針是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列。在另外的優選方面，核酸探針是SEQIDNO:1的核苷酸52至1008。在另外的優選方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:2的多肽的多核苷S吏序列，或其亞序列。在另外的優選方面，核酸探針是SEQIDNO:1。在另外的優選方面，核酸探針是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列。在另外的優選方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-30837中的質粒pTter7F中含有的多核苷S交序列，其中所述其多核苷酸序列編碼具有脂肪酶活性的多肽。在另外的優選方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-30837中的質粒pTter7F中含有的成熟多肽編碼序列。對于長度至少100個核苷酸的長探針，將非常低至非常高的嚴緊條件定義為在42。C，在5XSSPE、0.3%SDS、200嗎/ml已剪切并且變性的鮭精DNA中，并且對于非常低和低嚴緊性為25%的甲酰胺、對于中和中-高嚴緊性為35%的曱酰胺、或對于高和非常高嚴緊性為50%的曱酰胺，根據標準的Southern印跡法進行預雜交和雜交最佳12至24小時。對于長度為至少100個核苷酸的長探針，使用2XSSC、0.2。/。SDS優選至少在45。C(非常低嚴緊性)，更優選至少在50。C(低嚴緊性)，更優選至少在55°C(中嚴緊性)，更優選至少在60°C(中-高嚴緊性)，甚至更優選至少在65°C(高嚴緊性)，并且最優選至少在70。C(非常高嚴緊性)將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將嚴緊條件定義為在比才艮才居Bolton和McCarthyi十算法(1962，尸raceec/"gso/7Va"owa/4caAwycASWe"cCTOS^48:13卯)得出的Tj氐大約5°C至大約10°C,在0.9MNaCl，0.09MTris-HClpH7.6,6mMEDTA，0.5%NP-40，1xDenhardt〉容液，1mM焦石奔酉臾4內(sodiumpyrophosphate),1mM石壽酉臾二氫4內(sodiummonobasicphosphate),0.1mMATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根據標準的Southern印跡步驟進行預雜交、雜交和雜交后洗滌最佳12至24小時。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將所述載體材料在6xSSC加0.1%SDS中洗滌一次15分鐘，并用6xSSC在比計算的Tm低5。C至10。C的溫度下洗滌兩次，每次15分鐘。在第三個方面，本發明涉及人工變體，所述人工變體包含保守取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:2或其同源序列；或其成熟多肽。優選氨基酸改變對性質是較不重要的(ofaminornature),即保守的氨基酸取代或插入，其不顯著影響蛋白質的折疊和/或活性；通常為1至大約30個氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸殘基；多至大約20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或其它功能(例如多組氨酸序列(polyhistidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或結合i或(bindingdomain))來促進純化的小延伸。保守取代的實例是在以下組之內堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和曱疏氨酸)。通常不改變比活性(specificactivity)的氨基酸取代是本領域已知的，并且由例^口H.NeurathandR丄.Hill,1979,/"，7TzeiVo/^>w，AcademicPress,NewYork甘葛述。最普遍發生的交換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。除了20個基本氨基酸，非基本氨基酸(例如4-羥脯氨酸、6-iV-曱基賴氨酸、2-氨基異丁酸、異纈氨酸和a-曱基絲氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸殘基。有限數量的非保守氨基酸、不由遺傳密碼編碼的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸殘基。"非天然氨基酸"在蛋白質合成后已經過修飾，和/或在它們的側鏈具有不同于基本氨基酸的化學結構。非天然氨基酸能夠以化學方法合成，并且優選是商業上能夠獲得的，包括六氫吡啶羧酸(pipecolicacid)、p塞唑烷羧酸(thiazolidinecarboxylicacid)、脫氫脯氨酸、3-和4-曱基脯氨酸，和3，3-二曱基脯氨酸。變。例如，氨基酸改變可改進多肽的熱穩定性，改變底物特異性，改變最適pH等。能夠根據本領域已知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區誘變法(CunninghamandWells,1989,Sc/e"ce244:1081-1085)來鑒定親本多肽中的必需氨基酸。在后一技術中，將單一丙氨酸突變引入到分子中的每個殘基，并且測試所得突變分子的生物活性(即，內切葡聚糖酶活性)以鑒定對于所述分子的活性關鍵的氨基酸殘基。同樣參見Hilton1996,J.C7zem.271:4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能夠通過結構的物理分析而測定，如通過以下這些技術如核石茲共振、晶體學、電子衍射或光親和標記，連同推定的接觸位點氨基酸的突變來測定。參見例如deVos""/.，1992，5Wewce255:306-312;Smith"a/.,1992，JMo/.Ao/.224:899-904;Wlodaver""/.，1992，F五^9丄".309:59-64。必需氨基酸的同一性也能夠從與多肽的同一性分析來推斷，所述多肽與根據本發明的多肽相關。能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法，然后是有關的篩選方法，例如那些由Reidhaar-OlsonandSauer,1988，5We"ce241:53-57;BowieandSauer,1989，戶rac.Ato/.Jcat/.Sc/.86:2152-2156;WO95/17413;或WO95/22625公開的那些方法來進行并測試單個或多個氨基酸取代。能夠使用的其它方法包括易錯PCR、噬菌體展示(例如，Lowman"a/.,1991，S/oc/zem.30:10832-10837;美國專利號5,223,409;WO92/06204)和區域定向的誘變(Derbyshirea/.，1986，Gewe46:145;Nerda/.,1988，DiVJ7:127)。誘變/改組方法能夠與高通量、自動化的篩選方法組合以^r測由宿主細胞表達的克隆的、誘變的多肽的活性(Ness"a/.，1999，A^we17:893-896)。能夠從宿主細胞回收編碼活性多肽的誘變的DNA分子，并且使用本領域內標準方法快速測序。這些方法允許快速測定感興趣的多肽中單個氨基酸殘基的重要性，并且能夠應用于未知結構的多肽。SEQIDNO:2的成熟多肽例如SEQIDNO:2的氨基酸18至336的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數是10，優選9,更優選8,更優選7，更優選至多6,更優選5，更優選4，甚至更優選3，最優選2，并且甚至最優選l。具有內切葡聚糖酶活性的多肽的來源本發明的多肽可以獲得自任何屬的微生物。就本發明而言，用于本文與給定的來源有關的術語"獲得自"，意思是核苷酸序列編碼的多肽由所述來源產生，或由其中插入了來自所述來源的核苷酸序列的菌株產生。在優選的方面，獲得自給定來源的多肽是胞外分泌的。本發明的多肽可以是細菌多肽。例如，所述多肽可以是革蘭氏陽性細菌多肽例如芽孢桿菌屬(SflC/〃船)多肽，例如具有內切葡聚糖酶活性的嗜堿芽孢桿菌(B(3cz'〃mjfl/AM/o;/n7z^)、角罕淀粉芽孑包桿菌C6(3c/〃W5a;my/o/z々wey^c/era)、短芽孢桿菌CSac"/wsZ^ev/力、環狀芽孢桿菌CSac/〃M"Vcw/ara)、凝結芽孢桿菌(Bac/〃wcoagw/am")、火山爛芽孑包桿菌C8ac/〃M5/at^i)、遲緩芽孑包桿菌C6ac/〃ws/e/7^s)、i也衣芽孑包#干菌CBac/〃w//c/zewybr^mi)、巨大芽孑包坤干菌(5ac/〃Ms附egafen'wm)、嗜熱月旨肪芽孑包4干菌(fiac/〃MWeara/2ermo//n7"力、才忐草芽孑包^干菌(5ac/〃ussi/6"fc)或蘇云金芽孑包桿菌(5ac/〃1^^wr/"g7'emz、)多肽；或具有內切葡聚糖酶活性的鏈霉菌屬GS^^/w^cey)多肽，例如，具有內切葡聚糖酶活性的淺青紫鏈霉菌(5^e;tomycM//v/t/a"力或鼠灰纟連霉菌(5^e/tomycesmwn'ww》多肽；或革蘭氏陰性細菌多肽，例如，具有內切葡聚糖酶活性的大腸桿菌或假單月包菌屬菌種CPseMcfo附o"似sp.)多肽。本發明的多肽也可以是真菌多肽，并且更優選酵母多肽例如具有內切葡聚糖酶活性的念珠菌屬(Omc^a)、克魯維酵母屬(X/矽wramyc")、畢赤酵母屬(/Vc/n'a)、酵母屬(5bcc/^ra，ce"、裂殖酵母屬(^b/z/zosacc/^rawyces)或西洋蓍霉屬(rarraw/a)多肽；或更優選絲狀真菌多肽例如具有內切葡聚^t酶活性的才支丁貞孑包霉屬(v4cre附om'ww)、曲霉屬(Js/erg77/ws)、少豆沖更霉屬(」wwo6os/(i/MW)、隱i^菌屬(Oy//ococcM5)、/^//6os/(i/w附、嫌孑包屬(7^wsQn'w附)、腐質審屬(7/ww/co/a)、Afagwa/cW/ze、毛霉屬(Mwco。、毀絲霉屬(^^6//0/7/^/20—、iVeoca〃/ma幼'x、月永孑包菌屬(A^wras/oraf)、才以青霉屬(尸aec/Zom^yce)、青霉屬(尸em'c/〃/ww)、/7ramycey、裂褶菌屬(5W2/zo//z少〃ww)、3果節菌屬(7^/<aram_yce5)、熱子嚢菌屬(T7zCT77oawcws)、才炎孑包殼屬(77z/e/av/a)、7b(vpoc/aci/Mm或木霉屬(7Wc/70fiferma)多肽。在優選的方面，所述多肽是具有內切葡聚糖酶活性的卡爾酵母(5"acc/2aram少cescar/Werge服.力、酉良酒酵母(Sacc/7"ram少cescerev/w'ae)、糖化酵母(tSbcc/7flramycas1to"c—、道格拉氏酵母(5"acc/araw_yc"ofowg/os1//)、克魯弗酵母(5"acc/zara附少ces1vm')、諾地酵母(&cc/z(3ra/^ycas"o/^e脂'力或卵形酵母(&cc/7oromyces1ovzyb，/力多狀。在另外的優選方面，所述多肽是具有內切葡聚糖酶活性的棘孢曲霉(/^/erg7'〃ws(3cw/ea/^力、5包盛曲霉(y^/erg/〃wow(3mon〕、煙曲霉(爿57e7-g7'〃ws/w冊,ga加)、臭曲霉(/^/erg7.〃wsybW(i—、日本曲霉(y^erg77/w57'a戶m'c—、構巢曲霉(力5/9erg/〃w51、黑曲霉(y4jpwg77/Msm.ger)、米曲霉(y^erg7.〃附ofyzae)、^f孑包^l大嫌孑包(Fwsar/wm6acfr/Wo/(ie力、禾谷嫌孑包(Fwsan-"mcerea/h)、庫威鐮孑包(Fwsan'wmcroo^we〃e"se)、大刀鐮孑包(Fz^an'wmcw/morwm)、禾本牙牛鐮孑包(Ftwcrn'wmgraw/wearwm)、禾赤鐮孑包(Fwsfln'M/77gra;m/www)、異孑包鐮孑包(Fwsan'wm/zeferos/3on/w)、合2欠木錄孑包(Fwsar/wmwegi<w<i/)、尖嫌孑包(Fusar/wm0x3Asp0ram)、多枝鐮孑包(Fusan'wmreWcw/afwm)、4分紅鐮孑包(Fwran'wwrasewm)、4妻骨木鐮孑包(Fwsfln-wwi^wZ)Mc/ww柳)、月夫色鐮孑包(FMSfl廠/wws"/x"oc/^owm)、^以分沖支孑包鐮孑包(Fwsan'wms/orafr/c/z/o/ofes1)、石危色鐮孑包(F"5(ar/M/wyw/z/wreww)、圓鐮孑包(F船an.wmtorw/aswm)、擬絲孑包鐮孑包(Fwsan-wmWc/zc^/zec/o/c/as)、4裏片鐮孑包(T^""n'畫vewewa,匿)、特異腐質霉(//廳/co/",rao/e"力、疏棉狀腐質霉(//w鹿'co/a/朋wg/woya)、米黑毛霉(Mwcorm/e/ze/)、嗜熱毀絲霉(A^ce/—似/2ora/zermop/z//a)、4且4造月永孑包菌(iVeMn^/orafcrowa)、產紫青霉(尸em'"'〃/M附/w^pMrage履m)、哈茨木霉(7Hc/zo(ie削a/z"Cam/m)、康亍木霉(7Hc/zoflfe環aA:ow/wg7'/)、長沖支木審(7/c/2o^fe/7W(3/o"g7力rac/H.(^Mm)、里氏木審(7/c/zo(3ferma/^ese/)或綠色木霉(7Hc/20Cifermav/n'刮多月太。在另外的優選方面，所述多肽是具有內切葡聚糖酶活性的77nWav/a瘤孑包斗炎孑包殼(777/e/av/aj^edet/om'wm)、毛才炎孑包殼(772/e/av/asefosa)、77n'e/av/a■sMZ>f/e^7wo/7/7//a、土生斗復孑包霧、T72/e/aWafem'co/a、77zz'e/av/<3thermophila、77n'e/av/(3van'oy/ora或T7zz.e/av/a職ra."g,/多月太。在更優選的方面，所述多肽是具有內切葡聚糖酶活性的土生梭孢霉多肽，并且最優選是具有內切葡聚糖酶活性的土生梭孢霉NRRL8126多肽，例如SEQIDNO:2的多肽或其成熟多肽。可理解的是對于前述的種，本發明包含完全和不完全階段(perfectandimperfectstates),和其它分類學的等同物(equivalent),例如無性型(anamorph)，無論它們已知的種名。本領域熟練技術人員將輕易地識別適合的等同物的同一性。這些種的菌抹在許多培養物保藏中心對于公眾能夠輕易地取得，所述保藏中心諸如美國典型培養物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物和細胞培養物保藏中心(DeutscheSammiungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSM)、真菌菌種保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和農業研究機構專利培養物保藏中心北區研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)。此外，可以使用上述的探針從其它來源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物鑒定和獲得這些多肽。用于從天然生境(habitat)分離微生物的技術是本領域內公知的。隨后可通過相似地篩選這種微生物的基因組或cDNA文庫來獲得所述多核苷酸。一旦用所述探針檢測到編碼多肽的多核苦酸序列，就能夠使用本領域普通技術人員熟知的技術將所述多核苷酸分離或克隆(參見，例如，Sambrook"a/.,1989，見上文)。本發明的多肽還包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中將另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通過將編碼另一種多肽的核苷酸序歹'J(或其部分)融合于本發明的核苷酸序列(或其部分)來產生融合的多肽。產生融合多肽的技術是本領域已知的，包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們在閱讀框中，并且使融合多肽的表達在相同啟動子和終止子的控制下。多核苷酸本發明還涉及分離的多核苷酸，其包含編碼具有內切葡聚糖酶活性的本發明的多肽的核苷酸序列，或由該核苷酸序列組成。在優選的方面，核苷酸序列包含SEQIDNO:1或由其組成。在另外的更優選的方面，核苷酸序列包含大腸桿菌NRRLB-30837中所含質粒pTter7F中的序列，或由該序列其組成。在另外的優選方面，核苷酸序列包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼區或由其組成。在另外的優選方面，核苷酸序列包含SEQIDNO:1的核苷酸52至1008或由其組成。在另外的更優選的方面，核芬酸序列包含大腸桿菌NRRLB-30837中所含質粒pTter7F中的成熟多肽編碼區或由其組成。本發明還包含編碼下述多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或其成熟多肽，或由SEQIDNO:2的氨基酸序列或其成熟多肽組成；由于遺傳密碼的簡并性，所述核苷酸序列不同于SEQIDNO:1或其成熟多肽編碼序列。本發明還涉及SEQIDNO:1的亞序列，所述亞序列編碼具有內切葡聚糖酶活性的SEQIDNO:2的片段。本發明還涉及突變多核苷酸，所述突變多核苷酸在SEQIDNO:l的成熟多肽編碼序列中包含至少一個突變，其中所述突變核苷酸序列編碼SEQIDNO:2的成熟多肽。在優選的方面，所述成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸18至336。用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術是本領域內已知的，包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合。可通過例如使用熟知的聚合酶鏈式反應(PCR)或表達文庫的抗體篩選來檢測具有共有結構特性的克隆DNA片段，從而實現從這種基因組DNA克隆本發明的多核苷酸。參見，例^口，Innisa/.,1990，PCi..爿Gi//<ietoMef/zo<is4p/^ca/7'cw,AcademicPress,NewYork。可以使用其它核酸擴增方法，例如連接酶鏈式反應(LCR)、連接活化轉錄(ligatedactivatedtranscription;LAT)和基于核苷酸序歹'J的擴增(NASBA)。可以從梭孢殼屬(77z/e/aWa)的菌抹，或從其它或相關的生物體克隆多核苷酸，并且因此可以是例如所述核苷酸序列的多肽編碼區的等位基因變體或種變體(speciesvariant)。本發明還涉及包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有至少60%,優選至少65%，更優選至少70%,更優選至少75%，更優選至少80%,更優選至少85%,更優選至少90%,甚至更優選至少95%，并且最優選至少97%同一性的同一性程度，所述多核芬酸編碼活性多肽。在優選的方面，所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:1的核苷酸52至1008。修飾編碼本發明多肽的核苷酸序列對于合成與所述多肽基本上相似的多肽可能是必需的。術語與所述多肽"基本上相似"指多肽的非天然存在的形式。這些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于從其天然來源分離的多肽，例如，比活性、熱穩定性、最適pH等方面不同的人工變體。可以在作為SEQIDNO:l的多肽編碼區存在的核苷酸序列，例如其亞序列的基礎上，和/或通過引入如下核苷酸取代來構建變體序列所述取代不產生由核苷酸序列編碼的多肽的另外的氨基酸序列，但是符合意欲產生酶的宿主生物體的密碼子選擇；或者所述取代可產生不同的氨基酸序列。關于核苷酸取代的概述，參見，例》口，Forda/.,1991,awdPwr/^Ica/iow2:95-107。對于本領域技術人員顯而易見的是，這些取代能夠在對于分子功能重要的區域之外進行，并且仍然產生活性多肽。對于由本發明的分離的多核苷酸編碼的多肽活性關鍵的并且因此優選不進行取代的氨基酸殘基，可以根據本領域公知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區誘變法(參見，例如，CunninghamandWells,1989,Sc/ewce244:1081-1085)來鑒定。在后一的技術中，將突變引入到分子中的每個正電殘基處，并且測試所得突變分子的內切葡聚糖酶活性，以鑒定對于所述分子的活性關鍵的氨基酸殘基。底物-酶相互作用的位點也能夠通過分析三維結構測定，通過如核7磁共振分析、晶體學或光親和標記這樣的技術來測定(參見，例如，deVos"a/"1992,Sc/e"ce255:306-312;Smith"1992，Jow聰/o/Mo/ecw/w腸/，224:899-904;Wlodaver"a/.,1992,309:59-64)。本發明還涉及編碼本發明多肽的分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸在非常低嚴緊條件下，優選低嚴緊條件，更優選中等嚴緊條件，更優選中-高嚴緊條件，甚至更優選高嚴緊條件，并且最優選非常高的嚴緊條件下，與以下序列雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈；或它們的等位變體和亞序列(Sambrook"fl/.，1989,見上文)，如本文所定義的。在優選的方面，所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:1的核香酸52至1008。本發明還涉及分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸通過以下方法獲得(a)在非常低、低、中、中-高、高或非常高嚴緊條件下，將DNA的群體與以下序列雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈；和(b)分離雜交的多核苷酸，其編碼具有內切葡聚糖酶活性的多肽。在優選的方面，所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:1的核苷酸52至1008。核酸構建體本發明還涉及包含本發明的分離的多核苷酸的核酸構建體，所述分離的多核苷酸與一個或多個調控序列可操作地連接，所述調控序列在合適的宿主細胞中在與該調控序列相容的條件下指導編碼序列的表達。可以用許多方式操作編碼本發明多肽的分離的多核苷酸以提供多肽的表達。依賴于表達載體，在將多核苷酸的序列插入載體之前對其進行操作可能是理想的或必需的。使用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術是本領域熟知的。調控序列可以是合適的啟動子序列，其是由用于表達編碼本發明多肽的多核苷酸的宿主細胞識別的核苷酸序列。啟動子序列含有介導多肽的表達的轉錄調控序列。啟動子可以是在所選的宿主細胞中顯示轉錄活性的任何核苷酸序列，包括突變的、截斷的和雜合的啟動子，并且可以從編碼與宿主細胞同源或異源的胞外或胞內多肽的基因獲得。用于指導本發明的核酸構建體轉錄，特別是在細菌宿主細胞中轉錄的合適啟動子的實例是從下述獲得的啟動子大腸桿菌/flc操縱子、天藍色鏈霉菌(5^印to^yc"￡///00瓊脂糖酶基因(^^4)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(犯cB)、地衣芽孢桿菌a-淀粉酶基因(a附y丄)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產麥芽淀粉酶基因(a/w;;M)、解淀粉芽孢桿菌ot-淀粉酶基因(a^y0、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(pe"尸)、枯草芽孢桿菌矽M和砂/S基因和原核P-內酰胺酶基因(Villa-Kamaroff"a/.,1978,尸raceWwgsA^'owa/爿cod倒y5We"ces,75:3727-3731),以及toc啟動子(DeBoer"a/.，1983，尸race函^AeWa"o腦/v4ca^附yo/&/e"c"L/SJ80:21-25)。另外的啟動子在"Useflilproteinsfromrecombinantbacteria"in5We油yc爿men'caw，1980,242:74-94中；和在見上文中有所描述。用于指導本發明的核酸構建體在絲狀真菌宿主細胞中轉錄的合適啟動子的實例是從下列酶的基因獲得的啟動子米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(//2/加mMCW,Wze/)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性a-淀粉酶、黑曲霉酸穩定性a-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(g/6")、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構酶、構巢曲霉乙酰胺酶、鑲片鐮孢淀粉葡糖苦酶(WO00/56900)、鑲片鐮孢Daria(WO00/56900)、鑲片鐮孢Quinn(WO00/56900)、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(WO96/00787)、里氏木霉P-葡糖芬酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉纖維二糖水解酶II、里氏木霉內切葡聚糖酶I、里氏木霉內切葡聚糖酶II、里氏木霉內切葡聚糖酶III、里氏木霉內切葡聚糖酶IV、里氏木霉內切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉P-木糖苷酶，以及NA2-tpi啟動子(來自黑曲霉中性a-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸異構酶基因的啟動子的雜合體)；和它們的突變的、截斷的和雜合的啟動子。在酵母宿主中，有用的啟動子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(ENO-l)、S良酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氬酶(ADH1，ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構酶(TPI)、S良酒酵母金屬硫蛋白(CUP1)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。對于酵母宿主細胞其它有用的啟動子由Romanos"a/.，1992,8:423-488描述。調控序列也可以是合適的轉錄終止子序列，是由宿主細胞識別以終止轉錄的序列。所述終止子序列與編碼所述多肽的核苷酸序列的3'末端可操作地連接。可以將在所選宿主細胞中有功能的任何終止子用在本發明中。對于絲狀真菌宿主細胞優選的終止子從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構巢曲霉鄰氨基苯曱酸合酶、黑曲霉a-葡糖苦酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。對于酵母宿主細胞優選的終止子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細胞色素C(CYCl)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。對于酵母宿主細胞其它有用的終止子由Romanos"a/.,1992,見上文描述。調控序列還可以是合適的前導序列，其是對于宿主細胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區。前導序列可操作地連接于編碼多肽的核苷酸序列的5，-末端。可以將在所選宿主細胞中有功能的任何前導序列用在本發明中。對于絲狀真菌宿主細胞優選的前導序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶和構巢曲霉丙糖磷酸異構酶。對于酵母宿主細胞合適的前導序列從如下酶的基因獲得釀酒酵母晞醇化酶(ENO-l)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母a因子和釀酒酵母醇脫氬酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)。調控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是與核苷酸序列的3，末端可操作地連接的序列，并且在轉錄時，宿主細胞將其識別為將聚腺芬殘基添加至轉錄的mRNA的信號。可以將在所選宿主細胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本發明中使用。對于絲狀真菌宿主細胞優選的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構巢曲霉鄰氨基笨曱酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉a-葡糖苷酶。對于酵母宿主細胞有用的聚腺香酸化序列由GuoandSherman,1995，iWo/ecw/arCe〃w/w仏'o/ogy15:5983-5990描述。調控序列還可以是信號肽編碼區，其編碼與多肽的氨基末端相聯的氨基酸序列，并且指導編碼的多肽進入細胞分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列5，端可固有地包含信號肽編碼區，其與編碼分泌多肽的編碼區片段一起天然地連接在翻譯閱讀框中。可供選擇的是，編碼序列5'端可含有對于所述編碼序肽編碼區時可能是必需的。或者，外源信號肽編碼區可以簡單地取代天然信號肽編碼區以增強多肽的分泌。然而，指導表達的多肽進入所選宿主細胞的分泌途徑(即，分泌至培養基中)的任何信號肽編碼區可在本發明中使用。對于細菌宿主細胞有效的信號肽編碼區是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼區芽孢桿菌屬NCIB11837產麥芽糖淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌a-淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢桿菌(3-內酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(/7;rr,"pr&，rM)和枯草芽孢桿菌。另外的信號月太由SimonenandPalva,1993，Mz'cra//o/og7'ca/iev/en^57:109-1374苗述。對于絲狀真菌宿主細胞有效的信號肽編碼區是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼區米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特異腐質霉纖維素酶、特異腐質霉內切葡聚糖酶V和疏棉狀腐質霉脂肪酶。在優選的方面，信號肽是SEQIDNO:2的氨基酸l至17。在另外的優選方面，信號肽編碼區是SEQIDNO:1的核苦酸1至51，其編碼SEQIDNO:2的氨基酸1至17。對于酵母宿主細胞有用的信號肽從釀酒酵母a因子和釀酒酵母轉化酶的基因獲得。其它有用的信號肽編碼區由Romanos"a/.，1992，見上文，描述。調控序列還可以是前肽編碼區，其編碼位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))。前多肽通常是無活性的并且能夠通過前肽的催化或自催化切割從前多肽轉化成成熟活性多肽。可以從枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(a/r五)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶07/^7)、釀酒酵母a因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲霉漆酶(WO95/33836)的基因獲得前肽編碼區。當信號肽和前肽區二者均出現在多肽的氨基末端時，將前肽區置于緊接著(nextto)多肽氨基末端，并且將信號肽區置于緊接著前肽區的氨基末端。同樣理想的是添加調節序列，其允許相對于宿主細胞的生長來調節多肽化合物的存在而開啟或關閉的那些系統。原核系統中的調節系統包括/ac、toc和frp操縱基因系統。在酵母中，可以使用ADH2系統或GAL1系統。在絲狀真菌中，可以使用TAKAa-淀粉酶啟動子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子作為調節序列。調節序列的其它實例是那些允許基因擴增的序列。在真核系統中，這些序列包括在氨曱蝶呤(methotrexate)存在下擴增的二氪葉酸還原酶基因，和以重金屬(withheavymetal)擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核苷酸序列將與調節序列可操作地連接。表達載體本發明還涉及重組表達載體，所述重組表達載體包含本發明的多核苷酸、啟動子和轉錄和翻^^終止信號。本文所述的多種核酸和調控序列可以結合在一起以產生重組表達載體，所述表達載體可以包括一個或多個方便的限制位點以允許在這些位點插入或取代編碼多肽的核苷酸序列。可供選擇的是，可以通過在合適的用于表達的載體中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸構建體來表達本發明的核苷酸序列。在制備表達載體的過程中，將編碼序列置于載體中，從而將該編碼序列與合適的表達調控序列可操作地連接。重組表達載體可以是任何載體(例如，質粒或病毒)，其能夠方便地進行重組DNA步驟，并且能夠產生核苷酸序列的表達。載體的選擇將通常依賴于載體與將引入該載體的宿主細胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環狀質粒。載體可以是自主復制載體，即，作為染色體外實體(entity)存在的載體，其復制獨立于染色體復制，例如，質粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復制的手段(means)。或者，載體可以是一種當被引入宿主細胞中時，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復制的載體。此外，可以使用單獨的載體或質粒或兩個或更多個載體或質粒，其共同含有待引入宿主細胞基因組的完整DNA(totalDNA)，或可以j吏用轉座子(transposon)。本發明的載體優選地含有一個或多個選擇性標記，其允許筒單選擇經轉化、轉染、轉導等的細胞。選擇性標記是基因，其產物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養缺陷型的原養性(prototrophytoauxotrophs)等。細菌選擇性標記的實例是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的&/基因，或賦予抗生素抗性的標記，所述抗生素抗性例如氨節青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環素抗性。對于酵母宿主細胞合適的標記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于絲狀真菌宿主細胞的選擇性標記包括但不限于cw^S(乙酰胺酶)、fl^S(鳥氨酸氨曱酰基轉移酶)、6ar(草銨膦(phosphinothricin)乙酰轉移酶)、(潮霉素磷酸轉移酶)、m'aD(硝酸還原酶)(nitratereductase),/少rG(享'L清酉臾斗亥苦-5，-石粦酉菱脫叛酵)(orotidine-5，-phosphatedecarboxylase),sC(硫酸腺苷酰轉移酶)和^pC(鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它們的等價物。優選用在曲霉屬細胞中的是構巢曲霉或米曲霉的am<iS禾口/7>7-(7基因和吸水《連霉菌(5^eptomyce/^groscop/ci^)的6ar基因。本發明的載體優選含有元件，其允許載體整合入宿主細胞基因組或載體在細胞中獨立于基因組的自主復制。為了整合入宿主細胞基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸的序列或用于通過同源或非同源重組整合入基因組的任何其它載體元件。或者，載體可以含有額外的核苷酸序列，用于指導通過同源重組整合入宿主細胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應該優選含有足夠數量的核酸，如100至10,000堿基對，優選400至io，ooo堿基對，并且最優選800至10，000堿基對，其與相應的目標序列具有高度同一性以增強同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與宿主細胞基因組中的目標序列同源。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的核苦酸序列。另一方面，可以將載體通過非同源重組整合到宿主細胞基因組中。為了自主復制，載體可以進一步包含復制起點，其使載體能夠在所述的宿主細胞中自主地復制。復制起點可以是介導自主復制的任何質粒復制子(replicator),其在細胞中發揮功能。術語"復制起點"或"質粒復制子"在本文定義為能夠4吏質粒或載體體內復制的核苷酸序列。細菌復制起點的實例是允許在大腸桿菌中復制的質粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復制起點，和允許在芽孢桿菌屬中復制的質粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMJ31的復制起點。用于酵母宿主細胞中的復制起點的實例是2微米復制起點，ARS1,ARS4,ARS1和CEN3的組合，和ARS4和CEN6的組合。在絲狀真菌細胞中有用的復制起點的實例是AMA1和ANS1(Gems"a/.,1991,G匿98:61-67;Cullen&a/.，1987,M/c/e/d油7e廳rc/15:9163-9175;W000/24883)。分離AMA1基因和構建包含該基因的質粒或載體能夠根據公開于WO00/24883中的方法完成。可以將多于一個拷貝的本發明的多核苷酸插入宿主細胞以增加基因產物的產生。多核苷酸拷貝數的增加可通過如下方法獲得將至少一個額外拷貝的序列整合入宿主細胞基因組，或包括與多核苷酸一起的可擴增的選擇性標記基因，其中細胞含有選擇性標記基因的擴增的拷貝，并且由此可通過在合適的選擇劑(selectableagent)存在下培養細胞來選擇多核苷酸的額外拷貝。用于連接上述元件以構建本發明重組表達載體的方法是本領域技術人員熟知的(參見，例如，SambrookWa/.,1989,見上文)。宿主細月包本發明還涉及重組宿主細胞，所述重組宿主細胞包含本發明的多核苷酸，將其有利地用于多肽的重組產生中。將包含本發明多核苷酸的載體引入宿主細胞中，從而將該載體保留作為染色體整合體(chromosomalintegrant)或作為前述的自復制的染色體外載體。術語"宿主細胞"包含親本細胞的任何子代，其由于復制過程中發生的突變而與親本細胞不相同。宿主細胞的選擇將很大程度依賴于編碼多肽的基因和它的來源。宿主細胞可以是單細胞微生物，例如，原核生物，或非單細胞微生物，例》。，真4亥生物。有用的單細胞微生物是細菌細胞，例如革蘭氏陽性細菌，包括但不限于，芽孢桿菌屬細胞，例如，嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌(S""7/wc/aw^Y)、凝結芽孢桿菌、杣爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌；或鏈霉菌屬細胞，例如，淺青紫鏈霉菌和鼠灰鏈霉菌，或革蘭氏陰性細菌例如大腸桿菌和假單胞菌屬菌種。在優選的方面，細菌宿主細胞是遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細胞。在另外優選的方面，芽孢桿菌屬細胞是嗜堿的芽孢桿菌屬。可通過如下方法實現將載體引入到細菌宿主細胞例如原生質體轉化(參見，例如，ChangandCohen,1979，M/簡/"rG匿ra/G麼"c^168:111-115),孑吏用感受態纟田月包(參見，例i口，YoungandSpizizen，1961,Jow77a/o/fiac&n'o/ogy81:823-829或DubnauandDavidoff-Abelson,1971,Jow77a/Mo/ecw/ar歷o/ogy56:209-221)，電穿孔(參見，例如，ShigekawaandDower,1988,腸fec/zw々腦6:742-75l)或接合(參見，例如，KoehlerandThorne,1987,Jo畫fl/。/"fl"e/油gy169:5771-5278)。宿主細胞還可以是真核生物，例如哺乳動物、昆蟲、才直物或真菌細胞。在優選的方面，宿主細胞是真菌細胞。"真菌"用在本文包括以下門子嚢菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和4妾合菌門(Zygomycota)(^口由Hawkswortha/"y^>w>voW/7<3"<ifi&^y》Z)/crt,o腦^o/77zeFwwgi，8thedition,1995,CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK所定義)以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth"a/.,1995，見上，171頁中所引用)，和所有有絲分裂孢子真菌(mitosporicflmgi)(Hawksworth"a/.，1995,見上)。在更優選的方面，真菌宿主細胞是酵母細胞。"酵母"用在本文包括產子嚢酵母(ascosporogenousyeast)(內孑包霉目(Endomycetales))、產擔子酵母(basidiosporogenousyeast)禾口屬于半殺口菌類(FungiImperfecti)(芽孑包纟岡(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類在未來可能改變，就本發明而言，將酵母定義為如BZo/ogy<3/7<iJc"'v/rieso/yeasf(Skinner，F.A.,Passmore,S.M.,andDavenport,R.R.，eds,5bcj//.5"cferZo/.Sjtw/oj7.m淤Se廠/esNo.9,1980)中所述。在更加優選的方面，酵母宿主細胞是念珠菌屬、漢遜酵母屬(//朋^,^)、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍霉屬細胞。在最優選的方面，酵母宿主細胞是卡爾酵母，釀酒酵母，糖化酵母，道格拉氏酵母，克魯弗酵母，諾地酵母或卵形酵母細胞。在另外最優選的方面，酵母宿主細胞是乳酸克魯維酵母(《/《yveramycM/ac&)細胞。在另外最優選的方面，酵母宿主細胞是K^7wWa/,>o/;^cfl纟田月包。在另外更優選的方面，真菌宿主細胞是絲狀真菌細胞。"絲狀真菌，，包括真菌門(Eumycota)和卵菌門的亞門(如由Hawksworth""/.,1995,見上文，所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特征在于由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它復雜多糖組成的菌絲體壁。通過菌絲延伸進行營養生長，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營養生長通過單細胞菌體的出芽生殖(budding)進行，而碳分解代謝可以是發酵的。在甚至更優選的方面，絲狀真菌宿主細胞是枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬(^/erA:awcfera)、On^on-o/j^、鬼傘屬(Copn'raw)、革蓋菌屬(Con'o/w力、隱球菌屬、F/肋似Wwm、鐮孢屬、腐質霉屬、梨孢菌屬(Mag腦/x"/ze)、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬(7Veoca〃/w"Wx)、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬CP/2朋erac/2aefe)、射脈菌屬(尸WA/a)、瘤胃壺菌屬(尸/ramyce》、側耳屬CP/wra&力、裂褶菌屬、踝節菌屬、嗜熱子嚢菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬(7b《ypoc/aAww)、栓菌屬(rrawete力或木霉屬細胞。在最優選的方面，絲狀真菌宿主細胞是泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構巢曲霉、黑曲霉或米曲霉細胞。在另外的最優選方面，絲狀真菌宿主細胞是桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、石克色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢細胞。在另外最優選的方面，絲狀真菌宿主細胞是黑刺煙管菌(5yenfaw&raCer—"'op*g77vece似、Ce一on-。拜j戶朋o",wto、Cer—r—57's",vw/os"、Cer—n'o戶isw6ri(/^、Ce一。n'o戸Ssw6ve環—ora、灰蓋鬼傘(Q戸.m"c/"ere附)、毛革蓋菌(Con'o/ws/7/"wfM力、沖爭異腐質霉、逸乾才帛^犬腐質霉、米《赤毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產紫青霉、黃孢平革菌(尸/2朋erac/^^ec/z/^sospon'MW)、輻射射月永菌(尸/z/e6/ara&'ato)、尸/ewra/i^e/-_y"g//、T7z/e/av/a瘤孑包才發孑包殼、毛沖炎孑包殼、777/e/"v/asM6/Z7ermo/7/n7a、土生氺麥孑包審、77z/e/av/"ferr/co/a、T7nWav/athermophila、r/z/e/av/av腦'ospora、77z/eAarWawara'"g//、7h3聽tesvz'〃oa、vera'co/or、哈茨木霉、康亍木霉、長枝木霉、里氏木霉或綠色木霉細胞。。可以將真菌細胞通過涉及原生質體形成、原生質體轉化和細胞壁重建的方法以本身公知的方式轉化。用于轉化曲霉屬和木霉屬宿主細胞的合適方法在EP238023和Yeltonda/"1984,7V。ceW"g^AeAto/owa/v4c"fifewy^SWe"c^WW81:1470-1474中描述。用于轉化鐮孢屬菌種的合適方法由Malardier"a/.，1989,G麼78:147-156和WO96/00787描述。可以使用由如下文南大4苗述的方法4爭4匕酵母BeckerandGuarente，Abelson,J.N.andSimon，M丄,editors,GW<ietoJfeo^Gee""面iiMa/ecw/ar歷o/c^，她/Zzofi^Volume194,pp182-187,AcademicPress,Inc.,NewYork;Itoda/.,1983,Jowr腦/o/Bac/eWo/ogy153:163;和Hinnena/.,1978,f/ze7Variowa/爿cat/emy。/5Wewces1t7S^475:1920。產生方法本發明還涉及用于產生本發明多肽的方法，其包括(a)在有益于產生多肽的條件下培養細胞，所述細胞以其野生型形式能夠產生所述多肽；和(b)回收所述多肽。在優選的方面，所述細鳴是梭孢殼屬的細胞。在更優選的方面，所述細胞是土生梭孢霉。在最優選的方面，所述細胞是土生梭孢霉NRRL8126。本發明還涉及用于產生本發明的多肽的方法，其包括(a)在有益于產生多肽的條件下培養宿主細胞；和(b)回收所述多肽。本發明還涉及用于產生本發明的多肽的方法，包括(a)在有益于產生多肽的條件下培養宿主細胞，其中所述宿主細胞包含突變核苷酸序列，其在SEQIDNO:l的成熟多肽編碼序列中具有至少一個突變，其中所述突變核苷酸序列編碼由SEQIDNO:2的成熟多肽組成的多肽，和(b)回收所述多肽。在優選的方面，所述成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸18至336。在本發明的產生方法中，使用本領域熟知的方法在適合于產生所述多肽的營養培養基中培養細胞。例如，可以通過在合適培養基中和允許表達和/或分離所述多肽的條件下進行的搖瓶培養，和實驗室或工業發酵罐中的小規模或大規模發酵(包括連續、分批、補料分批或固態發酵)來培養細胞。使用本領域已知的方法在合適的營養培養基中進行培養，所述營養培養基包含碳源和氮源和無機鹽。合適的培養基能夠從商業供應商獲得或可以根據公布的成分制備(例如，在美國典型培養物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營養培養基中，該多肽能夠從所述培養基中直接回收。如果多肽不分泌到培養基中，其能夠從細胞裂解物(lysate)回收。可以使用本領域已知的對于所述多肽是特異性的方法來檢測多肽。這些檢測方法可包括特異性抗體的使用、酶產物的形成或酶底物的消失。例如，酶試-驗(enzymeassay)可用于測定如本文所述的多肽的活性。所得多肽可以^f吏用本領域已知的方法回收。例如，多肽可以通過常身見方法從營養培養基中回收，所述常規方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發或沉淀。本發明的多肽可以通過多種本領域已知的方法純化以獲得基本上純的多肽，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型(preparative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或提取(參見，例如，尸rafe/"PMnyc加/ow，J,C.JansonandLarsRyden,editors,VCHPublishers,NewYork,1989)。植物本發明還涉及轉基因植物、植物部分或植物細胞，將其用編碼本發明的具有內切葡聚糖酶活性的多肽的核苷酸序列轉化，從而以可回收的量表達和產生所述多肽。多肽可從植物或植物部分回收。或者，同樣可以將含有該重組多肽的植物或植物部分用于改進食品或飼料的質量，例如，改進營養價值、適口性(palatability)和流變性質(rheologicalproperties),或用于石皮壞抗營養因子。轉基因植物可以是雙子葉的(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)。單子葉才直物的實例是草(grasses),如草i也早熟禾(meadowgrass)(藍草(bluegrass),早熟禾屬(尸oa));飼用牧草(foragegrass)如羊茅屬(FeWwca)、黑麥草屬(丄o/z'wm);寒地型牧草(temperategrass),如Agrostis;和谷類，例如，小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。雙子葉植物的實例是》因草(tobacco),豆類(legumes)，如羽扇豆(lupins)，馬鈴薯，糖^f"菜(sugarbeet)，豌豆，豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(familyBrassicaceae))，如花挪菜(cauliflower),油菜籽(rapeseed)和緊密相關的模型生物體擬南芥(^ra^Wop^//za/z'a"a)。植物部分的實例是莖(stem)、愈傷組織(callus)、葉(leaf)、根(root)、果實(fmit)、種子(seed)和塊莖(tuber)，以及包含這些部分的獨立組織，例如，表皮(epidermis)、葉肉(mesophyll)、薄壁組織(parenchyma)、維管組織(vasculartissue)、分生組織(meristem)。具體的才直物細月包區室(compartments),如葉纟錄體(chloroplast)、質夕卜體(apoplast)、線粒體(mitochondria)、液泡(vacuole)、過氧化物酶體(peroxisome)和細胞質(cytoplasm)也一皮認為是植物部分。此外，任何植物細胞，無論什么組織來源，都被認為是植物部分。同樣地，植物部分，如分離以促進本發明的應用的具體組織和細胞也被認為是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊4分(aleurone)和種皮(seedcoat)。同樣包含于本發明范圍內的還有這些植物、植物部分和植物細胞的子代。表達本發明多肽的轉基因植物或植物細胞可以依照本領域已知方法構建。簡而言之，通過如下方法構建所述植物或植物細胞將編碼本發明多肽的一個或多個表達構建體并入植物宿主基因組或葉綠體基因組，并且繁殖所得的修飾植物或植物細胞成為轉基因植物或植物細胞。表達載體便利地是包含編碼本發明多肽的多核苷酸的核酸構建體，所述多核普酸與在選擇的植物或植物部分中表達該多核苷酸序列所必需的適當的調節序列可操作地連接。此外，表達構建體可以包含對于鑒定宿主細胞有用的選擇性標記，在所述宿主細胞中整合了表達構建體和將該構建體51入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依賴于使用的DNA引入方法)。調節序列的選擇，例如啟動子和終止子序列和任選地信號或轉運序列的選擇，舉例來說，基于期望何時、何處以及如何表達多肽而確定。例如，編碼本發明多肽的基因的表達可以是組成型的或誘導型的，或可以是發育、階段或組織特異性的，并且基因產物可以靶向特定的組織或植物部分例如種子或葉。調節序列由例如Tague"fl/.,1988，P/a"/尸/z，/o/ogy86:506所述。對于組成性表達，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1和稻肌動蛋白1啟動子(Franck"a/"1980,CW/21:285-294,Christensenda/"1992,尸/耐M.5/o/.18:675-689;Zhanga/.，1991，P/""/Ce〃3:1155-1165)。器官特異性啟動子可以是例如來自貯藏庫組織(storagesinktissue)例如種子、馬鈴薯塊莖和果實的啟動子(Edwards&Coruzzi，1990，J朋.iev.24:275-303)，或來自代謝庫組織(metabolicsinktissue)例如分生組織的啟動子(Itoeffl/.，1994,P/a"Mo/.所o/.24:863-878)，種子特異性啟動子諸如來自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)啟動子(Wu等，1998，尸/a^am/Ce〃尸/z",'o/ogy39:885-889),來自豆球蛋白(legumin)B4和蠶豆(Wc/a/a^)的未知的種子蛋白基因的蠶豆啟動子(Conrad等，1998，Jowma/o/尸/朋f尸/;^'ofogy152:708-711)、來自種子油體蛋白(oilbodyprotein)的啟動子(Chen等，1998,PlantandCellPhysiology39:935-941)，來自歐洲油菜(5mw/ca腦pw)的貯藏蛋白napA啟動子，或本
技術領域：
公知的任何其他種子特異性的啟動子，例如，在WO91/14772中所描述的。此外，啟動子可為葉特異性的啟動子，如來自稻或番茄的A"啟動子(Kyozuka等，1993，戶/a^102:991-1000),小球藻病毒(chlorellavirus)腺嘌呤曱基轉移酶(adeninemethyltransferase)基因啟動子(Mitra禾口Higgins，1994,尸/a"fMo/ecw/arB/o/ogv26:85-93)，或來自稻的aWP基因啟動子(Kagaya等，1995，Mo/ecw/"r248:668-674)，或傷口誘導的啟動子，如馬鈐薯pin2啟動子(Xu等，1993,尸/aWMo/ecw/arfi/o/ogv22:573-588)。同樣地，所述啟動子可通過非生物的處理誘導，所述脊生物的處理諸如溫度、干旱或鹽度變化，或通過外源應用的激活所述啟動子的物質誘導，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物;敫素(planthormones)長口乙丈希、脫落酉臾(abscisicacid)、赤霉&臾(gibberellicacid)和/或重金屬。啟動子增強子元件也可以用于實現本發明多肽在植物中的較高表達。例如，啟動子增強子元件可以是內含子，將其置于啟動子和編碼本發明多肽的核苦酸序列之間。例如Xu^a/.,1993,見上，公開了使用稻肌動蛋白1基因的第一內含子以增強表達。選擇性標記基因和表達構建體的任何其它部分可以選自本領域內可用的那些。將核酸構建體根據本領域已知的常規技術并入植物基因組，所述常規技術包括土壤桿菌屬04graZ)fl"er/Mm)介導的轉化、病毒介導的轉化、顯微注射(microinjection)、粒子轟擊、生物射彈轉化和電穿孑L(Gasserda/.，1990，5We"ce244:1293;Potrykus,1990,說o/Tec/z"o/ogy8:535;Shimamotoda/.,1989，A^w^338:274)。目前,才艮癌土i襄斥干菌(JgroZ)(3c/er/wwwwey^c/e"力介導的基因4爭移(genetransfer),是產生轉基因雙子葉植物的優選方法(為了參考，見Hooykas和Schilperoort，1992，尸/a^Mo/ecM/ar19:15-38),而且它也可以用于轉化單子葉植物，雖然對于這些植物其他的轉化方法是常用的。目前，產生轉基因單子葉植物的優選的方法，是用粒子(用轉化DNA涂覆的微觀的金或鴒粒子)轟擊胚愈傷組織(embryoniccalli)或發育中的胚(developingembryos)(Christou,1992，尸/aw/1Jowma/2:275-281;Shimamoto,1994,Cr抓Qp/w'ow5:158-162;Vasiletal.,1992,j5/'o/rec/z"o/ogv10:667-674)。轉化單子葉植物的可供選擇的方法，是基于原生質體轉化，如由Omirulleh等，1993，尸/amMo/ecw/arAWogy21:415-428所描述的。轉化之后，根據本領域熟知的方法選擇具有并入的表達構建體的轉化體并且再生成為完整植物。通常設計轉化方法用于通過如下方法在再生期間或在后續世代中選擇性消除選擇基因例如，使用帶有兩種獨立的T-DNA構建體的共轉化或通過特異性重組酶位點特異性地切除選擇基因。肽的條件下培養轉基因植物或植物細胞，其包含編碼本發明具有內切葡聚糖酶活性的多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。去除或減少內切葡聚糖酶活性本發明還涉及用于產生親本細胞突變體的方法，其包含破壞或缺失編碼本發明的多肽的多核苷酸序列或其部分，所述方法導致在相同條件下培養時，fJ巴，EJfG犬叉曰3朔/JCv可以使用本領域熟知的方法通過減少或消除編碼本發明多肽的核苷酸序列的表達，例如，插入、破壞、取代或缺失來構建突變細胞。在優選的方面，所述核苷酸序列是失活的。待修飾或失活的核苷酸序列可以是，例如，編碼區或其對活性關鍵的部分，或表達編碼區必需的調節元件。這種調節或調控序列的實例可以是啟動子序列或其功能部分，即，足以影響核苷酸序列表達的部分。用于可能的修飾的其它調控序列包括但不限于前導序列、聚腺苦酸化序列、前肽序列、信號肽序列、轉錄終止子和轉錄激活子。可以通過向親本細胞施以誘變，并且選擇其中已將所述核苷酸序列的表達減少或消除的突變細胞來進行核香酸序列的修飾或失活。誘變可能是特異性的或隨機的，可以通過例如使用合適的物理或化學誘變劑進行，通過使用適合于本發明目的的物理或化學誘變劑的實例包括紫外線(UV)照射、羥胺、N-曱基-N'-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、O-曱基羥胺、亞硝酸、乙基曱烷磺酸酯(ethylmethanesulphonate)(EMS)、亞硫酸氫鈉、曱酸和核苷酸類似物。當使用這些試劑時，通常通過如下方法來進行所述誘變在合適條件下存在優選的誘變劑時孵育待誘變的親本細胞，并篩選和/或選擇顯示基因表達減少的或無基因表達的突變體細胞。通過導入、取代，或去除基因中的一個或多個核苷酸或其轉錄或翻譯所必需的調控元件可以實現所述核苷酸序列的修飾或失活。例如，可以插入或去除核苷酸從而導致引入終止密碼子，去除起始密碼子，或改變開放閱讀框。按照本領域已知的方法通過定位誘變或PCR產生的誘變可以實現這種修飾或失活。盡管在理論上所述修飾可以在體內進行，即，直接在表達待修飾核苷酸序列的細胞上進行，但優選如下面所示例的那樣在體外進行所述修飾。代，基因缺失，或基因破壞的技術。例如，在基因破壞方法中，將相應于內源核苷酸序列的核酸序列在體外進行誘變以產生缺陷性的核苷酸序列，隨后將其轉化入親本細胞中以產生缺陷基因。通過同源重組，所述缺陷性核酸序列替代了內源性核苷酸序列。理想的是所述缺陷性核苷酸序列還編碼標記，其可用于選擇其中核苷酸序列被修飾或破壞的轉化子。在特別優選的方面，用可選擇的標記，如本文所述的那些來破壞所述核苷S吏序列。或者，可以^使用與所述核苷酸序列互補的序列通過確定的反義或RNAi技術來進行所述核苷酸序列的修飾或失活。更具體地，通過導入與所述基因的核苷酸序列互補的序列可以減少或消除所述核苷酸序列通過細胞的表達，所述序列可以在細胞中轉錄并且能夠與細胞中產生的mRNA雜交。在允許所述互補反義核苷酸序列與mRNA雜交的條件下，由此減少或消除翻譯的蛋白質的量。本發明進一步涉及親本細胞的突變體細胞，其包含編碼多肽的核香酸序列或其調控序列的破壞或缺失，這導致與親本細胞相比突變體細胞產生更少的多肽或不產生多肽。這樣生成的多肽缺陷型突變細胞作為表達同源和/或異源多肽的宿主細胞特別有用。所以，本發明進一步涉及生產同源或異源多肽的方法，其包括(a)在有益于生產多肽的條件下培養突變細胞；和(b)回收所述多肽。術語"異源多肽"在本文中定義為對宿主細胞不是天然的多肽，進行了修飾以改變天然序列的天然蛋白，或作為通過重組DNA技術對宿主細胞搡作的結果其表達在量上改變的天然蛋白。在另一方面，本發明涉及通過發酵可產生本發明的多肽以及目標蛋白產物的細胞來生產基本上無內切葡聚糖酶活性的蛋白質產品的方法在發酵之前、之中，或發酵完成之后向發酵液(fermentationbroth)中添加有效量的能夠抑制內切葡聚糖酶活性的試劑，從發酵液中回收目標產物，并且任選地將回收的產物進行進一步純化。在另一方面，本發明涉及如下生產基本上無內切葡聚糖酶活性的蛋白質產品的方法在允許產物表達的條件下培養細胞，將得到的培養液進行組合的pH和溫度處理以基本上減少內切葡聚糖酶活性，和從發酵液中回收產物。或者，可以將從培養液回收的酶制備物進行組合的pH和溫度處理。所述組合的pH和溫度處理可任選地與內切葡聚糖酶抑制劑處理組合使用。依照本發明的這個方面，可能去除至少60%,優選至少75%，更優選至少85%,還更優選至少95%,并且最優選至少99%的內切葡聚糖酶活性。可使用此方法獲得內切葡聚糖酶活性的完全去除。組合的pH和溫度處理優選在2-3或10-11范圍內的pH和至少75-85°C范圍內的溫度進行一段足夠的時間以達到期望的效果，通常1至3小時是足夠的。用于培養和純化感興趣的產物的方法可以通過本領域已知的方法進行。用于產生基本上無內切葡聚糖酶產物的本發明的方法在真核多肽，特別是真菌蛋白質例如酶的產生中是特別令人有興趣的。所述酶可以選自，例如，淀粉分解酶(amylolyticenzyme)、脂肪分解酶、蛋白水解酶、纖維素分解酶(cellulolyticenzyme)、氧化還原酶或植物細胞壁降解酶。這些酶的實例包括氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖芬酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質酶(chitinase)、角質酶(cutinase)、環糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、(3-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、卣素過氧化酶、半纖維素酶、轉化酶、異構酶、漆酶、連接酶、脂肪酶、裂合酶、甘露糖苦酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉移酶、轉谷氨酰胺酶或木聚糖酶。內切葡聚糖酶缺陷細胞也可以用于表達在制藥上引起興趣的異源蛋白質例如激素、生長因子、受體等。可理解的是術語"真核多肽"不僅包括天然多肽，也包括多肽例如酶，其通過氨基酸取代、缺失或添加修飾，或通過其它這樣的修飾以增強活性、熱穩定性、pH耐受性等。在另外的方面，本發明涉及基本上無內切葡聚糖酶活性的蛋白質產物，其通過本發明的方法產生。組合物本發明還涉及包含本發明的多肽的組合物。優選地，所述組合物富含這種多肽。術語"富含"表示所述組合物的內切葡聚糖酶活性，例如，以至少1.1的富集因數(enrichmentfactor)增加。所述組合物可以包含本發明的多肽作為主要酶成分，例如，單成分組合物。或者，所述組合物可以包含多種酶活性，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質酶、角質酶、環糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖苷酶、(3-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、a-葡糖苷酶、(3-葡糖苷酶、卣素過氧化酶、轉化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、肽谷氨酰胺酶(peptidoglutaminase)、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉谷氨酰胺酶或木聚糖酶。額外的酶可以通過例如屬于以下屬或種的微生物產生曲霉屬，優選棘孢曲霉、泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構巢曲霉、黑曲霉或米曲霉；鐮孢屬，優選桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢；腐質霉屬，優選特異腐質霉或疏棉狀腐質霉；或木霉屬，優選哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉或綠色木霉。可以依照本領域內已知的方法制備多肽組合物，并且可以是液體或干組合物的形式。例如，所述多肽組合物可以是顆粒(granulate)或^f效粒(microgranulate)的形式。可以將包括于所述組合物中的多肽依照本領域內已知方法穩、定。以下提供的實施例是本發明多肽組合物的優選的用途。本發明的多肽組合物的劑量和使用該組合物的其它條件可以基于本領域內已知的方法決定。用途本發明還涉及使用具有內切葡聚糖酶活性的多肽或其組合物的方法。將生物質降解為單糖、二糖和多糖本發明的具有內切葡聚糖酶活性的多肽和宿主細胞可用于產生單糖、二糖和多糖，它們作為來自生物質的化學或發酵原料用于產生乙醇、塑料或其它產品或中間物。具有內切葡聚糖酶活性的多肽可以是去除或不去除細胞的粗發酵液形式，或是半純化或純化的酶制劑形式。或者，本發明的宿主細胞可以在使用生物質的發酵方法中用作具有內切葡聚糖酶活性的多肽的來源。生物質可以包括但不限于木材資源、城市固體廢物、廢紙和作物殘余物(參見，例如Wiselogel&a/"1995,在T/a涵ooA，腸"/z,/(編者CharlesE.Wyman)中，第105-118頁，Taylor&Francis,WashingtonD.C.;Wyman,1994，5〖omsowrcerec/zwofogy50:3-16;Lynd，1990，^phW說oc/zem/"/^cm<i5z.o/ec/2"o/o"24/25:695-719;Mosiera/.,1999,Aece"f/Vog"M五wg/"een'"g/S/ofec/z"o/ogy中，總編T.Scheper,第65巻，第23-40頁，Springer-Verlag,NewYork)。生物質初生細胞壁(primarycellwall)中的主要多糖是纖維素，其次最豐富的是半纖維素，而第三是果膠。次生細胞壁(secondarycellwall)在細胞停止生長后產生，其同樣含有多糖并通過聚合木質素共價交聯至半纖維素而加強。纖維素是脫水纖維二糖的均聚物，并且因此是線性p-(l-4)-D-葡聚糖，而半纖維素包括多種化合物，例如木聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，具有系列取代基的復雜分支結構。盡管通常是多形的，存在于植物組織中的纖維素主要作為平行葡聚糖鏈的不溶晶體基質。半纖維素通常與纖維素以及其它半纖維素以氫鍵相連，其幫助穩定細胞壁基質。將三種主要類別的糖水解酶(glycohydrolase)用于破壞纖維素生物質(1)"內切-l，4-p-葡聚糖酶"或1,4-卩-D-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(EC3.2丄4)，其隨機作用于可溶和不溶的1,4-(3-葡聚糖底物。(2)"外切-l,4-(3-葡聚糖酶"包括1,4-(3-D-葡聚糖葡糖水解酶(EC3.2.1.74)，其從1，4-(3-D-葡聚糖釋放D-葡萄糖并且緩慢水解D-纖維二糖；和纖維二糖水解酶(l，4-(3-D-葡聚糖纖維二糖水解酶，EC3.2.1.91)，其從1，4-P-葡聚糖釋放D-纖維二糖。(3)"(3-D-葡糖苷酶，，或(3-D-葡糖苷葡糖水解酶(EC3.2.1.21)，其作用于從纖維二糖和可溶的纖維糊精以及一系列糖苷釋放D-葡萄糖單位。這三個類別的酶一起協同地作用使來自生物質的天然纖維素有效解晶(decrystallization)和水解以產生還原糖。本發明具有內切葡聚糖酶活性的多肽可以與上述酶一同使用以進一步降解生物質底物的纖維素成分(參見，例如，Brighame,,1995,在Z/a"必ooA:w"/o"/2朋o/(編者CharlesE.Wyman)中，第119-141頁，Taylor&Francis,WashingtonD.C.;Lee,1997,Jownw/q/^S/o/ec/wo/ogy56:1-24)。能夠通過酶降解生物質并將釋放的糖轉化為乙醇來產生乙醇。這種乙醇通常稱為生物乙醇或生物燃料。可將其以少于1%-多至100%(燃料替代品)的混合物作為燃料添加劑或補充劑(extender)使用。洗滌劑(detergent)組合物可以將本發明的具有內切葡聚糖酶活性的多肽添加至洗滌劑組合物，并且因此成為所述洗滌劑組合物的成分。可以將本發明的洗滌劑組合物例如配制為手洗或機洗的洗滌劑組合物，包括適于預處理沾污織物的洗衣添加劑組合物和添加了漂洗劑的織物柔軟劑組合物，或將其配制為用于通常家庭硬表面清理操作的洗滌劑組合物，或配制用于手洗或機洗的洗碟(dishwashing)操作。在具體的方面，本發明提供包含本發明的具有內切葡聚糖酶活性的多肽的洗滌劑添加劑。所述洗滌劑添加劑以及洗滌劑組合物可以包含一個或多個其它酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角質酶、淀粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶(arabinase)、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如，漆酶和/或過氧化物酶。通常酶成分的性質應該與選擇的洗滌劑相容(即，最適pH,與其它酶和非酶成分的相容性等)，并且所述酶成分應該以有效量存在。蛋白酶:合適的蛋白酶包括動物、植物或微生物來源的那些蛋白酶。微生物來源是優選的。其中包括化學修飾的或蛋白質工程化的突變體。所述蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優選堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的實例是枯草桿菌蛋白酶，特別是源自芽孢桿菌屬的那些，例如，枯草桿菌蛋白酶Novo、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶168(在WO89/06279中描述)。胰蛋白酶樣蛋白酶的實例是胰蛋白酶(例如，豬或牛來源)和鐮孢屬蛋白酶，在WO89/06270和WO94/25583中描述。有用的蛋白酶的實例是在WO92/19729、WO98/20115、WO98/20116和W098/34946中描述的變體，特別是在一個或多個以下位置具有取代的變體27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。優選的商業上能夠獲得的蛋白酶包括AlcalaseTM、SavinaseTM、PrimaseTM、Duralase、Esperase和KannaseTM(NovozymesA/S)、Maxatase、Maxacal、MaxapemTM、Properase、PurafectTM、PurafectOxPTM、FN2TM和FN3TM(GenencorInternationalInc.)。脂肪酶:合適的脂肪酶包括細菌或真菌來源的那些。包括化學修飾的或蛋白質工程化的突變體。有用的脂肪酶的實例包括來自如下的脂肪酶腐質霉屬(同物異名嗜熱霉屬(r/zermow少ce力)，例如，來自疏棉狀腐質霉(細毛嗜熱霉(7:/a冊g/www))如EP258068和EP305216中所述，或來自特異腐質霉如WO96/13580中所述，假單胞菌屬脂肪酶，例如，來自產堿假單胞菌(P^/^//^"^)或類產堿假單胞菌(/5/wei/oa/ca//gew^)(EP218272)、洋蔥假單胞菌(尸c印ac/a)(EP331376)、施氏假單胞菌(/3(GB1,372,034)、熒光假單胞菌CPy/ww^ce"》、假單胞菌屬菌種(尸化M^mo"ay^.)菌抹SD705(WO95/06720和WO96/27002)、術'sco"w'"era^(WO96/12012)、芽孢桿菌屬脂肪酶，例如，來自枯草芽孑包桿菌(Dartois&a/.,1993,S/oc/zem/cafi/op/zjA^'caAto，1131，253-360)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP64/744992)或短小芽孢桿菌(S.;w柳7m力(WO91/16422)的脂肪酶。其它實例是例如在WO92/05249、WO94/01541、EP407225、EP260105、WO95/35381、WO96/00292、WO95/30744、WO94/25578、WO95/14783、WO95/22615、WO97/04079和WO97/07202中描述的那些脂肪酶變體。優選的商業上能夠獲得的脂肪酶包括LipokseTM、LipexTM和LipolaseUltra(NovozymesA/S)。淀粉酶:合適的淀粉酶(a和/或(3)包括細菌和真菌來源的那些。包括化學修飾的或蛋白質工程化的變體。淀粉酶包括例如從芽孢桿菌屬獲得的a-淀粉酶，例如，地衣芽孢桿菌的特殊菌林，在GB1,296,839中有更詳細的描述。有用的淀粉酶的實例是在WO94/02597、WO94/18314、WO96/23873和WO97/43424中描述的變體，特別在一個或多個以下位置具有取代的變體15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。商業上能夠獲得的淀粉酶是DummylTM、TermamylTM、Fungamyl和BAN(NovozymesA/S)、Rapidase和Purastar(來自GenencorInternationalInc.)。纖維素酶:合適的纖維素酶包括細菌或真菌來源的那些。包括化學修飾或蛋白質工程的突變體。合適的纖維素酶包括來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質霉屬、鐮孢屬、梭孢殼屬、枝頂孢霉屬或木霉屬菌屬的纖維素酶，例如，產生自特異腐質霉、嗜熱毀絲霉和尖鐮孢的真菌纖維素酶，其公開于美國專利號4,435,307、美國專利號5,648,263、美國專利號5,691,178、美國專利號5,776,757和WO89/09259。特別合適的纖維素酶是堿性或中性纖維素酶，其具有保護顏色的益處(colourcarebenefits)。這種纖維素酶的實例是在EP0495257、EP0531372、W096/11262、W096/29397、WO98/08940中描述的纖維素酶。其它實例是纖維素酶變體，例如在WO94/07998、EP0531315、美國專利號5,457,046、美國專利號5,686,593、美國專利號5,763,254、WO95/24471、WO98/12307和PCT/DK98/00299中描述的那些。商業上能夠獲得的纖維素酶包括Celluclast、CelluzymeTM和Carezyme(NovozymesA/S)、Clazinase和PuradaxHATM(GenencorInternationalInc.)和KAG-500(B)(KaoCorporation)。過氧化物酶/氧化酶:合適的過氧化物酶/氧化酶包括植物、細菌或真菌來源的那些。包括化學修飾或蛋白質工程的突變體。有用的過氧化物酶的實例包括來自鬼傘屬的過氧化物酶，例如，來自灰蓋鬼傘及其變體，如在wo93/24618、WO95/10602和WO98/15257中描述的那些。商業上能夠獲得的過氧化物酶包括GuardzymeTM(NovozymesA/S)。通過添加含有一種或多種酶的單獨的添加劑，或通過添加包含所有這些酶的組合添加劑，可將酶成分包括在洗滌劑組合物中。可將本發明的洗滌劑添加劑(即單獨的添加劑或組合的添加劑)配制成例如，顆粒、液體、漿等。優選的洗滌劑添加劑劑型是顆粒，具體為無粉塵(non-dusting)顆粒，液體，具體為穩定的液體，或漿。例如，可以如美國專利號4,106,991和4,661，452中所公開的產生無粉塵顆粒，并且可以任選地通過本領域已知的方法包覆。蠟制包覆材料(waxycoatingmaterial)的實例是具有1000至20000的平均摩爾量的聚(環氧乙烷)產品(聚乙二醇，PEG);具有從16至50個的環氧乙烷單元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇含有從12至20個碳原子，并且其中具有15至80個環氧乙烷單元；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的單酸甘油酯和甘油二酯和甘油三酯。適合于流化床技術應用的成膜涂覆材料的實例提供于GB1483591。例如，可根據已經建立的方法通過添加多元醇例如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸來穩定液體酶制劑。可以根據公開于EP238,216中的方法來制備保護酶。本發明的洗滌劑組合物可以是任何方便的形式，例如，條、片劑、粉劑、顆粒、糊劑或液體。液體洗滌劑可以是含水的，通常含有多至70%的水和0-30%的有才幾〖容劑，或非水的(non-aqueous)。洗滌劑組合物包含一種或多種表面活性劑，其可以是非離子的，包括半^L性的和/或陰離子的和/或陽離子的和/或兩性離子的。所M面活性劑通常以按重量計0.1%至60%的水平存在。當包括于此時，所述洗滌劑將通常含有大約1%至大約40%的陰離子表面活性劑，例如線性烷基苯磺酸鹽、a-烯烴磺酸酯(olefinsulfonate)、烷基硫酸鹽(脂肪醇石克酸酯)、醇乙氧基石克酸鹽(alcoholethoxysulfate)、仲《連烷》黃酸鹽(secondaryalkanesulfonate)、ot-磺基脂肪酸曱酯、烷基-或烯基琥珀酸，或肥皂(soap)。當包括于此時，洗滌劑將通常含有大約0.2%至大約40%的非離子表面活性劑，例如醇乙氧基化物、壬基苯酚乙氧基化物、烷基聚糖苷(alkylpolyglycoside)、烷基二曱基氧化胺(alkyldimethylamineoxide)、乙氧基化脂肪酸單乙醇酰胺(ethoxylatedfattyacidmonoethanolamide)、脂肪酸單乙醇酰胺、多羥基烷基脂肪酸酰胺或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物("葡糖酰胺(glucamide)，，)。洗滌劑可以含有0-65。/。的洗滌劑增清劑(builder)或復合劑例如沸石、二磷酸鹽、三磷酸鹽、膦酸酯(phosphonate)、碳酸鹽(carbonate)、檸檬酸鹽、氮川三乙酸(nitrilotriaceticacid)、乙二胺四乙酸、二亞乙基三胺五乙酸、烷基-或烯基琥珀酸、可溶^5圭酸鹽或分層^5圭酸鹽(例如來自Hoechst的SKS-6)。洗滌劑可包含一種或多種聚合物。實例是羧曱基纖維素、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)、聚(乙蹄咪唑)、聚羧酸酯(polycarboxylates)例如聚丙烯酸酯(polyacrylates)、馬來S^/丙蜂酸共聚物和曱基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。洗滌劑可以含有漂白體系，其可以包含H202源例如過硼酸鹽或過碳酸鹽，其可以與形成過酸的漂白激活劑例如四乙酰乙二胺或壬酰氧苯磺酸酯(nonanoyloxybenzenesulfonate)組合。或者，漂白體系可以包含過氧酸，例如，酰胺、二酰亞胺(imide)或砜類型的過氧酸。本發明的洗滌劑組合物的酶成分可以使用常規穩定劑穩定，例如，多元醇例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如，芳香硼酸酯，或苯基硼酸(phenylboronicacid)衍生物例如4-曱酰苯基硼酸(4-formylphenylboronicacid),并可例如WO92/19709和WO92/19708中所述配制所述組合物。洗滌劑還可以含有其它常規洗滌劑成分，例如，織物整理劑(fabricconditioner)包括粘土、泡沫促進劑、抑泡劑、防腐蝕劑、懸污劑、防污再沉積劑、染料、殺菌劑、光亮劑(opticalbrightener)、水溶助劑(hydrotrope)、晦暗抑制劑(tarnishinhibitors)或香泮+。在洗滌劑組合物中的任何酶成分，特別是本發明的具有內切葡聚糖酶活性的多肽，可以按相當于每升洗滌液0.01-100mg酶蛋白，優選每升洗滌液0.05-5mg酶蛋白，特別是每升洗滌液0.1-1mg酶蛋白的量添加。本發明的具有內切葡聚糖酶活性的多肽可以額外地并入公開于WO97/07202的洗滌劑配制物，WO97/07202在本文中作為參考文獻并入。信號肽本發明還涉及核酸構建體，所述核酸構建體包含編碼蛋白質的基因，該基因與編碼信號肽的核苷酸序列可操作地連接，所述信號肽包含SEQIDNO:2的氨基酸1至17或由SEQIDNO:2的氨基酸1至17組成，其允許蛋白質分泌到培養基中，其中所述基因對于該核苷酸序列是外源的。在優選的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDNO:1的核苷酸1至51。在另外的優選方面，所述核苷酸序列由SEQIDNO:1的核苷酸1至51組成。本發明還涉及包含這種核酸構建體的重組表達載體和重組宿主細胞。本發明還涉及用于產生蛋白質的方法，包括(a)在適合于產生所述蛋白質的條件下培養這樣的重組細胞；和(b)回收所述蛋白質。所述蛋白質對于宿主細胞可以是天然的或異源的。術語"蛋白質"在本文的意思不是指特定長度的編碼產物，并且因此包含肽、寡肽和蛋白質。術語"蛋白質"還包含組合以形成編碼產物的兩種或兩種以上多肽。所述蛋白質還包括雜合多肽，其包含部分或全部多肽序列的組合，所述多肽序列從至少兩種不同的蛋白質獲得，其中一個或多個對于宿主細胞可以是異源或天然的。蛋白質進一步包括上述蛋白質和雜合蛋白質天然存在的等位基因變異和工程的變異。優選蛋白質是激素或其變體、酶、受體或其部分、抗體或其部分，或報道蛋白(reporter)。在更優選的方面，所述蛋白質是氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂合酶(lyase)、異構酶或連接酶。在更加優選的方面，所述蛋白質是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質酶、角質酶、環糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖苷酶、(3-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、a-葡糖苷酶、P-葡糖苷酶、轉化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、變位酶(mutanase)、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉谷氨酰胺酶或木聚糖酶。基因可以從任何原核、真核或其它來源獲得。通過以下實施例進一步對本發明進行描述，但不應將其理解為對本發明范圍的限制。實施例材料作為緩沖液和底物使用的化學品是至少試劑等級的商業產品。SDS-PAGE凝膠、上樣緩沖液和電泳緩沖液獲得自Invitrogen/Novex(Carlsbad,CA)。測序等級修飾的胰蛋白酶來自PrincetonSeparations(Aldelphia,NJ)。BioSafeCommassieBlueG250蛋白質染色劑(proteinstain)獲4尋自BioRadLaboratories(Hercules,CA)。菌抹將米曲霉Jal250菌抹(WO99/61651)用于表達具有內切葡聚糖酶活性的土生梭孢霉多肽。將土生梭孢霉NRRL菌抹8126用作具有內切葡聚糖酶活性的7F家族多肽(Family7Fpolypeptide)的基因的來源。培養基PDA平板由每升39克馬鈴薯葡糖瓊脂組成。NNCYP培養基由如下物質組成每升5.0gNH4N03、0.5gMgS04'7H20、0.3gCaCl2、2.5g檸檬酸、1.0g細菌用蛋白胨(BactoPeptone)、5.0g酵母提取物、1mlCOVE痕量金屬，和足夠的K2HP04以達到最終pH大約5.4。NNCYPmod培養基由如下物質組成每升1.0gNaCl、5.0gNH4N03、0.2gMgSO4.7H2O、0.2gCaCl2、2.0g檸檬酸、l.Og細菌用蛋白胨、5.0g酵母提取物、1mlCOVE痕量金屬溶液，和足夠的K2HP04以達到最終pH大約5.4。Cove痕量金屬溶液由如下物質組成每升0.04gNa2B407'10H2O、0.4gCuS04.5H20、1.2gFeS04.7H20、0.7gMnS04-H20、0.8gNa2Mo02-2H20和10gZnSO4-7H2O。LB平板由如下物質組成每升10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化鈉和15g細菌用瓊脂(BactoAgar)。MDU2BP培養基由下述物質組成每升45g麥芽糖、1gMgS04'7H20、lgNaCl、2gK2HS04、12gKH2P04、2g尿素和500|ilAMG痕量金屬，將pH調節至5.0并且隨后用0.22pm過濾裝置過濾除菌。AMG痕量金屬由如下物質組成每升14.3gZnS04'7H20、2.5gCuS04.5H20、0.5gNiCl2'6H2O、13.8gFeS04'7H20、8.5gMnS04.7H20和3g檸檬酸。SOC培養基由如下物質組成2%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、10mMNaCl、2.5mMKCl、10mMMgCl2和10mMMgS04;通過高壓滅菌并且隨后添加過濾除菌的葡萄糖至20mM。冷凍培養基由60%SOC和40%甘油組成。2XYT培養基由如下物質組成每升16g胰蛋白胨、10g酵母提取物、5gNaCl和15g細菌用瓊脂，通過高壓滅菌。實施例1:表達序列標簽(EST)cDNA文庫構建將土生梭孢霉NRRL8126在250ml搖瓶中補充1%葡萄糖的50mlNNCYPmod培養基中，在45°C、200rpm培養24小時。將來自所述24小時液體培養物的2ml等分試樣用于接種500ml搖瓶，所述500ml搖瓶含有補充2%Sigmacell-20(SigmaChemicalCo"St.Louis,MO)的100mlNNCYPmod培養基。將培養物在45。C、200rpm溫育3天。通過過濾收獲菌絲體，所述過濾通過具有玻璃纖維預過濾器的布氏漏斗(Buchnerfunnel)(Nalgene,RochesterNY)進行，將菌絲體用10mMTris-HCl-1mMEDTApH8(TE)洗滌兩次，并且在液氮中快速冷凍。使用如下方法分離總RNA。將土生梭孢霉NRRL8126的冷凍菌絲體在電動咖啡研磨機中研磨。在50mlFalcon管中將研磨的材料與20mlFenazol(Ambion,Inc.,Austin,TX)1:1v/v混合。一旦將菌絲體懸浮，使用氯仿提取并且使用苯酚-氯仿-異戊醇25:24:1v/v/v的混合物提取三次。通過添加1/10體積的3M乙酸鈉pH5.2和1.25體積的異丙醇從所得水相沉淀RNA。通過在4。C12,000離心30分鐘回收沉淀的RNA。將最終的沉淀用冷的70%乙醇洗滌，空氣千燥，并且在500ml焦碳酸二乙酯處理的水(DEPC水)中重懸。用AgilentBioanalyzer2100(AgilentTechnologies,Inc.,PaloAlto,CA)^H古純化的RNA的質和量。將聚腺苷酸化mRNA從360jig總RNA中分離，所述分離借助Poly(A)PuristMagneticKit(Ambion,Inc.,Austin,TX)根據制造商的說明書進行。為了產生cDNA文庫，葉吏用CloneMinerTMKit(Invitrogen，Carlsbad,CA)來構建定向文庫(directionallibrary),其不需要使用限制酶克隆，因此降低嵌合克隆的數目和大小偏差(sizebias)。為了確保cDNA的第一鏈合成成功，平行進行具有兩種不同濃度mRNA(2.2和4.4pg的聚(A)+mRNA)的兩個反應。將mRNA樣品與Biotin-a"B2-01igo(dt)引物(CloneMinerTMKit，Invitrogen，Carlsbad,CA)、IX第一鏈緩沖液(Invitrogen,Carlsbad,CA)、2pl的0.1M二硫蘇糖醇(DTT)、10mM各種dNTP和水分別混合至終體積18和16jiil。將反應混合物小心地混合，隨后添加2和4|al的SuperScriptTM反轉錄酶(Invitrogen,Carlsbad,CA)，并且在45。C溫育60分鐘以合成第一互補鏈。為了第二鏈的合成，向各個第一鏈反應添加30pi的5X第二鏈緩沖液(Invitrogen,Carlsbad,CA)、3pi的10mM各種dNTP、10單位大腸桿菌DNA連接酶(Invitrogen，Carlsbad,CA)、40單位大腸桿菌DNA聚合酶I(Invitrogen,Carlsbad,CA)和2單位大腸桿菌RNaseH(Invitrogen,Carlsbad,CA)至總體積150pl。隨后將混合物在16。C溫育2小時。兩小時溫育之后，向各個反應添加2piT4DNA聚合酶(Invitrogen，Carlsbad,CA)，并且在16。C溫育5分鐘以產生平端化的cDNA。使用苯酚-氯仿-異戊醇25:24:1v/v/v的混合物提取cDNA反應物并且在20ng糖原、120pi5M乙酸銨和660pi乙醇存在下沉淀。在4。C12,000xg離心30分鐘之后，將cDNA沉淀用冷的70%乙醇洗滌，在真空中干燥2-3分鐘，并且在18)ilDEPC水中重懸。向各個重懸的cDNA樣品中添力。10)il5X連接(adapted)緩沖液(Invitrogen，Carlsbad,CA)、10fig如下所示的加B1銜接頭(adapter)(Invitrogen,Carlsbad,CA)、7pi0.1MDTT和5單位的T4DNA連接酶(Invitrogen,Carlsbad，CA)。aBl衫f^妾頭頂《連(topstrand):5'-TCGTCGGGGACAACTTTGTACAAAAAAGTTGG-3'(SEQIDNO:3)a"Bl銜接頭底鏈(bottomstrand):3'陽CCCCTGTTGAAACATGTTTTTTCAACCp-5'(SEQIDNO:4)連接反應在16°C溫育過夜。過量的銜接頭通過在1mlSephacrylS-500HR樹月旨(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)中的大小排阻層析去除。根據CloneMinerKit的說明書收集柱纟及分，并4吏用AgilentBioanalyzer分4斤級分3至14以測定其中""B1銜接頭開始洗脫的級分。這種分析顯示銜接頭在大約級分10或11開始洗脫。對于第一文庫匯集級分6至11，而對于第二文庫匯集級分4-11。通過才艮據GatewaySystem身見程(Invitrogen，Carlsbad,CA)的同源DNA重組，使用BPClonase(Invitrogen,Carlsbad,CA)作為重組酶來進行cDNA的克隆。每個BPClonaseTM重組反應含有大約70ng的attB側接的cDNA(attB-flanked-cDNA)、250ngpDONRTM222、2pl5XBPClonaseTM緩沖液、2piTE緩沖液和3(ilBPClonaseTM。全部試劑獲4尋自Invitrogen,Carlsbad,CA。將重組反應在25。C溫育過夜。隨后將熱失活的BP重組反應分成6個等分試樣，并且使用BioRadGenePulserII(BioRad，Hercules,CA)用如下參數電穿孔入ElectroMaxTMDH10B電感受態細胞(Invitrogen，Carlsbad,CA)中電壓2.0kV;電阻200Q;和電容25pF。將電穿孔的細胞在1mlSOC培養基中重懸，并且在37。C及200rpm的持續搖動下溫育60分鐘。溫育期之后，匯集轉化的細胞并且與冷凍培養基1:1混合。將200pl等分試樣取出用于文庫滴定，并且隨后將剩余的每種文庫等分至1.8ml冷凍管(WheatonScienceProducts,Millville,NJ)中，并在-80。C冷凍貝i藏。制備每個文庫的四個系列的稀釋物1/100、1/1000、1/104、1/105。從每種稀釋物將100pl涂布于補充50叫每ml卡那霉素的150mmLB平板上并且在37°C溫育過夜。計數每個稀釋平板上的菌落數目并且用于計算每個文庫中轉化體的總數。顯示第一文庫具有540萬獨立克隆而第二文庫顯示具有900萬獨立克隆。實施例2:模板制備和cDNA克隆的核苷酸測序將來自兩種文庫的等分試樣混合并且涂布到補充50jig每ml卡那霉素的25x25cmLB平板上。將單獨克隆借助于GenetixQPixRobot(GenetixInc.,Boston,MA)排列在96孔平板上，所述平板含有100pi補充50jig每ml卡那霉素的LB。從總共4320個單獨克隆獲得四十五個96孔平板。將平板在37°C以200rpm搖動溫育過夜。溫育過后，將100pi無菌的5()0/o甘油添加至每個孔。將轉化體借助96-針工具(Boekel，Feasterville，PA)復制到第二個深》萊96孔微量培養平板(AdvancedGeneticTechnologiesCorporation,Gaithersburg,MD)中，所述深碟96孔微量培養平板在每個孔中含有1ml補充50)ag每ml卡那霉素的MagnificentBroth(MacConnellResearch,SanDiego,CA)。將原始的微量滴定板在-80。C冷凍貯藏。將第二深碟平板在旋轉振蕩器上以300rpm的劇烈攪拌于37。C溫育過夜。為了避免溢出和交叉污染，并且使其充分通氣，將每個第二培養平板用聚丙烯墊(AdvancedGeneticTechnologiesCorporation,Gaithersburg，MD)和塑料微量滴定碟蓋覆蓋。使用MWGRobot-Smart384(MWGBiotechInc.,HighPoint,NC)和MontagePlasmidMiniprepKits(Millipore,Billerica,MA)制備質粒DNA。使用Big-DyeTM(AppliedBiosystems,Inc.,FosterCity,CA)終止子化學(terminatorchemistry)(Gieseckea/.,1992，Jcwwa/o/巧Vo/c^MeAoA38:47-60)和如下所示的M13Forward(-20)測序引物進行測序反應。5，-GTAAAACGACGGCCAG-3，(SEQIDNO:5)使用Robot-Smart384(MWGBiotechInc.,HighPoint,NC)以384孔形式進4亍測序反應，并JU吏用MilliporeMultiScreenSeq384SequencingClean-upKits(Millipore,Billerica,MA)進行終止子去除(terminatorremoval)。反應含有6jul質粒DNA和4pi測序主混合物(master-mix)，所述主混合物含有2(il5x測序緩沖液(Millipore,Billerica,MA)、1jilBig-DyeTM終止子(AppliedBiosystems,Inc.,FosterCity,CA)、1.6pmolM13Forward引物和1(il水。使用ABIPRISMAutomatedDNASequencerModel3700(AppliedBiosystems,FosterCity,CA沐行單通道DNA測序。實施例3:cDNA克隆的DNA序列數據分析在PHRED/PHRAP軟件(UniversityofWashington,Seattle,WA)的幫助下進行堿基判定(calling)、質量數值分配和載體修整(vectortrimming)。使用ParcelTranscriptAssemblerv.2.6.2.(Paracel,Inc.,Pasadena,CA)進4亍EST的聚類分才斤(clusteringanalysis)。EST聚類分析顯示395個獨立簇。使用BLOSUM62矩陣(Henikoff,1992，Prac.TVa".Jcad89:10915-10919)在32節點Linux群集(32-nodeLinuxcluster)(Paracel,Inc.,Pasadena,CA)上,以Blastx程序(Altschul".a/.,1990,M/.編.215:403-410)進行裝配的EST序列針對PIR數據庫的序列同源性分析。從395個簇中，246個對于公共的蛋白質數據庫中的已知基因具有一致的blast結果(blasthit),并且149個對于這些數據庫無顯著一致的結果。在這246個基因中，13個具有針對充分表征的糖基水解酶基因同源物的一致的結果。實施例4:編碼家族7內切葡聚糖酶(CEL7F)的cDNA克隆的鑒定編碼家族7內切葡聚糖酶(CEL7F)的cDNA克隆最初通過其與來自長枝木霉(NREFNF00756647)的家族7內切葡聚糖酶EG-1蛋白質的同一性而鑒定。此分析顯示兩種蛋白質在蛋白質水平的113個氨基酸(339個堿基對)的延伸(stretch)內是44%同一的。在此初始鑒定之后，從原始冷凍原種(stock)平板恢復(retrieve)克隆Tter08C4，并且在補充50嗎每ml卡那霉素的LB平板上劃線。將平板在37。C溫育過夜，并且在次日使用來自平板的單菌落接種3ml補充50叫每ml卡那霉素的LB。將液體培養物在37。C溫育過夜，并且使用BioRobot9600(QIAGEN，Inc.,Valencia,CA)制備質粒DNA。使用M13Forward和如下所示的Poly—T引物測序克隆的3'端，采用如上所述的Big-DyeTM終止子化學再次測序克隆Tter08C4質粒DNA。5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3'(SEQIDNO:6)其中V:G、A、C和N^G、A、C、T序列信息的Blastx同源性分析顯示克隆Tter08C4編碼的蛋白質與里氏木霉EG1蛋白質(NREFNF00494331)相似。這些蛋白質在365個氨基酸的延伸段(overa365aminoacidstretch)是46%同一的。4吏用Interproscan禾呈序(ZdobnovandApweiler，2001,B/oz'"ybrwa/1/(^17:847-8)分析克隆Tter08C4的推定蛋白質序列顯示，所述基因含有家族7蛋白質的序列特征。從起始氨基酸甲硫氨酸的18個氨基酸存在這種稱為Pfam模式PF00840(Batemana/.,2002,vVwc/e,'c^c/AWe化^c/30:276-280)的序歹'J特征，這確認克隆Tter08C4編碼家族7內切葡聚糖酶。土生梭孢霉內切葡聚糖酶的cDNA序列(SEQIDNO:l)和推導的氨基酸序列(SEQIDNO:2)示于圖1A和1B。cDNA克隆編碼336氨基酸的多肽。基因的cDNA克隆的。/。G+C含量是67.5。/。，并且成熟蛋白質編碼區域(SEQIDNO:1的核苷酸55至1011)的。/。G+C含量是67.5%。使用SignalP軟件程序(NielsenWa/.,1997,/Vote/'五"g/脫en'"g10:1-6)預測出17殘基的4言號肽。預測的成熟蛋白質含有319氨基酸具有33.3kDa的分子量。通過ClustalW方法(Higgins,1989，見上文)測定內切葡聚糖酶家族7序列的比較比對(comparativealignment)，所述方法使用LASERGENEMEGALIGNTM軟件(DNASTAR,Inc.,Madison,WI),采用同一性表和下列多重比對參數缺口罰分10和缺口長度罰分10。配對比對參數是K元組(Ktuple)=1、缺口罰分=3、窗口=5和對角線=5。比對顯示成熟土生梭孢霉CEU7F基因的推導的氨基酸序列與里氏木霉內切葡聚糖酶I基因(NREFNF00494331，UniprotQ5BMS5)催化區的推導的氨基S交序列享有46.7%的同一性，并且與全長里氏木霉內切葡聚糖酶I基因(NREFNF00494331，UniprotQ5BMS5)的推導的氨基酸序列享有44.9%的同一性。對這些蛋白催化區的比對分析顯示土生梭孢霉CEL7F內切葡聚糖酶缺少至少三個離散的序列基序，所述序列基序在來自真菌的糖基水解酶家族7的所有其它已知成員中是保守的。這些序列基序中的兩種由多于IO個氨基酸殘基組成，并且含有高度保守的殘基，所述高度保守殘基不存在于土生梭孢霉CEL7F內切葡聚糖酶中。一旦確定了克隆Tter08C4的性質，將定名為pTter7F(圖2)的來自這種克隆的質粒DNA的0.5|il等分試樣轉移到大腸桿菌TOP10細胞的小管(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，輕輕地混合，并且在冰上溫育IO分鐘。隨后將細胞在42。C熱休克(heat-shock)30秒并且再次在冰上溫育2分鐘。將細胞在250piSOC培養基中重懸，并且持續搖動(200rpm)在37。C溫育60分鐘。溫育期之后，將兩個30^等分試樣涂布于補充50pg每ml卡那霉素的LB平板上，并且在37。C溫育過夜。次日挑取單菌落并且劃線接種至三個1.8ml冷凍小管，所述冷凍小管含有大約1.5ml補充50iig每ml卡那霉素的LB瓊脂糖。將小管用PetriSeal(DiversifiedBiotech,BostonMA)密封，并作為NRRLB-30802保藏在農業研究機構專利培養物保藏中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection),北區研究中心(NorthernRegionalResearchCenter),1815UniversityStreet,Peoria，Illinois,61604，j呆藏日^月為2005年4月11日。實施例5:pAlLo2表達載體的構建通過修飾pBANe6(美國專利號6，461,837)構建表達載體pAlLol，所述pBANe6包含來自黑曲霉中性a-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖異構酶的基因啟動子的雜合體(NA2-tpi啟動子)、黑曲霉淀粉葡糖苷酶終止子序列(AMG終止子)和構巢曲霉乙酰胺酶基因(am^S人使用所述的Big-Dye終止子化學通過測序驗證所有誘變步驟。通過如下方法進行pBANe6的修飾首先通過定位誘變從ww必選擇標記消除在位置2051、2722和3397bp的三個7VcoI限制位點。將所有改變設計為"沉默的"，保留awt/S基因產物的實際蛋白質序列不變。根據制造商的說明書采用GeneEditor頂/"v/fraSite-DirectedMutagenesisKit(Promega,Madison,WI),使用如下引物(力。下劃線的核苷酸代表改變的堿基)同時進行這三個位點的去除AMDS3NcoMut(2050):5'-GTGCCCCATG^TACGCCTCCGG-3，(SEQIDNO:7)AMDS2NcoMut(2721):5'-GAGTCGTATTTCCA4GGCTCCTGACC畫3，(SEQIDNO:8)AMDSlNcoMut(3396):5，-GGAGGCCATG^AGTGGACCAACGG-3，(SEQIDNO:9)F逸后i吏用QuickChangeTMSite-DirectedMutagenesisKit(Stratagene，LaJolla,CA)將包含所有三種期望的序列改變的質粒進行定位誘變，以消除在AMG終止子末端在位置1643的WcoI限制位點。下列引物(加下劃線的核苷酸代表改變的堿基)用于誘變誘變AMG終止子序列的UpperPrimer:G-3，(SEQIDNO:10)i秀變AMG終止子序列的LowerPrimer:G-3'(SEQIDNO:11)修飾pBANe6的最后步驟是使用QuickChangeSite-DirectedMutagenesisKit(Stratagene，LaJolla，CA)和以下引物(力口下劃線的核苷酸代表改變的堿基)在多接頭的開始處添加新的TVcoI限制位點以產生pAlLol(圖3)。"i秀變NA2-tpi啟動子的UpperPrimer:3'(SEQIDNO:12)"i秀變NA2-tpi啟動子的LowerPrimer:，(SEQIDNO:13)將pAlLol的am必基因與構巢曲霉p,G基因交換(swap)。將質粒pBANe10(圖4)用作作為選4奪標記的p_yrG基因的來源。pBANe10的序列分析顯示"K標記包含在A^'I限制片段之內，并且不含有iVcoI或戶acI限制位點。因為aw必也與A^I限制位點在側翼連接，轉變選擇標記的策略是簡單的交換A^'I粒DNA，并且通過瓊脂糖凝膠電泳純化產物。將含有/7,G基因的來自pBANe10的A/"w'I片段連接到pAlLol的骨架中以取代原始含有^w^S基因的A^/IDNA片段。通過限制消化分析重組克隆以確定它們具有正確的插入物以及插入方向。選擇具有以逆時針方向轉錄的p,G基因的克隆。將新質粒定名為pAlLo2(圖5)。實施例6:將家族CEL7F內切葡聚糖酶基因克隆入米曲霉表達載體設計以下所示兩種合成寡核苷酸引物用于PCR擴增來自土生梭孢霉ESTTter08C4的全長開讀框，其編碼家族CEL7F內切葡聚糖酶。使用In-FusionCloningKit(BDBiosciences,PaloAlto,CA)將片段直接克隆到pAlLo2中。In-FusionForward引物5-ACTGGATTACCATGACCCTACGGCTCCCTGTCATCA-3,(SEQIDNO:14)In-FusionReverse引物5，-TCACCTCTAGTTAATTAACTAGTTCTTCGTGGTAGACC-3'(SEQIDNO:15)粗體字母表示編碼序列。剩余序列與pAlLo2的插入位點相比包含序列同一性。將50皮摩爾的以上各種引物用在PCR反應中，所述反應在50jil終體積中含有50ngpTterllC9DNA、IXPfxAmplificationBuffer(Invitrogen，Carlsbad，CA)、6|al10mMdATP、dTTP、dGTP和dCTP的混合物、2.5單位Platinum尸/xDNAPolymerase(Invitrogen,Carlsbad,CA)、1pi50mMMgS。4和510XpCRxEnhancer;容'液(Invitrogen，Carlsbad,CA)。4吏用EppendorfMastercycler5333(EppendorfScientific,Inc.,Westbury,NY)擴增片段，將程序設定為在98°C2分鐘的一個循環；和94°C30秒、65°C30秒和68。C1.5分鐘的35個循環。在35個循環之后，將反應在68°C溫育10分鐘，并且隨后在10°C冷卻直到進一步處理。使用40mMTris堿-20mM乙酸鈉-lmMEDTA二鈉(TAE)緩沖液和每ml0.1溴化乙4走在0.8%GTG瓊脂糖凝月交(CambrexBioproductsOneMeadowlandsPlazaEastRutherford,NewJersey07073)上分離1.4kb的PCR反應產物。在DarkReader(ClareChemicalResearch,Dolores,CO)的輔助下顯現DNA條帶以避免UV誘導的突變。使用一次性剃刀刀片(razorblade)切除1.4kbDNA條帶并根據制造商的說明書使用Ultrafree-DA轉杯(spincup)(Millipore，Billerica,MA)將其純化。通過用7VcoI和尸acI的消化將載體pAlLo2線性化。將片段通過如上所述的凝膠電泳和超濾純化。將純化的PCR片段克隆到線性化并且純化的pAlLo2載體中，使用In-FusionCloningKit(BDBiosciences,PaloAlto,CA)進行所述克隆。反應物(20iul)包含IXIn-FusionBuffer(BDBiosciences,PaloAlto,CA)、IXBSA(BDBiosciences,PaloAlto,CA)、1piIn陽Fusion酶(l:10稀釋的)(BDBiosciences,PaloAlto，CA)、100ng用WcoI和PacI消4匕的pAlLo2和50ng土生梭孢霉CEL7F的純化PCR產物。將反應在室溫溫育30分鐘。將反應的2fil樣品用于根據制造商的說明書轉化大腸桿菌XL10SoloPacGold細胞(Stratagene，LaJolla，CA)。在恢復期(recoveryperiod)之后，將來自轉化反應的兩個100)il等分試樣涂布到補充100pg每ml的氨千青霉素的150mm2XYT平板上。將平板在37。C溫育過夜。從選擇平板中隨機選擇一組八個推定的重組克隆，并且使用BioRobot9600從每個制備質粒DNA。將克隆通過屈oI限制消化分析。隨后將具有期望的限制消化模式(restrictiondigestpattern)的兩個克隆測序以確認在克隆的插入物中不存在突變。選擇克隆#1并定名為pAlLo22(圖6)。實施例7:土生梭孢霉家族CEL7F內切葡聚糖酶基因在米曲霉JAL250中的表達根據Christensene^/.，1988,6:1419-1422的方法制備米曲霉Jal250(WO99/61651)原生質體。將5微克pAlLo22(以及作為載體對照的pAlLo2)用于轉化米曲霉JAL250原生質體。使用pAlLo2轉化米曲霉Jal250產生大約50個轉化體。將8個轉化體分離到單獨的PDA平板并且在34。C溫育5天。用5ml0.01%Tween80洗滌匯合孑包子平氺反(confluentsporeplate),并將孑包子懸浮液用于接種125ml玻璃搖瓶中的25mlMDU2BP培養基。將轉化體培養物以200rpm的持續搖動在34。C溫育。在接種后的第五天，將培養物在6000xg離心并且收集它們的上清液。將5pi的每種上清液與等體積的2X上樣緩沖液(10%(3-琉基乙醇)混合，上樣到L5mm8%-16%Tris-GlycineSDS-PAGE凝膠上并用SimplyBlueSafeStain(Invitrogen,Carlsbad,CA)染色。培養液的SDS-PAGE分布顯示八個轉化體中的六個具有大約40kDa的新蛋白質條帶。選擇轉化體7號用于進一步研究并且將其指定為米曲霉Jal250AlLo22。實施例8:米曲霉Jal250AlLo22的大搖瓶培養將米曲霉Jal250AlLo22孢子涂布到PDA平板上并且在34°C溫育五天。用5ml0.01%Tween80將匯合孢子平板洗滌兩次以使收集的孢子數最大化。隨后將孢子懸浮液用于接種2升Fembach燒瓶中的500mlMDU2BP培養基。將轉化體培養物以持續搖動(200rpm)在34。C溫育。在接種后的第五天，通過在孔大小0.45的500ml,75mmNylon過濾裝置上過濾來收集培養液，所述過濾裝置具有玻璃纖維預過濾器。對培養液的5^樣品如上所述通過SDS-PAGE進行分析，以確認蛋白質分布與之前獲得的相同。一旦培養液顯示含有40kDa蛋白質條帶，則對該培養液進行酶表征。實施例9:土生梭孢霉CEL7F內切葡聚糖酶的表征將實施例8中所述的米曲霉Jal250AlLo22培養液通過0.22pm孑L大小的濾器(Millipore,Billerica,MA)過濾，使用配備PM10膜的Amicon攪拌杯(stirredcell)(Millipore，Billerica,MA)進行濃縮，并且使用Econo-Pac10DG柱(BioRadLaboratories,Hercules,CA)脫鹽。將來自米曲霉Jal250(單獨的載體)的培養液作為陰性對照進行與上述相同的處理。用于評估土生梭孢霉CEL7F內切葡聚糖酶底物特異性的經染色的底物包括AZCL-阿拉伯木聚糖(小麥)、AZCL-p-葡聚糖、AZCL-葡聚糖、AZCL-HE-纖維素、AZCL-馬鈴薯半乳聚糖、AZCL-半乳甘露聚糖(Carob)、AZCL-木聚糖(Birchwood)、AZCL陽木葡聚糖(Megazyme，Bray,Ireland)和ChitinAzure(Sigma，StLouis,MO)。在96深孔平板(AxygenScientific,UnionCity,CA)中進行活性試驗，所述平板由平板密封物(ALPS-300,Abgene,Epsom，UK)密封。將800|ul上述底物(6.25g每升50mM乙酸鈉pH5.0)轉移到96深孔平板的每個孔中，接著是180(il50mM乙酸鈉pH5.0和20pi土生才復孢霉CEL7F內切葡聚糖酶溶液(0.25g/L)以開始反應。最終反應混合物中的底物濃度和酶上樣量分別是5克每升和lmg酶每克底物。將米曲霉Jal250培養液作為陰性對照，與土生梭孢霉CEL7F內切葡聚糖酶培養液在相同條件下一起進行測試。將反應在50。C不進行混合地溫育。取樣前，將深孔平板在平板離心機(SorvallRT7,GlobalMedicalInstrumentation,Ramsey,MN)上以3000rpm離心5分4中。將150(il上清液的樣品轉移到96孔過濾平板(0.45jim孔大小，Millipore，Billerica，MA)中，抽真空(vacuum)并且收集濾出液。將100pi濾出液的樣品轉移到另外的96孑L平板中，并且使用SpectraMAX340(MolecularDevices,S腿yvale，CA)測量590nm的吸光度。在1小時和92小時的溫育之后，由土生梭孢霉CEL7F內切葡聚糖酶從不同經染色底物釋放的染料作為相對的590nm數值示于表1(減去由米曲霉Jal250釋放的染料之后)。表1.土生梭孢霉內切葡聚糖酶與不同經染色底物一起在50°C、pH5.0溫育1小時和92小時之后的相對A590nm<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>AX:AZCL-阿拉伯木聚糖^G:AZCL-,葡聚糖Dex:AZCL-葡聚糖HEC:AZCL-HE-纖維素Gal:AZCL-馬鈴薯半乳聚糖GM:AZCL-半乳甘露聚糖Xly:AZCL-木聚糖XG:AZCL-木葡聚糖土生梭孢霉CEL7F內切葡聚糖酶在1小時后對AZCL-,葡聚糖和AZCL-HE-纖維素具有活性。92小時溫育之后，土生梭孢霉CEL7F內切葡聚糖酶還顯示出對阿拉伯木聚糖、木聚糖和木葡聚糖染色底物的活性，和對半乳甘露聚糖染色底物的低活性。實施例10:用土生梭孢霉CEL7F內切葡聚糖酶水解預處理的玉米秸稈J吏用稀津奪的石克酉吏在U.S.DepartmentofEnergyNationalRenewableEnergyLaboratory(NREL)預處理玉米秸稈。將以下條件用于所述預處理于190°C0.048克硫酸/克干的生物質和25%w/w千固體，持續大約l分鐘。預處理的玉米秸稈(PCS)中的水不溶性固體含有52%纖維素、3.6%半纖維素和29.8%木質素。通過兩階段硫酸水解和后續通過高效液相色譜的糖分析，使用NRELStandardAnalyticalProcedure#002測定纖維素和半纖維素。在以石危酸水解纖維素和半纖維素級分之后，使用NRELStandardAnalyticalProcedure#003以重力分析法測定木質素。在酶水解之前，將PCS用大體積的重蒸餾水洗滌直至pH高于4.0，并且隨后通過100目篩網篩濾，在121°C高壓滅菌30分鐘。PCS的水解在96深孔平板中進行(AxygenScientific,UnionCity,CA)，將所述平4反用平才反密封物(ALPS-300，Abgene，Epsom,UK)密封，總反應體積為1.0ml。PCS(10mg/ml，于50mM乙酸鈉pH5.0緩沖液中)的水解使用1.25mg土生梭孢霉CEL7F內切葡聚糖酶(如實施例9中所述制備)每克PCS來進行。將來自米曲霉Jal250的培養液(如實施例9中所述制備)作為對照操作。PCS水解在50。C、pH5.0進行。重復進行反應，并且在水解期間取得等分試樣。通過將每種水解產物的20pi等分試樣與180|il0.11MNaOH(終止試劑)混合來停止PCS水解反應。對于每種樣品產生適當的系列稀釋物，并且使用如下所述適合96孔微量培養板形式的對羥基苯甲酸酰肼(para-hydroxybenzoicacidhydrazide)(PHBAH，Sigma,St.Louis,MO)試驗測定還原糖含量。簡而言之，將適當稀釋的樣品的90pi等分試樣置于96孔錐底微量培養板(conicalbottomedmicroplate)中。通過向每個孔中添加60jil2%NaOH中的1.5%(w/v)PHBAH來起始反應。將平板無覆蓋地在95。C加熱10分鐘。使平板冷卻至室溫(RT),并且向每個孔添加50jul蒸餾H20。將來自每個孔的100jul等分試樣哞爭移至平底96孑L平4反中，并JU吏用SpectraMaxMicroplateReader(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)測量A徹隱的吸光度。使用葡萄糖標準(0.1-0.0125mg/ml,用0.4%氫氧化鈉稀釋)制備標準曲線，以將所得A4賜m數值轉化成葡萄糖當量。將所得當量用于計算每個反應的PCS纖維素轉化百分比。使用以下等式計算纖維素轉化成還原糖的程度(轉化率，％):轉化率(%)=RS(mg/ml)*100*162/(纖維素(mg/ml)*180)=RS(mg/ml)*100/(纖維素(mg/ml)*1.111)在這個等式中，RS是以葡萄糖當量(mg/ml)測量的溶液中還原糖的濃度，而因子1.111反映出將纖維素轉化成葡萄糖的重量增加。土生梭孢霉CEL7F內切葡聚糖酶(1.25mg/gPCS)的PCS水解在120小時之后得到2.1%的纖維素轉化率。米曲霉Jal250(1.25mg/gPCS)在120小時之后得到少于1%的轉化率。實施例11:土生梭孢霉內切葡聚糖酶對來自大麥的可溶性(3-葡聚糖的水解將土生梭孢霉Cd7F內切葡聚糖酶以實施例8中所述的米曲霉Jal250AlLo22培養液的形式進行測試。將培養液濃縮，并且使用來自Millipore(Bedford,MA)的帶有Biomax-5聚醚砜膜(5000NMWL)的CentriconPlus-20離心濾器將培養液交換成50mM乙酸鈉pH5.0。將來自米曲霉Jal250的培養液同上處理。使用BicinchoninicAcid(BCA)微量培養板試驗，依照BCAProteinAssayReagentKit(PierceChemicalCo.,Rockford,IL)的制造商說明書測定酶溶液中的蛋白質濃度。在各反應之前從貯藏在-20。C的酶儲液制備新鮮的酶稀釋物。土生梭孢霉Cel7F內切葡聚糖酶對來自大麥的可溶性(3-葡聚糖(中等粘度,230kDa,MegazymeInternationalIrelandLtd.,Bray,Ireland)的活性在pH5.5(具有0.02%疊氮化鈉的50mM乙酸鈉)和60°C測定。將結果與里氏木霉Cel7B(EGI)內切葡聚糖酶的結果進行比較。重組里氏木霉Cel7B(EGI)內切葡聚糖酶能夠依照Takashimaefa/.,1998,Jow廠腦/o/S/o&c/z"o/ogy65:163-171制備。水解反應中卩-葡聚糖的初始濃度是1.0%(w/v)。將1ml反應在Eppendorf96DeepWellPlates(1.2ml,VWRScientific,WestChester,PA)中無攪拌地進行。將酶以三種蛋白質加載量(loading)使用0.05、0.1和0.2mg每克葡聚糖。在對照試驗中，將內切葡聚糖酶用50mM含有0.02%疊氮化鈉的乙酸鈉pH5.5取代(緩沖液對照)，或用不含重組表達酶的經過濃縮并且以緩沖液交換的米曲霉Jal250培養液取代(Ja1250對照)。在2小時和24小時從水解反應中移出等分試樣，用去離子水稀釋，并且使用對羥基苯曱酸酰肼(PHBAH)試驗如實施例10中所述分析還原糖。將2小時和24小時兩個溫育時間的(3-葡聚糖相對轉化率作為蛋白質加載量的函數分別示于圖7和8。將所述相對轉化率顯示為在以土生梭孢霉Cel7F內切葡聚糖酶(0.2mg蛋白質每克葡聚糖)水解(3-葡聚糖24小時之后獲得的轉化率的百分比。土生梭孢霉Cel7F內切葡聚糖酶與里氏木霉Cel7B內切葡聚糖酶相比顯示較高的(3-葡聚糖轉化率，并且超過2小時溫育時間之后繼續產生新的還原端基團。與之相反，里氏木霉Cel7B內切葡聚糖酶顯示2小時水解之后在還原糖濃度上幾乎沒有額外的增加。生物材料的保藏依據布達佩斯條約的條款，下述的生物材料已經保藏于農業研究機構專利培養物保藏中'"(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection),北方區研究中心(NorthernRegionalResearchCenter),1815UniversityStreet,Peoria,Illinois,61604,給出了下述的登錄號保藏物登錄號保藏日期大腸桿菌pTter7FNRRLB-308372005年4月11曰該菌抹于下述條件下保藏確保在本專利申請未決期間，由專利與商標委員依據37C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122授權的人能夠獲得該培養物。該保藏物為所保藏菌抹的基本上純的培養物。在提交了該申請的副本，或其后續文本的國家，依據該外國專利法律的要求，可以獲得該保藏物。然而，應當理解，保藏物的獲得并不構成對實施本發明的許可，實施本發明是對政府行為所授予的專利權的侵犯。此處，本發明中所描述的和要求的并非是要用本文所公開的具體方面來限定范圍，因為這些方面意欲作為本發明幾個方面的說明。任何等價的方面意欲在本發明的范圍之內。事實上，從前面的說明中，對于本領域技術人員來說，除本文所顯示和描述的之外，本發明的多種修改是顯而易見的。這些修改也意欲落入所附的權利要求的范圍之內。在沖突的情況下，將以包括定義部分的本公開為準。本文引用了許多參考文獻，其中公開的全部內容并入作為參考。<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>權利要求1.具有內切葡聚糖酶活性的分離的多肽，其選自下組(a)多肽，其包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少60％同一性的氨基酸序列；(b)多肽，其由在至少中嚴緊條件下與以下序列雜交的多核苷酸編碼(i)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈；和(c)變體，包含保守取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO2的成熟多肽。2.權利要求1的多肽，包含與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少60%同一性的氨基酸序列。3.權利要求2的多肽，包含與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少65%同一性的氨基酸序列。4.權利要求3的多肽，包含與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少70%同一性的氨基酸序列。5.權利要求4的多肽，包含與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少75%同一性的氨基酸序列。6.權利要求5的多肽，包含與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少80%同一性的氨基酸序列。7.權利要求6的多肽，包含與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少85%同一性的氨基酸序列。8.權利要求7的多肽，包含與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少90%同一性的氨基酸序列。9.權利要求8的多肽，包含與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少95%同一性的氨基酸序列。10.權利要求1的多肽，所述多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸序列，或其具有內切葡聚糖酶活性的片段。11.權利要求10的多肽，包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。12.權利要求ll的多肽，包含SEQIDNO:2的成熟多肽。13.權利要求1的多肽，由SEQIDNO:2或其具有內切葡聚糖酶活性的片段組成。14.權利要求13的多肽，由SEQIDNO:2組成。15.^l利要求14的多肽，由SEQIDNO:2的成熟多肽組成。16.權利要求1的多肽，所述多肽由多核苦酸編碼，所述多核苷酸在至少中嚴緊條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈。17.權利要求16的多肽，所述多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少中-高嚴緊條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈。18.權利要求17的多肽，所述多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴緊條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈。19.權利要求1的多肽，所述多肽由質粒pTter7F中所含的多核苷酸編碼，所述質粒包含在大腸桿菌NRRLB-30837中。20.權利要求l的多肽，其中所述多肽是變體，所述變體包含保守取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:2的氨基酸18至336。21.權利要求1-20中任一項的多肽，其中所述成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸18至336。22.權利要求1-20中任一項的多肽，其中所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:1的核苦酸52至1008。23.權利要求1-22中任一項的多肽，還對一種或多種選自下組的底物具有酶活性木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖、1，4-半乳聚糖、半乳甘露聚糖、葡聚糖和殼多糖。24.分離的多核苷酸，其包含編碼權利要求1-23中任一項的多肽的核苷酸序列。25.權利要求24的分離的多核苷酸，其在SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列中包含至少一個突變，其中突變的核苷酸序列編碼SEQIDNO:2的成熟多肽。26.核酸構建體，其包含權利要求24或25的多核香酸，所述多核苷酸與一個或多個調控序列可操作地連接，所述調控序列指導多肽在表達宿主中產生。27.重組表達載體，包含權利要求26的核酸構建體。28.重組宿主細胞，包含權利要求26的核酸構建體。29.用于產生權利要求1-23中任一項的多肽的方法，其包括(a)在有益于所述多肽產生的條件下培養細胞，所述細胞以其野生型形式能夠產生所述多肽；和(b)回收所述多肽。30.用于產生權利要求1-23中任一項的多肽的方法，其包括(a)在有益于所述多肽產生的條件下培養包含核酸構建體的宿主細胞，所述核酸構建體包含編碼所述多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述多肽。31.用于產生親本細胞突變體的方法，所述方法包括破壞或缺失編碼權利要求1-23中任一項的多肽的核苷酸序列，其導致突變體與親本細胞相比產生較少的所述多肽。32.通過權利要求31的方法產生的突變細胞。33.權利要求32的突變細胞，所述突變細胞還包含編碼天然或異源蛋白質的基因。34.用于產生蛋白質的方法，其包括(a)在有益于蛋白質產生的條件下培養權利要求33的突變細胞；和(b)回收所述蛋白質。35.通過以下方法獲得的分離的多核苷酸(a)在中嚴緊條件下將DNA的群體與以下雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈；和(b)分離雜交多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有內切葡聚^f唐酶活性的多肽。36.權利要求35的分離的多核苷酸，其通過以下方法獲得(a)在中-高嚴緊條件下將DNA的群體與以下雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈；和(b)分離雜交多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有內切葡聚糖酶活性的多肽。37.權利要求36的分離的多核苷酸，其通過以下方法獲得(a)在高嚴緊條件下將DNA的群體與以下雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈；和(b)分離雜交多核苷酸，所述多核芬酸編碼具有內切葡聚糖酶活性的多肽。38，權利要求35-37中任一項的分離的多核苷酸，其中所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:1的核苷酸52至1008。39.用于產生包含突變核苷酸序列的多核苷酸的方法，其包括(a)將至少一種突變引入到SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列中，其中所述突變的核苷酸序列編碼由SEQIDNO:2的成熟多肽組成的多肽；和(b)回收包含突變核香酸序列的多核苷酸。40.通過權利要求39的方法產生的突變多核苷酸。41.用于產生多肽的方法，其包括(a)在有益于多肽產生的條件下培養細胞，所述細胞包含編碼多肽的權利要求40的突變多核苷酸；和(b)回收所述多肽。42.核酸構建體，其包含編碼蛋白質的基因，所述基因與編碼信號肽的核苷酸序列可操作地連接，所述信號肽包含SEQIDNO:2的氨基酸1-17或由SEQIDNO:2的氨基酸1-17組成，其中所述基因對于該核苷酸序列是外源的。43.包含權利要求42的核酸構建體的重組表達載體。44.包含權利要求42的核酸構建體的重組宿主細胞。45.用于產生蛋白質的方法，其包括(a)在有益于蛋白質產生的條件下培養權利要求44的重組宿主細胞；和(b)回收所述蛋白質。46.用于產生權利要求1-23中任一項的多肽的方法，其包括(a)在有益于多肽產生的條件下培養轉基因植物或植物細胞，所述轉基因植物或植物細胞包含編碼具有內切葡聚糖酶活性的多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。47.轉基因植物、植物部分或植物細胞，其已經使用多核苷酸轉化，所述多核苷酸編碼權利要求1-23中任一項的多肽。48.洗滌劑組合物，所述洗滌劑組合物包含權利要求1-23中任一項的多肽和表面活性劑。49.用于降解含有纖維素和半纖維素的生物質的方法，其包括用有效量的權利要求1-23中任一項的多肽處理生物質和回收降解的生物質。50.權利要求49的方法，還包括用有效量的內切-l,4-(3-葡聚糖酶、外切-1,4-(3-D-葡聚糖酶和/或(3-D-葡糖苷酶處理生物質。51.用于降解含有纖維素和半纖維素的生物質的方法，其包括用權利要求28的宿主細胞處理生物質和回收降解的生物質。52.權利要求51的方法，還包括用有效量的內切-l,4-(3-葡聚糖酶、外切-1,4-(3-D-葡聚糖酶和/或(3-D-葡糖苷酶處理生物質。全文摘要本發明涉及具有內切葡聚糖酶活性的分離的多肽和編碼所述多肽的分離的多核苷酸。本發明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構建體、載體和宿主細胞，以及用于制備和使用所述多肽的方法。文檔編號C12N9/42GK101253263SQ200680023158公開日2008年8月27日申請日期2006年4月27日優先權日2005年4月27日發明者丁晗澍,保羅·哈里斯,埃琳娜·弗拉森科,米切爾·雷伊,阿爾弗雷多·洛佩斯德利昂申請人:諾維信股份有限公司