專利名稱：：新型的磷脂加工劑的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種新型的磷脂加工劑，所述磷脂加工劑具有高的磷脂酶B(PLB)活性，并對磷脂具有底物特異性。技術背景磷脂酶是能夠水解磷脂的酶的總稱。磷脂(甘油磷脂)具有通過酯鍵連接到甘油的a位和卩位的羥基上的脂肪酸，同時還具有通過磷酸基團連接到甘油的另一個a位的羥基上的膽堿、乙醇胺或肌醇等。水解甘油磷脂的甘油基團的a位上的脂肪酸酯鍵的酶通稱為磷脂酶Al。水解甘油基團的(3位上的脂肪酸酯基團的酶通稱為磷脂酶A2。此外，同時具有磷脂酶Al活性和磷脂酶A2活性的酶通稱為磷脂酶B(PLB)。另外，從磷脂上僅去掉a位和(3位脂肪酸酰基中的一個脂肪酸酰基的磷脂通稱為溶血磷脂。水解以溶血磷脂作用后留下的脂肪酸酯鍵的酶能夠產生與上述PLB相同的分解產物。因此，所述酶也可以包括在PLB家族中。另一方面，將磷脂中的甘油基團和磷酸基團之間的酯鍵水解的酶通稱為磷脂酶C(PLC)。此外，水解帶有膽堿或乙醇胺等的磷酸基團的連接鍵的酶通稱為磷脂酶D(PLD)。如上所述，PLB還具有磷脂酶活性。已知PLB存在于動物、植物、青霉菌的霉菌、大腸桿菌和酵母等中。PLB對二酰基形式的磷脂的作用非常弱，但是對溶血卵磷脂的作用很強。因此，PLB從未用于有效水解普通的磷脂。此外，對于那些已知的PLB，僅有報道它們可以作用于各種不同的磷脂，例如磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸和磷脂酰肌醇(非專利文獻1和2)。已有各種報道報道了磷脂酰肌醇包含在大豆卵磷脂中并與細胞的信號轉導密切相關。近年來，據報道攝入磷脂酰肌醇能夠降低血液中的三酰甘油(TG)水平和提高HDL-C(高密度脂蛋白膽固醇)的水平(非專利文獻3)。在本領域中，磷脂酰肌醇的生理功能以及磷脂酰肌醇的生理學上的衍生物如溶血磷脂酰肌醇和甘油磷酰肌醇正受到關注。此外，另據報道，溶血磷脂酰肌醇具有抗霉作用(專利文獻1)。已經嘗試通過PLC或PLD對磷脂進行作用而以酶特異性方式來獲得磷脂酰肌醇。然而，所得磷脂酰肌醇的純度很低。因此，本領域需要更具選擇性的方法來制備磷脂酰肌醇(專利文獻2)。非專利文獻2還記述了如果要讓PLC作用于除磷脂酰肌醇以外的磷脂，就要在約30%的水解率時終止反應。專利文獻h日本特開平06-256366號公報專利文獻2:日本特開昭62-48390號公報非專利文獻l:BiochimicaBiophysicaActa(1974)369，245253非專利文獻2:BiochimicaBiophysicaActa(1975)403，412424非專利文獻3:Biochem.J(2004)382，441449非專利文獻4:JimW.Burgess等，JournalofLipidResearch(46)，350355
發明內容本發明所要解決的問題本發明的一個目的是提供一種磷脂加工劑，所述磷脂加工劑具有高的PLB活性，并對磷脂具有底物特異性；本發明還提供一種可有效地制備高純度磷脂酰肌醇和甘油磷酰膽堿的方法。解決所述問題的手段本發明人為解決上述問題而進行了深入的研究，結果發現，來自假絲酵母屬(Ca"力W")的酶令人驚訝地對二酰基形式的磷脂具有高PLB活性，并且所述酶意外地對磷脂具有這樣的特異性所述酶選擇性地水解大豆磷脂(其為磷脂混合物)中除磷脂酰肌醇以外的磷脂，利用所述特異性，本發明人找到了可有效地制造高純度磷脂酰肌醇和甘油磷酰膽堿的方法。最后，本發明人基于所述發現而完成了本發明。來自假絲酵母屬的所述酶常用于食品工業和藥用產品用原料生產中的脂酶。然而，僅報道了所述酶具有作用于中性脂質的所謂"脂酶活性"。并沒有報道所述酶具有PLB活性。艮P，本發明涉及如下各項<1>、一種磷脂加工劑，所述磷脂加工劑包含來自假絲酵母屬(Cfl"^fe)且具有磷脂酶B(PLB)活性的酶。<2>、一種磷脂加工劑，所述磷脂加工劑包含具有磷脂酶B(PLB)活性的酶，所述酶基本上僅僅不分解磷脂混合物中的磷脂酰肌醇。<3>、如項<1>或<2>所述的磷脂加工劑，其中，具有磷脂酶B(PLB)活性的酶還具有脂酶活性。<4>、如項<1><3>任一項所述的磷脂加工劑，其中，具有PLB活性的所述酶具有下述的物理化學性質(1)作用將磷脂水解成2摩爾比的游離脂肪酸和等摩爾比的甘油磷酰膽堿的作用；(2)分子量53,000±3，000(根據SDS電泳法測定)；(3)等電點pH4.21±0.2;(4)最佳pH:約pH5.56.5;(5)pH穩定性約pH59(37。C處理90分鐘)；(6)穩定性55r(在pH5處理IO分鐘)；和(7)底物特異性:對磷脂酰肌醇的活性比為對磷脂酰膽堿的活性比的10%以下。<5>、一種磷脂加工劑，所述磷脂加工劑包含由柱狀假絲酵母(Owcfe/aqy//"t/racea)的培養液得到的酶。<6>、一種磷脂加工劑，所述磷脂加工劑通過以下步驟得到(1)培養柱狀假絲酵母；(2)濃縮柱狀假絲酵母的培養液；(3)用有機溶劑使酶沉淀；(4)用疏水色譜法對步驟(3)得到的粗制酶溶液進行提純；和(5)用離子交換色譜法對步驟(4)得到的酶進行分離和提純。<7>、一種磷脂加工劑，所述磷脂加工劑包含選自以下酶中的至少一種酶具有SEQIDNo.1的氨基酸序列的酶；與SEQIDNo.1的氨基酸序列的同源性為75。/。以上且具有PLB活性的酶；具有SEQIDNo.1的氨基酸序列中缺失、置換或增加了一個或多個氨基酸的氨基酸序列且具有PLB活性的酶。<8>、一種磷脂加工劑，所述磷脂加工劑包含選自以下酶中的至少一種酶具有SEQIDNo.2的氨基酸序列的酶；與SEQIDNo.2的氨基酸序列的同源性為75。/。以上且具有PLB活性的酶；具有SEQIDNo.2的氨基酸序列中缺失、置換或增加了一個或多個氨基酸的氨基酸序列且具有PLB活性的酶。<9>、一種制造磷脂酰肌醇和甘油磷酰膽堿的方法，所述方法包括使項<1〉<8>中任一項所述的磷脂加工劑作用于磷脂混合物。<10>、一種制造磷脂酰肌醇的方法，所述方法包括使項<1><8>中任一項所述的磷脂加工劑作用于磷脂混合物。<11>、一種制造磷脂酰肌醇的方法，所述方法包括以下步驟(1)使權利要求<1><8>中任一項所述的磷脂加工劑作用于磷脂混(2)使用有機溶劑提取磷脂酰肌醇；和(3)通過水溶性或水混和性垸基羰基烷基溶劑處理，沉淀并回收磷脂酰肌醇。<12>、如項<9><11>中任一項所述的制造磷脂酰肌醇的方法，其中，所述磷脂混合物來自大豆。<13>、一種磷脂酰肌醇，所述磷脂酰肌醇是通過項<10><12>中任一項所述的制造方法得到的，并且在總磷脂中具有的純度為50摩爾％以上。<14>、一種制造甘油磷酰膽堿的方法，所述方法包括使項<1><8>中任一項所述的磷脂加工劑作用于磷脂混合物。<15>、一種制造甘油磷酰膽堿的方法，所述方法包括以下步驟(1)使權利要求<1><8〉中任一項所述的磷脂加工劑作用于磷脂混合物；(2)用含有有機溶劑的溶劑提取并除去脂質組分，并且將甘油磷酰膽堿收集到水層中；和(3)將步驟(1)中發揮作用的所述磷脂加工劑吸附在活性炭上，并除去所述磷脂加工劑。<16>、如項<9>、<14>或<15>所述的制造甘油磷酰膽堿的方法，其中，所述磷脂混合物來自大豆。<17〉、一種甘油磷酰膽堿，所述甘油磷酰膽堿是通過項<14><16>中任一項所述的制造方法得到的，并具有55重量％以上的甘油磷酰膽堿純度。<18>、項<13>所述的磷脂酰肌醇在制備高純度甘油磷酸肌醇中的應用。<19>、項<17>所述的甘油磷酰膽堿在制備高純度膽堿磷脂中的應用。<20>、含有通過項<10><12>中任一項所述的制造方法制造的所述磷脂酰肌醇的食品、藥品或化妝品。<21>、含有項<14><16>中任一項所述的制造方法制造的所述甘油磷酰膽堿的食品、藥品或化妝品。<22〉、一種溶血磷脂酰肌醇，所述溶血磷脂酰肌醇是通過使具有磷脂酶八1或磷脂酶八2活性的酶作用于通過項<10><12>中任一項所述的制造方法制造的所述磷脂酰肌醇而得到的。<23>、一種制造溶血磷脂酰肌醇的方法，所述方法包括使具有磷脂酶八1或磷脂酶八2活性的酶作用于通過項<10><12>中任一項所述的制造方法制造的所述磷脂酰肌醇。<24〉、含有通過項<23>所述的制造方法制造的溶血磷脂酰肌醇的食品、藥品或化妝品。<25>、一種甘油磷酰肌醇，所述甘油磷酰肌醇是通過使對磷脂酰肌醇具有充分作用的具有磷脂酶8活性的酶作用于通過項<10><12>中任一項所述的制造方法制造的所述磷脂酰肌醇而得到的。<26>、一種制造甘油磷酰肌醇的方法，所述方法包括使對磷脂酰肌醇具有充分作用的具有磷脂酶8活性的酶作用于通過項<10><12>中任一項所述的制造方法制造的所述磷脂酰肌醇。<27>、含有通過項<26>所述的制造方法制造的所述甘油磷酰肌醇的食品、藥品或化妝品。<28〉、食品、藥品或化妝品，所述食品、藥品或化妝品含有選自以下物質組成的組中的兩種以上物質通過項<10><12>中任一項所述的制造方法制造的磷脂酰肌醇；通過項<14><16>中任一項所述的制造方法制造的甘油磷酰膽堿；通過項<23〉所述的制造方法制造的溶血磷脂酰肌醇；和通過項<26>所述的制造方法制造的甘油磷酰肌醇。本發明的效果使用本發明的磷脂加工劑使得可以制備高純度的磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰肌醇、甘油磷酰膽堿和甘油磷酰肌醇等，這些物質可以用作功能性磷脂或功能性磷脂原料。圖1顯示了由作為本發明實施例4的磷脂加工劑的PLB的凝膠過濾色譜法獲得的色譜圖。圖2顯示了作為本發明實施例5的磷脂加工劑的PLB的最佳pH。圖3顯示了作為本發明實施例5的磷脂加工劑的PLB的pH穩定性結果。圖4顯示了作為本發明實施例5的磷脂加工劑的PLB的熱穩定性結果。圖5顯示了作為本發明實施例5的磷脂加工劑的PLB的等電電泳結果。具體實施例方式下文將進一步詳細地描述本發明的構成和優選的實施方式。1、作為磷脂加工劑的磷脂酶B(PLB)在本說明書中，術語"PLB"是指用于進行磷脂的a位和(3位上的脂肪酸酯的水解、脂肪酸酯合成和脂肪酸酯交換的酶。本發明的PLB包括作用于溶血磷脂和水解殘余的脂肪酸酯鍵的任何酶。另夕卜，術語"磷脂加工"是指這樣的反應，例如磷脂的水解、脂肪酸酯合成或脂肪酸酯交換等。所述術語優選指所述水解或脂肪酸酯合成，更優選指所述水解。在另一個優選的方式中，所述術語指所述脂肪酸酯合成。另外，本發明的加工劑不僅包括PLB本身，而且還包括添加有諸如糖等酶穩定劑和pH緩沖劑的PLB。此外，所述磷脂加工劑可以按類似于常規酶的方式以干燥粉末或液體等形式提供。本發明提供了具有PLB活性的磷脂加工劑，所述磷脂加工劑基本上僅僅不分解磷脂混合物中的磷脂酰肌醇，但是分解所述混合物的其他組分。就磷脂加工劑而言，短語"基本上僅僅不分解磷脂酰肌醇"是指在作為底物的磷脂混合物中的磷脂酰肌醇相對于磷脂酰膽堿的活性比(相對活性)的上限為10%以下。意指其活性比優選為7%以下，更優選為5%以下，尤其優選為3%以下，最優選為1%以下。該短語還指其活性比的下限為0.01%以上，更優選為0.1%以上。另外，該短語還指除磷脂酰肌醇和磷脂酰膽堿(例如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸或磷脂酸(PA)等)以外的磷脂相對于磷脂酰膽堿的活性比(相對活性)的下限為15%以上。意指其活性比優選為20%以上，更優選為25%以上，尤其優選為30%以上，最優選為40%以上。表示其活性比的上限為200%以下，優選為150%以下，更優選為100%以下。此外，作為本發明的磷脂加工劑的PLB優選具有如下性質1)作用將磷脂(例如卵磷脂)水解成2摩爾比的游離脂肪酸和等摩爾比的甘油磷酰膽堿的作用；和作用于甘油三酸酯而將其水解為3摩爾比的游離脂肪酸和等摩爾比的甘油的作用；2)分子量53,000±3,000(根據SDS電泳法測定);3)根據等電電泳法測得的等電點pH4.21±0.2;4)最佳反應pH:約pH5.56.5;5)pH穩定性約pH59(37。C處理90分鐘)；6)熱穩定性55。C(在pH5處理10分鐘)；禾口7)底物特異性對磷脂酰肌醇的活性比為對磷脂酰膽堿的活性比的10%以下。作為本發明的磷脂加工劑的PLB的來源(根源)不受特別限制，只要所述PLB具有上述特性即可。當所述PLB為天然來源時，所述PLB優選為微生物來源，更優選來自假絲酵母屬，更具體地說是來自柱狀假絲酵母。另外，作為本發明的磷脂加工劑的PLB可以是基于上述天然來源的酶的基因修飾的酶。通過基因重組技術制得的PLB包括在作為本發明的磷脂加工劑的PLB中，并且優選其具有上述特性。另外，所述PLB包括具有SEQIDNo.1或2所示的氨基酸序列的酶本身或與SEQIDNo.1或2所示的氨基酸序列具有75%以上同源性的氨基酸序列。具有PLB活性的任何酶也都包括在作為本發明的磷脂加工劑的PLB中，并且這樣的酶不受特別限制，只要其具有PLB活性即可。然而，相對于SEQIDNo.1所示的氨基酸序列的同源性優選為80%以上，更優選為85%以上，進一步優選為90%以上，尤其優選為95%以上，最優選為98%以上。另外，優選所述磷脂加工劑基本上僅僅不分解磷脂酰肌醇。術語"基本上僅僅不分解磷脂酰肌醇"與如上所述的術語同義。本發明使用的術語"同源性"是指氨基酸序列或DNA核苷酸序列的同源性，其可以采用計算機通過已知方法(如序列比較)來測定。所用的分析軟件是GENETEXWIN5.2(由SoftwareCo.,Ltd制造)。測定同源性時使用的示例性計算機程序可以是包含GAP的GCG程序包(Devereux，J.等，NucleicAcidsResearch12(12):387(1984))或者BLAST程序包(NCBI，或Altschul，S.F.等，J.Mol.Biol.，215:403410(1990))和Smith-Waterman算法，但不具體限定于這些。另外，作為本發明的磷脂加工劑的PLB包括具有同等功能且具有SEQIDNo.1或2所示的氨基酸序列中缺失、置換或增加了一個至多個氨基酸的氨基酸序列以及具有PLB活性的任意經修飾的酶。缺失、置換或增加的氨基酸數量的下限優選為(但不具體限于)一個以上，更優選為兩個以上，并且上限優選為25個以下，更優選為20個以下，進一步優選為15個以下，尤其優選為10個以下，最優選為5個以下。另外，優選所述磷脂加工劑基本上僅僅不分解磷脂酰肌醇。術語"基本上僅僅不分解磷脂酰肌醇"與如上所述的術語同義。本領域熟知來自柱狀假絲酵母的5種不同脂酶的氨基酸序列。任何天然的脂酶都可以用作本發明的磷脂加工劑。即使缺失、置換或增加了一個至多個氨基酸的酶也可以用于以下用途中，只要所述酶具有PLB活性即可。同時，本發明的磷脂加工劑優選還具有脂酶活性。所述磷脂加工劑可以作用于甘油三酸酯并將所述甘油三酸酯水解成3摩爾比的游離脂肪酸和等摩爾比的甘油。如果將所述磷脂加工劑施用于磷脂和甘油三酸酯的混合物，它們可以同時受到水解。2、制造PLB的方法用于本發明的磷脂加工劑的PLB可以容易地以來自假絲酵母屬的酶產品的形式商購獲得并使用。作為選擇，所述酶可以由通過培養假絲酵母屬的微生物所獲得的產物來制備。假絲酵母屬的微生物的優選實例包括但不限于柱狀假絲酵母株。所述生成PLB的菌株可以是用紫外射線和化學誘變劑處理過的突變株。另外，可以使用通過將以能夠高水平表達的形式的后述PLB基因導入宿主細胞而制得的基因重組體。微生物培養的培養液組分和培養條件不受特別限制，只要菌株能夠生成PLB即可。適合所述酶生成的培養條件通常為在需氧條件下在中度溫育溫度于營養培養液中培養的條件。當將所述菌株培養在任何所述的條件下時，可以觀察到良好的細菌生長和酶的生成。具體地說，例如，用于培養液的碳源包括葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、麥芽糖、玉米淀粉和馬鈴薯淀粉。氮源的實例包括麥麩、蛋白胨、酵母提取物、大豆粉、脫脂大豆粉、酪蛋白、棉籽粉、脫脂棉籽粉、明膠、各種氨基酸(例如谷氨酸)、硫酸銨和脲等。所述碳源和氮源可以適當地組合使用。其中，優選的實例包括大豆粉和葡萄糖的組合或者脫脂大豆粉和葡萄糖的組合。可以在所述培養液中使用的其他組分的實例有諸如食鹽、磷酸鈉、硫酸鎂和氯化鈣等無機鹽，等等。其中可以優選使用食鹽、磷酸鹽或鎂鹽。將假絲酵母屬的酵母溫育在含有碳源、氮源和無機鹽的無菌培養液中，然后在有氧條件下溫育。采用的溫育溫度為22'C至33°C，優選為26t:至30°C，尤其優選為27。C至28。C。溫育時間為30小時至60小時，這根據通風、搖動或溫育溫度而定。可以監測上清液的PLB活性，然后在達到穩定期時終止溫育。本發明中所用的微生物在上述培養條件下可以分泌并生成用于本發明的磷脂加工劑的酶PLB。作為用于制備所述酶的材料的培養液的上清液可以通過與菌體分離而獲得。可以通過采用硫酸銨進行的鹽沉淀和采用有機溶劑如丙酮或乙醇進行的沉淀來提純包含在通過離心分離和過濾程序而獲得的培養上清液中的PLB，但優選通過丙酮沉淀提純。可以在所述沉淀程序之前通過超濾來濃縮酶。另外，如果需要，可以采用諸如離子交換色譜法、凝膠過濾法、疏水色譜法和親和色譜法等熟知的程序，通過將所述酶提純和/或濃縮至所需的水平來獲得經提純的酶。包含在本發明所使用的磷脂加工劑中的酶的純度越高，就可以越有效地分解磷脂。然而，根據所述目的，即使是粗制狀態的酶也可以使用。即便所述酶是通過離子交換色譜法分餾到的酶級分A和B的混合物，這樣的酶也是可以使用的。當用作本發明的磷脂加工劑的PLB是具有同等功能的經修飾的酶時，本領域技術人員可以根據與序列表中編碼具有SEQIDNo.1所示的氨基酸序列的酶的SEQIDNo.3基因的堿基序列有關的信息來獲得這樣的酶。需要注意的是，基因重組技術可以根據已知方法(例如，基因重組技術手冊，如Sambrook，J.等的"MolecularCloning-ALaboratoryManual",ColdSpringHarborLaboratory,NY，1989)進行。例如，可以通過以下方法獲得經修飾的酶根據與序列表中SEQIDNo.3基因序列有關的信息，設計適當的引物或適當的探針。采用所述引物或探針以及來自目標活生物體的樣品來進行聚合酶鏈式反應(PCR)法或雜交法，由此獲得目標基因。然后，通過基因改造中常用的諸如誘導位點特異性突變法(Mark，D.F.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，56625666，1984)等方法進行基因修飾。然后，在諸如采用酵母屬CSacc/wram;;c^)或畢赤酵母屬(尸/c/z^)作為宿主的表達系統等適合的表達系統中表達經修飾的基因，以獲得經修飾的酶。可以采用實施例2中描述的方法來證實經修飾的酶是否具有PLB活性。優選含有經修飾的酶的磷脂加工劑基本上僅僅不分解磷脂混合物中的磷脂酰肌醇。另外，優選所述磷脂加工劑具有脂酶活性。3、制造磷脂酰肌醇(PI)和/或甘油磷酰膽堿(GPC)的方法本發明提供了同時而有效地制造高純度的PI和GPC的方法。此外，本發明還提供了單獨而有效地制造高純度的PI或GPC的方法。本發明的磷脂加工劑具有用于選擇性水解磷脂混合物中除了PI以外的磷脂的磷脂特異性。因此，可以選擇性地制造高純度的PI。另外，采用本發明的磷脂加工劑來分解包含PC作為主要組分的大豆磷脂，可以在制造PI的同時制造出高純度的GPC。獲得作為功能性磷脂或功能性磷脂原料的高純度PI和GPC是特別有用的。PI還可以通過使PLC作用于磷脂來獲得(見如上所述的專利文獻2)，但這種方法不能導致GPC的生成。通過本發明作為反應產物生成的GPC預計可以用作防止癡呆等的物質，因此，利用了PLB的作用的本發明在這一點上同樣也是有利的。下文將詳細描述制造各組分的方法。(a)制造磷脂酰肌醇(PI)的方法用作本發明的磷脂加工劑的PLB在加工天然存在的磷脂的應用中特別有用。本發明提供了一種有效地制造高純度PI的方法。磷脂是細胞膜的結構組分，并負責重要的生理功能。具體地說，PI密切參與細胞膜中的胞內/胞外信號轉導。藥品/食品應用中的磷脂供應源主要是大豆、雞蛋黃或魚卵等。這些磷脂通常作為諸如磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酸(PA)和磷脂酰肌醇(PI)等多種分子物質的混合物獲得。為了從這些磷脂混合物中分離出PI，通常采用有機溶劑分餾法、使用諸如硅膠或氧化鋁等載體的色譜分離法等。這些方法可以有效地獲得含量比較充足的PC和PE，但是遠遠不足以獲得諸如低含量PI等磷脂組分。同時還需要使用大量諸如氯仿等鹵素類的有機溶劑。因此，所得產物的用途有限。為了有效地由含有PC、PE、PS、PA、PI的磷脂制備出PI，可以選擇性地水解除了PI以外的諸如PC、PE、PA和PS等磷脂，以使PI留下。通過使本發明的磷脂加工劑作用于磷脂混合物，選擇性地從磷脂混合物中單獨留下PI，可以有效地獲得PI。可以預先使用均質器等使磷脂混合物分散在水中或者強制攪拌所述磷脂混合物來制備均一的水溶液。磷脂的濃度可以是任意濃度，只要PLB可以作用于分散在水中的磷脂混合物即可，并且所述濃度處于1%20%，優選為5%10%，尤其優選為6%8%的范圍。反應的pH可以是任意的pH，只要PLB可以作用于磷脂混合物即可，并且所述pH優選處于310，或者處于PLB活性達到最高時的約pH5.56.5。所述pH尤其優選為約pH6。優選使用緩沖劑來使反應保持在恒定的pH。緩沖劑的類型不受特別限制，只要其具有處于pH5.56.5范圍的緩沖能力即可。從食品用途的角度來看，優選使用乙酸鹽緩沖劑。此外，可以通過在反應中適當加入NaOH溶液，將反應溶液的pH調節在優選的范圍內。用作本發明的磷脂加工劑的PLB的濃度可以為1,000單位/千克磷脂100,000，000單位/千克磷脂，優選為2,000單位/千克磷脂5,000,000單位/千克磷脂。所用的PLB可以以水溶液的形式加入，或者可以為固定在不溶性載體如硅藻土(Celite)或離子交換樹脂上的形式。酶反應可以在任意溫度進行，只要PLB不失活即可。溫度上限優選為6(TC以下，更優選為45。C以下，并且溫度的下限優選為l(TC以上，更優選為3CTC以上。反應時間因酶反應條件而異，通常為1小時150小時。可以根據對底物殘留量的定性把握來終止反應。反應結束后，可以進行熱處理或pH處理等來使PLB失活，這是沒有任何問題的。硅膠薄層色譜(TLC)法是證實水解反應狀態的最簡單、最容易的方法。當使用TLC然后使用碘顯色法來定量證實底物殘留量時，可以在幾乎沒有看到TLC上有指示除了PI以外的任意磷脂的點時終止反應。在得自所述反應的產物中，游離脂肪酸、甘油磷酰膽堿(GPC)、甘油磷酰乙醇胺(GPE)、甘油磷脂酸(GP)和殘留的未反應的PI以混合物存在。采用諸如氯仿、乙醇、甲醇和己烷等有機溶劑可以從所述混合物中回收所述PI。從食品用途的角度來看，尤其優選使用乙醇、己垸或其混合溶劑。為了改善提取步驟中的液體分離，可以在提取之前改變反應的pH。游離脂肪酸和PI可溶于有機溶劑中。GPC和GPE等不溶于諸如己烷等有機溶劑中，但是可溶于水中。通過諸如真空濃縮等程序，從在有機溶劑層中回收的PI和游離脂肪酸中分離出所述有機溶劑。PI不溶于水溶性或水混合性的烷基羰基溶劑。游離脂肪酸可溶于任意所述溶劑。因此，PI可以作為沉淀回收。水溶性或水混和性烷基羰基溶劑可以是丙酮或甲基乙基酮等。優選的實例是丙酮。可以通過離心分離或者過濾方法的固體-液體分離程序來回收PI。磷脂混合物不受特別限制。可以使用來自雞蛋黃的磷脂、來自諸如鮭魚卵等魚卵的磷脂或者來自大豆的磷脂。從磷脂供應源的穩定性的角度來看，優選來自雞蛋黃的磷脂和來自大豆的磷脂，尤其優選來自大豆的磷脂。本發明的磷脂加工劑除了具有PLB活性之外，還可以具有強的脂酶活性。然而，對于由大豆磷脂制備PI和甘油磷酰膽堿而言，具有脂酶活性根本不是問題。大豆磷脂也可以作為與甘油三酸酯的混合物供應。當使用這樣的混合物作為原料時，可以同時水解甘油三酸酯和磷脂。在這一點上，同時具有脂酶活性和PLB活性是很重要的。當PLB活性高而脂酶活性低或者不具備脂酶活性時，可以添加額外的脂酶以同時分解甘油三酸酯和磷脂。根據本發明的上述方法，可以提供高純度的PI。PI的純度不受特別限制，只要PI具有高純度即可。然而，PI在總磷脂中的純度的下限優選為50摩爾％以上，更優選為60摩爾％以上，進一步優選為70摩爾％以上，尤其優選為80摩爾％以上，最優選為85摩爾％以上。高純度的PI可以用作功能性磷脂。由于PI包含分子中富含羥基的肌醇，因此與諸如PC和PE等其他磷脂相比，PI在水中顯示出良好的分散性或溶解性，例如PI具有極其不同于其他脂質組分的溶解性，因此，PI的優點在于其可以作為磷脂而廣泛用于各種用途中。(b)甘油磷酰膽堿(GPC)的制造作為本發明的磷脂加工劑的PLB在加工天然存在的磷脂的應用中是極其有用的。因此，本發明提供了一種有效地制造高純度GPC的方法。使本發明的磷脂加工劑作用于磷脂混合物的方法與制造上述PI的方法中的方法相同。反應時間通常可以為5小時20小時。反應可以在GPC在反應物中的濃度達到最大時加以終止，不過這取決于所用的酶濃度。可以向通過使本發明的磷脂加工劑作用于磷脂混合物而獲得的PLB的反應溶液中加入如上所述的相同的有機溶劑，例如氯仿、乙醇、甲醇或己烷。提取液體組分(包括游離脂肪酸)后剩下的水層含有GPC、GPE、GP或游離的酶。直接對含有GPC、GPE或GP的水溶液進行真空濃縮，由此獲得糖漿狀溶液。從除去著色劑組分和本發明的磷脂加工劑的角度來看，優選在濃縮之前用活性炭處理含有GPC、GPE或GP的水溶液。可以使用陽離子交換樹脂等以獲得高純度的GPC。在本發明的制造GPC的方法中使用的磷脂組合物不受特別限制，只要其具有高PC含量即可。可以使用來自雞蛋黃的磷脂、來自諸如鮭魚卵等魚卵的磷脂或者來自大豆的磷脂。從磷脂供應源的穩定性的角度來看，優選來自雞蛋黃的磷脂和來自大豆的磷脂。尤其優選的是來自大豆的磷脂。本發明的上述方法提供了高純度的GPC。GPC的純度不受特別限制，只要是高純度即可。GPC純度的下限優選為45重量％以上，更優選為50重量％以上。4、制造溶血磷脂酰肌醇的方法以下將描述制造溶血磷脂酰肌醇的方法。本發明的制造高純度的溶血磷脂酰肌醇的方法包括如下步驟步驟(l):使用具有磷脂酶Al活性或磷脂酶A2活性的酶對高純度PI進行水解反應的步驟；和步驟(2):通過使用含有一種或者兩種以上的溶劑的混合溶劑(其中游離脂肪酸溶解而溶血磷脂酰肌醇不能溶解)進行洗滌來除去游離脂肪酸，并將溶血磷脂酰肌醇與作為反應產物的游離脂肪酸分離以回收溶血磷脂酰肌醇的步驟。下文將進行詳細描述。在本發明的溶血磷脂酰肌醇的制造中使用的具有磷脂酶Al活性或者磷脂酶A2活性的酶不受特別限制，只要所述酶是作用于PI從而將PI轉化為溶血磷脂酰肌醇的酶即可。所述酶的實例包括包含在酶混合物(來自豬胰腺的胰酶)中的磷脂酶A2(由NovozymCo.，Ltd.制造的Lectitase或者由GenencorKyowaCo.,Ltd.制造的Lipomod699L);來自紫紅鏈霉菌0&e;tomyc&sWo/"ceoraZ7e。的憐月旨酶A2(由GenencorKyowaCo.，Ltd.帝lJ造的LizomaxPF);來自米曲霉(A^wg/〃wswjzae)的磷脂酶Al(由SankyoLifeTechCo.,Ltd.制造的PhospholipaseAl)等。其中，優選的實例是包含在酶混合物(來自豬胰腺的胰酶)中的磷脂酶A2(由NovozymCo.,Ltd.制造的Lectitase)和來自米曲霉的磷脂酶Al(由SankyoLifeTechCo.,Ltd.制造的PhospholipaseAl)。本發明的溶血磷脂酰肌醇制造中的酶反應可以采用在水性介質或者在潮濕條件下使酶和底物相互接觸的方式進行。反應的pH不受特別限制，只要所述pH處在能夠進行酶反應的范圍即可。例如，優選的pH范圍為pH6.59.0。反應溫度不受特別限制，只要所述溫度處在能夠進行酶反應的范圍即可。例如，所述溫度優選處在1(TC7(TC的范圍內，更優選處在30°C6(TC的范圍內。可以在反應達到所需狀態時終止反應，在所需狀態中，使用例如高效液相色譜分析、薄層色譜分析來跟蹤適合跟蹤反應的化合物的反應，例如PI的減少或者溶血磷脂酰肌醇的增加。所需狀態可以是例如反應終止狀態、穩定狀態或者制得足量的溶血磷脂酰肌醇的狀態，這可以根據工業生產的不同角度來確定。反應時間的實例可以是1小時至10天。反應中所用的酶量可以是足以使充分反應進行的量，但是從工業生產的角度來看，使用超過需要的量是沒有優勢的。例如，當使用1,000U/g的酶時，相對于底物，優選實例可以是0.05重量％50重量％。此外，可以加入鈣離子(氯化鈣)等作為酶穩定劑。另外，在終止酶反應后，可以采用常規方法來使酶失活。失活手段可以是熱處理(在50。C9(TC處理10分鐘至2小時)或pH處理(在pHl4或pH812處理10分鐘至2小時)等。另外，終止反應后或者使酶失活后，可以使用能夠溶解脂肪酸但不能溶解溶血磷脂酰肌醇的溶劑如丙酮進行洗滌來除去所生成的游離脂肪酸。5、制造甘油磷酰肌醇的方法下面將描述制造甘油磷酰肌醇的方法。本發明的制造高純度甘油磷酰肌醇的方法包括以下步驟步驟(l):使用具有磷脂酶B活性的酶對高純度PI進行水解反應的步驟；和步驟(2):將甘油磷酰肌醇與游離脂肪酸(反應產物)分離以回收甘油磷酰肌醇的步驟。下文將對所述方法進行詳細描述。在本發明的甘油磷酰肌醇制備中所用的具有磷脂酶B活性的酶不受特別限制，只要其能夠充分地作用于PI并將PI轉化成甘油磷酰肌醇即可。所述酶的實例包括來自青霉菌(/^m'"7/,'廳)屬和酵母等的酶。本發明的酶反應可以采用在水性介質或者在潮濕條件下使酶和底物相互接觸的方式進行。反應的pH不受特別限制，只要所述pH處在能夠進行酶反應的范圍即可。例如，優選的pH范圍為pH3.58.0。當使用來自點青霉(尸e剛'c/〃&w"oto似w)的磷脂酶B作為酶時，尤其優選約pH4.05.0。反應溫度不受特別限制，只要所述溫度處在能夠進行酶反應的范圍即可。例如，所述溫度優選處在10。C7(TC的范圍內，更優選處在30°C6(TC的范圍內。可以在反應達到所需狀態時加以終止反應，在所需狀態中，使用例如高效液相色譜分析、薄層色譜分析來跟蹤適合跟蹤反應的化合物反應，例如PI的減少或者甘油磷酰肌醇的增加。所需狀態可以是例如反應終止狀態、穩定狀態或者制得足量的甘油磷酰肌醇的狀態，這可以根據工業生產的不同角度來確定。反應時間的實例可以是1小時至10天。反應中所用的酶量可以是足以使反應充分進行的量，但是從工業生產的角度來看，使用超過需要的量是沒有優勢的。例如，當使用3,800U/g的酶時，相對于底物，優選實例可以是0.05重量％5重量％。此外，可以加入鈣離子(氯化鈣等)作為酶穩定劑。另外，在終止酶反應后，可以采用常規方法來使酶失活。失活手段可以是熱處理(在5(TC9(TC處理10分鐘至2小時)或pH處理(在pH14或pH812處理10分鐘至2小時)等。另外，終止反應后或者使酶失活后，可以使用諸如己烷等溶劑提取除去所生成的游離脂肪酸，然后真空濃縮水層，再以含有高濃度甘油磷酰肌醇的水溶液形式保存或者作為凍干粉末保存。作為選擇，可以直接將水層中的甘油磷酰肌醇吸附在離子交換樹脂等中然后進行洗滌。此后，使用具有各種pH的高濃度鹽溶液進一步提純游離脂肪酸。另外，如果需要，可以將任何的著色組分吸附到活性炭上以進行脫色。6、高純度PI和高純度GPC的應用通過本發明的制造PI的方法獲得的PI使用了能夠充分水解PI的來自點青霉或D/c(yofe/Zwmtfeco^oww的PLB，然后可以用作高純度甘油磷酰肌醇制備中的原料。此外，通過本發明的制造GPC的方法獲得的GPC可以用作在通過采用脂肪酸或脂肪酸酯的GPC的化學合成或酶法酯合成來制造高純度的含有脂肪酸的膽堿磷脂(即，功能性磷脂)時的原料。7、含有磷脂酰肌醇(PI)、甘油磷酰膽堿(GPC)、溶血磷脂酰肌醇或甘油磷酰肌醇的食品、藥品或化妝品食品和藥品中的PI、GPC、溶血磷脂酰肌醇和甘油磷酰肌醇的含量不受特別限制。這些物質中的每一種的含量可以優選對應于1mg/天10,000mg/天，優選為10mg/天5,000mg/天，更優選為30mg/天1，000mg/天的PI、GPC、溶血磷脂酰肌醇或甘油磷酰肌醇的攝入量。含有本發明的PI、GPC、溶血磷脂酰肌醇或甘油磷酰肌醇的食品不受限制，只要它們含有任意的所述組分即可。所述食品的實例包括增補劑(例如，散在、顆粒劑、軟膠囊、硬膠囊、片劑、咀嚼片劑、快速崩解劑、糖漿、溶液等)、飲料(例如，茶、碳酸飲料、乳酸飲料和運動飲料等)、糖果點心(例如，膠皮糖(gummy)、果凍、口香糖、巧克力、小甜餅和蜜餞等)、油、油/油脂食品(例如，蛋黃醬、調味品、黃油、奶油和人造黃油等)、番茄醬、沙司、流食、乳品(例如，牛奶、酸奶和奶酪等)、面包、面條(例如，烏冬面、蕎麥面、拉面、意大利面、炒面、扁條面(kisimen)、素面(soumen)、涼面(hiyamugi)和米粉等)、湯(例如，味噌湯、玉米湯和清燉肉湯等)和用于撒在米飯上的干燥佐料等。如果需要，含有本發明的PI、GPC、溶血磷脂酰肌醇或甘油磷酰肌醇的食品中可以加入任意的各種營養物、各種維生素類(例如，維生素A、維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素B12、維生素C、維生素D、維生素E和維生素K)、各種礦物質(例如，鎂、鋅、鐵、鈉、鉀、硒、氧化鈦)、食用纖維、各種糖類(例如，纖維素、糊精和幾丁質)、各種多不飽和脂肪酸(例如，花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳五烯酸)、各種共軛脂肪酸(例如，共軛亞油酸、共軛亞麻酸、共軛花生四烯酸、共軛DHA、共軛EPA和共軛DPA)、各種磷脂(例如，卵磷脂、PA、PS、PE、磷脂酰甘油、PC和磷脂酰DHA)、各種糖脂(例如，腦苷脂)、各種類胡蘿卜素(例如，卩-胡蘿卜素、番茄紅素、蝦青素、(3-隱黃素、辣椒質、黃體素和玉米黃質)、各種類黃酮(例如，槲皮酮、毛地黃黃酮素和異黃酮)、各種氨基酸(例如，甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸)、其他各種營養物(例如，氧化形式的輔酶QIO、還原形式的輔酶QIO、肉堿、芝麻素、a-硫辛酸、肌醇、D-手性肌醇、松醇、牛磺酸、葡糖胺、硫酸軟骨素、S-腺苷甲硫氨酸、姜黃素、Y-阿魏酸脂、谷胱甘肽、Y-氨基丁酸、脫氧腎上腺素、吡咯并喹啉醌、兒茶素和辣椒素)、各種分散劑、穩定劑(如各種乳化劑)、各種甜味劑(例如，山梨糖醇和蔗糖)、各種調味組分(例如，檸檬酸和蘋果酸)、調料、王漿、蜂蜜、蜂蠟、蜂膠、落葉松蕈、人參和黑胡椒提取物(bioperine)等。另外，可以加入諸如薄荷、香檸檬、甘菊和薰衣草等任意草藥。另外，可以混合諸如羊芾甙(teanin)、脫氫表雄甾酮和褪黑激素等任意物質。含有本發明的PI、GPC、溶血磷脂酰肌醇或甘油磷酰肌醇的藥品不受限制，只要其含有任意的這些組分即可。藥品的制劑包括散在、顆粒劑、丸劑、軟膠囊、硬膠囊、片劑、咀嚼片劑、快速崩解劑、糖漿、溶液、懸浮劑、栓劑、軟膏、乳膏、凝膠、膠漿劑、吸入劑和注射劑等。這些制劑可以根據常規方法制備。然而，由于PI不溶于水，因此可以將其溶解在諸如植物油和動物油等任意的非親水性溶劑中。作為選擇，可以使用均質器(高壓均質器)將PI和乳化劑(一種分散劑)或表面活性劑一起分散或乳化在水溶液中。另外，為了提高PI的吸附性，可以在將PI粉碎至平均粒系為約1微米后，在存在或不存在賦形劑(例如阿拉伯樹膠、糊精或酪蛋白等)的情況下使用PI。可以在配制時使用的添加劑包括例如大豆油、紅花油、橄欖油、胚芽油、向日葵油、牛脂、動物油如沙丁魚油；多元醇如聚乙二醇、丙二醇、甘油和山梨糖醇；表面活性劑如山梨聚糖脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、甘油的脂肪酸酯和聚脂肪酸甘油酯；諸如純凈水、乳糖、淀粉、微晶纖維素、D-甘露糖、麥芽糖、卵磷脂、阿拉伯樹膠、糊精、山梨糖醇溶液和糖類溶液等賦形劑；甜味劑；著色劑；pH調節劑；和調味劑。此外，液體制劑在給藥時可以采用溶解或懸浮在水中或者任意的其他適當介質中的形式。另外，可以釆用熟知的方法涂覆片劑或顆粒劑。當以注射劑的形式施用時，優選以靜脈內、腹膜內、肌肉內、皮下、經皮、關節內、滑膜內、肺泡內、骨膜內、舌下或口腔內施用。其中，尤其優選的是靜脈內施用或腹膜內施用。靜脈內施用可以是滴注和滲透施用(porousadministration)中的任意——禾中。含有本發明的PI、GPC、溶血磷脂酰肌醇或甘油磷酰肌醇的化妝品包括乳膏、乳狀洗劑、洗液、微乳精、敷糊劑和痱子粉等。還可以混入芳香劑等。下面將參考實施例來描述本發明，但是本發明并不限于以下的實施例。實施例實施例1制造PLB的方法向裝有20升無菌培養基的30升體積的發酵罐中無菌接種上100ml在相同培養基中預溫育(28。C溫育4天)的柱狀假絲酵母株ATCC14830的培養液，所述無菌培養基含有3%脫脂棉籽粉、0.3%食鹽、0.2%磷酸氫二鉀、0.2%磷酸鉀、0.1%硫酸鎂和0.3%消泡劑。在以300rpm攪拌的同時，在28'C進行溫育并用無菌空氣進行通風(20升/分鐘)。在50小時后證實PLB己經達到最大活性(0.2U/ml)。以5,000rpm對所得培養液離心IO分鐘，得到16升的上清液。通過超濾濃縮上清液。以5,000rpm對通過向3升的所得濃縮物中加入9升冷凍丙酮形成的沉降物離心IO分鐘以收集沉淀，然后將所述沉淀溶解在2升含有2M氯化鈉的10mMTris鹽酸緩沖液(下文簡稱為Tris-HCl)(pH7.5)中。通過離心除去不溶性物質，然后使之通過預先用辛基瓊脂糖填充的柱子(柱床體積；300ml)來吸附PLB。然后，用含有2M氯化鈉的10mMTris-HCl(pH7.5)和10mMTris-HCl(pH7.5)洗滌柱子。用含有2%AdecatolSO120的10mMTris-HCl(pH7.5)洗脫吸附在柱子上的PLB(用疏水色譜法提純)。然后，使洗脫液(l升)通過預先用10mMTris-HCl(pH7.5)平衡的DEAE-瓊脂糖柱子(柱床體積；200ml)以吸附PLB。使用上述緩沖液洗滌柱子，然后用濃度梯度為00.3M的氯化鈉洗脫酶。在約0.1M氯化鈉處獲得PLB酶級分A，在約0.25M氯化鈉處獲得PLB酶級分B(采用離子交換色譜分離提純)。采用氨基酸測序儀測定酶級分A和酶級分B的N末端氨基酸序列。作為結果，酶級分A的氨基酸序列為SEQIDNo.l序列，而酶級分B的氨基酸序列為SEQIDNo.2序列。另外，使用GENETEXWIN5.2(由SoftwareCo.,Ltd.制造)進行同源性分析，以分析酶級分B相對于酶級分A的同源性，結果為88.5%。實施例2測定PLB活性的方法PLB的酶活性可以通過實施測定由磷脂酰膽堿生成的GPC的酶法來檢測。即，在37"C將0.5ml的反應溶液預熱2分鐘至3分鐘，所述反應溶液由溶解在0.5ml的含有3%TritonX-100的1MMES-NaOH緩沖液(下文簡稱為MES-NaOH)(pH6)中的以下物質組成0.05ml的10mM蛋黃磷脂酰膽堿、0.025ml的1M氯化鈣、0.05ml的0.2%TODB、0.05ml的0.2%4-氨基安替吡啉、0.1ml的50U/ml甘油一酸酯脂酶、0.1ml的300U/m甘油磷酸氧化酶、0.025ml的6U/mlGPC磷酸二酯酶和0.05ml的100U/ml過氧化物酶。隨后，使用含有0.05。/。BSA的lOmMTris-HCl(pH7.5)稀釋反應溶液，然后向反應溶液中加入25pi的PLB溶液(0.03U/ml0.15U/ml)，用相同的稀釋緩沖液將其稀釋以引發反應。在剛過10分鐘后，加入1ml的0.5%SDS終止反應，然后測定其在550nm處的吸光度。需要注意的是，將每分鐘釋放出1毫摩爾的GPC的活性定義為一個單位。實施例3測定脂酶活性的方法通過使用甘油一酸酯脂酶將使用甘油二酸酯作為底物生成的甘油一酸酯轉化為夕VPiryy，然后通過利用酶法測定來進行脂酶活性測定。即，向0.5ml的反應溶液中加入25|al的以含有0.05%BSA的10mMTris-HCl稀釋的酶溶液(0.03U/ml0.15U/ml)，然后在37"C進行10分鐘的反應，所述反應溶液由溶解在0.1ml的含有3%TritonX-100的1MMES-NaOH(pH6.0)中的以下物質組成0.05ml的10mM1,2甘油二酸酯、0.025ml的0.5M氯化f丐、0.025ml的0.05M氯化鎂、0.05ml的0.05MATP、0.05ml的10U/ml甘油一酸酯脂酶、0.05ml的5U/ml甘油激酶、0.25ml的400U/ml甘油磷酸氧化酶、0.025ml的100U/ml的過氧化物酶、0.025ml的0.3%TOOS和0.025ml的0.3%4-氨基安替吡啉。之后，使用0.5%SDS終止反應，然后測定其在550nm處的吸光度。需要注意的是，將每分鐘釋放出1毫摩爾的甘油的活性定義為一個單位的脂酶活性。實施例4通過PLB級分A的凝膠過濾色譜法進行的提純通過離心超濾裝置濃縮由實施例1獲得的PLB活性酶級分A。之后，對濃縮溶液進行凝膠過濾色譜法(SuperDex75)(預先用含有0.5M氯化鈉的10mMTris-HCl(pH7.5)平衡)，然后以0.5ml/分鐘的流速分離，由此獲得活性級分。在各級分中，通過如實施例2和3所述方法獲得PLB活性和脂酶活性。使用280nm處的吸光度來測定蛋白質濃度。各級分的PLB活性、脂酶活性和蛋白質濃度的結果如圖1所示。結果，其中在280nm處測定的蛋白質濃度、脂酶活性和PLB活性的洗脫模式相互吻合。發現具有脂酶活性和PLB活性的蛋白是同一種酶蛋白。實施例5PLB性質5-l(反應的最佳pH)在實施例2所示的反應溶液的組成中，使用乙酸鹽緩沖液(下文簡稱為Acetate)、PIPES-NaOH緩沖液(下文簡稱為PIPES-NaOH)或MES-NaOH測定酶級分A在各種pH下的酶活性。獲得了酶級分A在各緩沖液中相對于使用MES-NaOHpH6.0獲得的活性的相對活性。結果如圖2所示。如圖2所示，MES-NaOH在約pH6顯示最大的酶活性。此外，還預計PIPES-NaOH和Acetate也在約pH6顯示最大的酶活性。5-2(pH穩定性)將酶級分A溶解使得其在10mM的Acetate、MES-NaOH、Tris-HCl或Bicine-NaOH緩沖液(下文簡稱為Bicine-NaOH)中的每一種緩沖液中為5U/ml，然后在37。C靜置90分鐘。之后，根據實施例2的方法測定PLB活性，接著測定各pH下相對于在Acetate(pH5)中的活性的相對殘余活性。結果如圖3所示。如圖3所示，發現在pH5pH8的很寬范圍內具有pH穩定性。5-3(熱穩定性)將酶級分A溶解使得其在10mM的MES-NaOH(pH6.0)中為5U/ml，然后采用實施例2中所示的方法，在07(TC的溫度范圍內加熱10分鐘后，進行PLB活性測定。結果如圖4所示。當將凍藏保存的酶級分A的PLB活性定義為100%時，以至多55"C的溫度處理的相對殘留活性為90%以上。由此發現酶級分A是熱穩定性酶。5-4(底物特異性)通過如實施例2所述的測定PLB活性的方法，測定作為通過實施例1的離子交換色譜法獲得的兩種不同的磷脂加工劑的各PLB(酶級分A和酶級分B)的、關于相應磷脂相對于PC的活性。換言之，與實施例2中所示的卵磷脂的反應組合物不同的是，在活性測定中使用PE、PI或PA來測定相對于PC的相對活性。結果如表1所示。作為結果，酶級分A和酶級分B同時顯示出較小的相對于PC的相對活性(與其他磷脂相比)。發現本發明的磷脂加工劑具有底物特異性，使得對PI的活性小于對任何其他磷脂的活性。表l的結果顯示，各級分具有PLB活性，因此所述磷脂加工劑可以是兩種級分的組合。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>5-5(分子量)對通過實施例1所述方法獲得的經提純的酶級分A進行SDS-聚丙烯酰胺電泳，得到單一條帶。參照分子量已知的作為標記的蛋白，所述產物的分子量為53千道爾頓。5-6(等電點)采用使用兩性電介質載體(CarrierAmpholyte)通過形成pH梯度來進行的等電電泳法，對通過實施例1所述方法獲得的經提純的酶級分A進行酶級分A的等電點測定。另外，采用280nm處的吸光度對經提純的酶級分A進行蛋白質濃度測定。酶級分A的等電點和酶濃度之間的關系如圖5所示。作為結果，采用2S0nm處的吸光度測定的所述蛋白質的pH與脂酶活性和PLB活性完全吻合，并且所述pH值(等電點)為4.21。從圖5可以明顯看出，所述蛋白質顯示出與PLB和脂酶相同的峰，由此看出PLB和脂酶為相同的酶蛋白。實施例6PI的定量測試向0.5ml的染色液加入0.02ml的PI溶液，由此在37。C進行10分鐘的反應，所述染色液含有0.1ml的1MTris-HCl(pH8)、0.05ml的10mMNAD、0.05ml的10mM氯化鎂、0.05ml的2%TritonX-IOO、0.05ml的50U/mlPI特異性磷酸脂酶C、0.05ml的50U/ml堿性磷酸酶、0.05ml的50U/ml肌醇脫氫酶、0.05ml的5。/。氮藍四唑和0.15ml的純凈水，所述PI溶液通過將含有PI的測試樣品(lmg/ml3mg/ml)溶解在2%TritonX-100而制得。使用0.5ml的0.5。/。SDS終止反應，然后測定550nm處的吸光度。用已知濃度的肌醇水溶液校準，然后定量分析PI的量。實施例7GPC的定量分析向0.5ml的反應溶液中加入25pi含有GPC的樣品(0.3mg/ml0.9mg/ml)，所述反應溶液含有0.1ml的1MTris-HCl(pH7.5)、0.025ml的1M氯化鈣、0.05ml的0.2%TODB、0.05ml的0.2%4-氨基安替吡啉、0.025ml的6U/ml甘油磷酰膽堿磷酸二酯酶、0.05ml的100U/ml過氧化物酶、0.05ml的200U/ml膽堿氧化酶和0.15ml的純凈水。在37匸反應10分鐘后，將0.5ml的0.5。/。SDS加入到反應溶液中，然后測定550nm處的吸光度。將已知濃度的膽堿水溶液用于校準，然后定量分析GPC。實施例8制造PI的方法在攪拌的同時，將40g來自大豆的磷脂懸浮在400ml的10mMAcetate(pH5.8)中，然后加入1，400單位的作為本發明的磷脂加工劑的PLB(實施例1中獲得的酶級分A)從而在45。C引發反應。20小時后，終止反應，然后加入200ml的乙醇和400ml的己垸，接著攪拌1小時。通過離心分離，將己烷層和水層彼此分離，由此回收有機溶劑層。在減壓下濃縮所回收的有機溶劑，然后向濃縮液中加入150ml的丙酮。收集并干燥所得沉淀，由此獲得含有高純度PI的粉末(8.2g)。根據StandardOilandFatAnalyticalTestMethod(由JAPANOilChemists'Society確立，1996)，測定所得磷脂的純度。結果，相對于總磷脂的純度為86.8摩爾％。實施例9制造GPC的方法GPC、GPE和GP包含在通過對實施例8所述方法中的PLB反應物進行有機溶劑提取獲得的水層中。使380ml的水層通過填充有活性炭的柱子(柱床體積50ml)，由此獲得無色的通過液體。在減壓下濃縮所述液體，由此獲得40ml的GPC溶液。根據實施例2中所述的GPC分析，GPC的純度為55重量％。實施例10制造溶血磷脂酰肌醇的方法向10g在實施例8中獲得的PI中加入20ml的水，然后充分攪拌，接著加入100mg由SankyoLifeTechCo.,Ltd.制造的磷脂酶Al(11,900U/g)。然后在攪拌的同時于5(TC進行酶反應。從反應開始24小時后，在80"C處理反應溶液30分鐘，由此終止反應。干燥反應溶液，加入100ml丙酮并充分攪拌，隨后經過濾得到固體。然后干燥所述固體，由此得到6g溶血磷脂酰肌醇。根據TLC分析的結果，證實未反應的PI和作為反應副產物的游離脂肪酸已被除去。TLC載體SilicaGel60，層厚度為2mm(由MerckCo.,Ltd.制造)，展開劑氯仿甲醇水=65:35:4，染色方法碘染色，Rf值溶血磷脂酰肌醇(0.12)、PI(0.28)、游離脂肪酸(0.81)。實施例ll由點青霉制造磷脂酶B的方法基于已知方法，由點青霉如下制備磷脂酶B。將100ml預溫育在錐形培養瓶(體積為500ml)中的點青霉(IFO-4640)轉移到20升經高壓滅菌器滅菌的培養液(3.5%玉米漿、5.5%乳糖、0.7%磷酸鉀、0.3%硫酸鎂、0.5%碳酸鈣和0.25%大豆油，pH5.4)中，然后在有氧條件下于26。C溫育4天。終止溫育后，通過過濾獲得菌體。向所述菌體中加入10升純凈水，然后用均質器均化10分鐘，以獲得溶解化的酶，隨后進行過濾。結果獲得8升粗制的酶溶液。使所述濾液通過填充有2kg棕櫚酰化的纖維素纖維的柱子以吸附酶，然后用純凈水洗滌柱子，接著用含有0.5%AdecatolSO120和0.2mMEDTA的1mM磷酸緩沖液(pH7.0)將酶洗脫。將洗脫液(IO升)裝載到Q-Sepharose離子交換柱中，由此吸附酶。用含有0.2mMEDTA的1mM磷酸緩沖液(pH7.0)洗滌柱子，然后用含有0.2MNaCl和2mMEDTA的10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)將酶洗脫。之后，用含有2mM-EDTA的10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)對酶進行透析，然后進行脫鹽和凍干，由此獲得酶粉末(3800U/g)。實施例12制造甘油磷酰肌醇的方法向10g在實施例8中獲得的PI中加入100ml的2mMAcetate(pH4.0)，然后充分攪拌，接著加入200mg如實施例11所述由點青霉獲得的磷脂酶B，從而在攪拌的同時于4(TC進行酶反應。從反應開始24小時后，在8(TC處理30分鐘以終止反應。向反應溶液中加入50ml的己烷，然后攪拌，接著靜置以除去己烷層。然后，回收水層。使水槽通過預先填充有活性炭的柱子，然后收集通過的液體，接著進行凍干。結果獲得8g甘油磷酰肌醇。食品制備例1含有磷脂酰肌醇(PI)的人造黃油將實施例8中獲得的PI加到植物油中，使之成為5重量％的人造黃油，然后用乳化器等攪拌均勻。通過常規方法制備人造黃油。食品制備例2含有磷脂酰肌醇(PI)的面包將lg在實施例8中獲得的PI、15g糖、2g食鹽和5g含脂肪的奶粉溶解在70g熱水中，然后加入兩個雞蛋并充分混合。將所述混合物加入130g小麥面粉與2g干酵母的混合物中，接著用手揉捏。將約30g黃油加入到所述混合物中，并進一步揉捏所述混合物，然后制得30個用于面包巻的球形面團。之后，在發酵后用打碎的雞蛋涂覆面團的表面。將面團在18(TC的烤箱中烘烤15分鐘，由此獲得面包巻。食品制備例3含有磷脂酰肌醇(PI)的烏冬面(日本小麥面條)相對于400g小麥面粉，將2g在實施例8中獲得的PI加入到200g水以及20g食鹽中，接著進行揉捏并讓所述混合物靜置足夠的時間。然后，抻拉面團并將其切成約6mm寬的小片，由此得到烏冬面。食品制備例4含有磷脂酰肌醇(PI)的飲料將30g在實施例8中得到的PI懸浮在5倍體積的橄欖油中，然后加熱至50'C，由此得到油相。將10g作為乳化劑的甘油脂肪酸酯加入到90g甘油中，然后加熱至7(TC并溶解。在攪拌的同時，向所述溶液逐漸加入上述油相。使用乳化裝置在高壓下乳化所述混合物而獲得經乳化的組合物。然后，將180ml水加入到20g經乳化的組合物中并攪拌，由此得到含有PI的飲料。制劑例1含有磷脂酰肌醇(PI)的片劑在實施例8中得到的PI120g微晶纖維素330g羧甲基纖維素鈣15g羥丙基纖維素10g純凈水60ml采用常規方法混合上述組合物，然后干燥，接著加入10g硬脂酸鎂。將所述混合物制成片劑，由此得到100mg片劑，每片劑含有20mg量的PI。制劑例2含有磷脂酰肌醇(PI)的軟膠囊將在實施例8中得到的PI懸浮在5倍體積的橄欖油中，然后充分混合均勻。然后，利用膠囊填充器以所述混合物填充膠囊，得到含量為300mg的膠囊。化妝品制備例含有磷脂酰肌醇(PI)的藥用乳膏(化妝品)將在實施例8中得到的PI加入到白凡士林中使得其量為10重量％，然后和芳香族化合物等一起攪拌均勻。通過常規方法制得藥用乳膏。食品制備例5含有溶血磷脂酰肌醇的人造黃油將在實施例10中獲得的溶血磷脂酰肌醇加入到植物油中，使之成為5重量％的人造黃油，然后用乳化器等攪拌均勻。通過常規方法制得人造黃油。食品制備例6含有溶血磷脂酰肌醇的面包將1g在實施例10中獲得的溶血磷脂酰肌醇、15g糖、2g食鹽和5g含有脂肪的奶粉溶解在70g熱水中，然后加入兩個雞蛋并充分混合。將所述混合物加入130g小麥面粉與2g干酵母的混合物中，接著用手揉捏。將約30g黃油加入到所述混合物中，并進一步揉捏所述混合物，然后制得30個用于面包巻的球形面團。之后，在發酵后用打碎的雞蛋涂覆面團的表面。將面團在18(TC的烤箱中烘烤15分鐘，由此獲得面包巻。食品制備例7含有溶血磷脂酰肌醇的烏冬面(日本小麥面條)相對于400g小麥面粉，將2g在實施例10中獲得的溶血磷脂酰肌醇加入到200g水以及20g食鹽中，接著進行揉捏，然后讓所述混合物靜置足夠的時間。然后，抻拉面團并將其切成約6mm寬的小片，由此得到烏冬面。食品制備例8含有溶血磷脂酰肌醇的飲料將30g在實施例10中得到的溶血磷脂酰肌醇懸浮在5倍體積的橄欖油中，然后加熱至5(TC，由此得到油相。將10g作為乳化劑的甘油脂肪酸酯加入到90g甘油中，然后加熱至70。C并溶解。在攪拌的同時，向所述溶液逐漸加入上述油相。使用乳化裝置在高壓下乳化所述混合物而獲得經乳化的組合物。然后，將180ml水加入到20g經乳化的組合物中并攪拌，由此得到含有溶血磷脂酰肌醇的飲料。制劑例3含有溶血磷脂酰肌醇的片劑在實施例10中得到的溶血磷脂酰肌醇120g微晶纖維素330g羧甲基纖維素鈣15g羥丙基纖維素10g純凈水60ml采用常規方法混合上述組合物，然后干燥，接著加入10g硬脂酸鎂。將所述混合物制成片劑，由此得到100mg片齊lJ，每片劑含有20mg量的溶血磷脂酰肌醇。制劑例4含有溶血磷脂酰肌醇的軟膠囊將在實施例10中得到的溶血磷脂酰肌醇懸浮在5倍體積的橄欖油中，然后充分混合均勻。然后，利用膠囊填充器以所述混合物填充膠囊，得到含量為300mg的膠囊。化妝品制備例含有溶血磷脂酰肌醇的乳膏(化妝品)將在實施例10中得到的溶血磷脂酰肌醇加入到白凡士林中使得其量為10重量％，然后和芳香族化合物等一起攪拌均勻。通過常規方法制得乳膏。食品制備例9含有甘油磷酰肌醇的人造黃油將實施例12中獲得的甘油磷酰肌醇加到植物油中，使之成為5重量％的人造黃油，然后用乳化器等攪拌均勻。通過常規方法制備人造黃油。食品制備例10含有甘油磷酰肌醇的面包將1g在實施例12中獲得的甘油磷酰肌醇、15g糖、2g食鹽和5g含脂肪的奶粉溶解在70g熱水中，然后加入兩個雞蛋并充分混合。將所述混合物加入130g小麥面粉與2g干酵母的混合物中，接著用手揉捏。將約30g黃油加入到所述混合物中，并進一步揉捏所述混合物，然后制得30個用于面包巻的球形面團。之后，在發酵后用打碎的雞蛋涂覆面團的表面。將面團在18(TC的烤箱中烘烤15分鐘，由此獲得面包巻。食品制備例11含有甘油磷酰肌醇的烏冬面(日本小麥面條)相對于400g小麥面粉，將2g在實施例12中獲得的甘油磷酰肌醇加入到200g水以及20g食鹽中，接著進行揉捏，然后讓所述混合物靜置足夠的時間。然后，抻拉面團并將其切成約6mm寬的小片，由此得到烏冬面。食品制備例12含有甘油磷酰肌醇的飲料將30g在實施例12中得到的甘油磷酰肌醇懸浮在5倍體積的橄欖油中，然后加熱至5(TC，由此得到油相。將10g作為乳化劑的甘油脂肪酸酯加入到90g甘油中，然后加熱至7(TC并溶解。在攪拌的同時，向所述溶液逐漸加入上述油相。使用乳化裝置在高壓下乳化所述混合物而獲得經乳化的組合物。然后，將180ml水加入到20g經乳化的組合物中并攪拌，由此得到含有甘油磷酰肌醇的飲料。制劑例5含有甘油磷酰肌醇的片劑在實施例12中得到的甘油磷酰肌醇120g微晶纖維素330g羧甲基纖維素鈣15g羥丙基纖維素10g純凈水60ml采用常規方法混合上述組合物，然后干燥，接著加入10g硬脂酸鎂。將所述混合物制成片劑，由此得到100mg片劑，每片劑含有20mg量的甘油磷酰肌醇。制劑例6含有甘油磷酰肌醇的軟膠囊將在實施例12中得到的甘油磷酰肌醇懸浮在5倍體積的橄欖油中，然后充分混合均勻。然后，利用膠囊填充器以所述混合物填充膠囊，得到含量為300mg的膠囊。化妝品制備例含有甘油磷酰肌醇的乳膏(化妝品)將在實施例12中得到的甘油磷酰肌醇加入到白凡士林中使得其量為10重量％，然后和芳香族化合物等一起攪拌均勻。通過常規方法制得乳膏。工業實用性本發明的磷脂加工劑適合用于使用來自大豆的磷脂作為原料的功能性磷脂的制造。權利要求1.一種磷脂加工劑，所述磷脂加工劑含有來自假絲酵母屬(Candida)且具有磷脂酶B(PLB)活性的酶。2、一種磷脂加工劑，所述磷脂加工劑含有具有磷脂酶B(PLB)活性的酶，所述酶基本上僅僅不分解磷脂混合物中的磷脂酰肌醇。3、如權利要求1或2所述的磷脂加工劑，其中，具有磷脂酶B(PLB)活性的酶還具有脂酶活性。4、如權利要求13任一項所述的磷脂加工劑，其中，具有磷脂酶B活性的酶具有下述的物理化學性質(1)作用將磷脂水解成2摩爾比的游離脂肪酸和等摩爾比的甘油磷酰膽堿的作用；(2)分子量53,000±3,000(根據SDS電泳法測定)；(3)等電點pH4.21±0.2;(4)最佳pH:約pH5.56.5;(5)pH穩定性約pH59(37。C處理90分鐘)；(6)穩定性55。C(在pH5處理IO分鐘)；禾口(7)底物特異性對磷脂酰肌醇的活性比為對磷脂酰膽堿的活性比的10%以下。5、一種磷脂加工劑，所述磷脂加工劑含有由柱狀假絲酵母(Candidacylindracea)的培養液得到的酶。6、一種磷脂加工劑，所述磷脂加工劑通過以下步驟得到(1)培養柱狀假絲酵母；(2)濃縮所述柱狀假絲酵母的培養液；(3)用有機溶劑使酶沉淀；(4)用疏水色譜法對步驟(3)得到的粗制酶溶液進行提純；和(5)用離子交換色譜法對步驟(4)得到的酶進行分離和提純。7、一種磷脂加工劑，所述磷脂加工劑含有選自以下酶中的至少一種酶具有SEQIDNo.1的氨基酸序列的酶；與SEQIDNo.1的氨基酸序列的同源性為75。/。以上且具有磷脂酶B活性的酶；具有SEQIDNo.1的氨基酸序列中缺失、置換或增加了一個或多個氨基酸的氨基酸序列且具有磷脂酶B活性的酶。8、一種磷脂加工劑，所述磷脂加工劑含有選自以下酶中的至少一種酶具有SEQIDNo.2的氨基酸序列的酶；與SEQIDNo.2的氨基酸序列的同源性為75。/。以上且具有磷脂酶B活性的酶；具有SEQIDNo.2的氨基酸序列中缺失、置換或增加了一個或多個氨基酸的氨基酸序列且具有磷脂酶B活性的酶。9、一種制造磷脂酰肌醇和甘油磷酰膽堿的方法，所述方法包括使權利要求18任一項所述的磷脂加工劑作用于磷脂混合物。10、一種制造磷脂酰肌醇的方法，所述方法包括使權利要求18任一項所述的磷脂加工劑作用于磷脂混合物。11、一種制造磷脂酰肌醇的方法，所述方法包括以下步驟(1)使權利要求18任一項所述的磷脂加工劑作用于磷脂混合物；(2)使用有機溶劑提取磷脂酰肌醇；和(3)通過水溶性或水混和性烷基羰基垸基溶劑處理，沉淀并回收磷脂酰肌醇。12、如權利要求911任一項所述的制造磷脂酰肌醇的方法，其中，所述磷脂混合物來自大豆。13、一種磷脂酰肌醇，所述磷脂酰肌醇是通過權利要求1012任一項所述的制造方法得到的，其中，所述磷脂酰肌醇在總磷脂中的純度為50摩爾％以上。14、一種制造甘油磷酰膽堿的方法，所述方法包括使權利要求18任一項所述的磷脂加工劑作用于磷脂混合物。15、一種制造甘油磷酰膽堿的方法，所述方法包括以下步驟(1)使權利要求18任一項所述的磷脂加工劑作用于磷脂混合物；(2)用含有有機溶劑的溶劑提取并除去脂質組分，并且將甘油磷酰膽堿收集到水層中；和(3)將步驟(1)中發揮作用的磷脂加工劑吸附在活性炭上，并除去所述磷脂加工劑。16、如權利要求9、14或15所述的制造甘油磷酰膽堿的方法，其中，所述磷脂混合物來自大豆。17、一種甘油磷酰膽堿，所述甘油磷酰膽堿是通過權利要求1416任一項所述的制造方法得到的，并具有55重量％以上的甘油磷酰膽堿純度。18、權利要求13所述的磷脂酰肌醇在制備高純度甘油磷酸肌醇中的應用。19、權利要求17所述的甘油磷酰膽堿在制備高純度膽堿磷脂中的應用。20、含有通過權利要求1012任一項所述的制造方法制造的磷脂酰肌醇的食品、藥品或化妝品。21、含有通過權利要求1416任一項所述的制造方法制造的甘油磷酰膽堿的食品、藥品或化妝品。22、一種溶血磷脂酰肌醇，所述溶血磷脂酰肌醇是通過使具有磷脂酶Al或磷脂酶A2活性的酶作用于通過權利要求1012任一項所述的制造方法制造的磷脂酰肌醇而得到的。23、一種制造溶血磷脂酰肌醇的方法，所述方法包括使具有磷脂酶Al或磷脂酶A2活性的酶作用于通過權利要求1012任一項所述的制造方法制造的磷脂酰肌醇。24、含有通過權利要求23所述的制造方法制造的溶血磷脂酰肌醇的食品、藥品或化妝品。25、一種甘油磷酰肌醇，所述甘油磷酰肌醇是通過使對磷脂酰肌醇具有充分作用的具有磷脂酶B活性的酶作用于通過權利要求1012任一項所述的制造方法制造的磷脂酰肌醇而得到的。26、一種制造甘油磷酰肌醇的方法，所述方法包括使對磷脂酰肌醇具有充分作用的具有磷脂酶B活性的酶作用于通過權利要求1012任一項所述的制造方法制造的磷脂酰肌醇。27、含有通過權利要求26所述的制造方法制造的甘油磷酰肌醇的食品、藥品或化妝品。28、一種食品、藥品或化妝品，所述食品、藥品或化妝品含有選自以下物質組成的組中的兩種以上物質通過權利要求1012任一項所述的制造方法制造的磷脂酰肌醇；通過權利要求1416任一項所述的制造方法制造的甘油磷酰膽堿；通過權利要求23所述的制造方法制造的溶血磷脂酰肌醇；和通過權利要求26所述的制造方法制造的甘油磷酰肌醇。全文摘要本發明提供了一種新型的磷脂加工劑。本發明的一個目的是提供一種對二酰基形式的磷脂中的磷脂酰肌醇(PI)具有較低水解活性的新型磷脂酶B(PLB)。本發明的另一個目的是提供通過使用所述酶的底物特異性以由磷脂混合物有效地制造PI和甘油磷酰膽堿(GPC)的方法。所述磷脂加工劑含有酶，所述酶具有能夠有效地作用于除PI以外的磷脂，如磷脂酰膽堿(卵磷脂)等，并且對PI具有較低的PLB活性。文檔編號C12N15/00GK101223274SQ20068002637公開日2008年7月16日申請日期2006年7月18日優先權日2005年7月19日發明者今村茂行,古賀晉治申請人:旭化成制藥株式會社