狂犬病病毒組合物和方法

專利名稱：：狂犬病病毒組合物和方法
技術領域：
：本公開涉及病毒學領域。更具體地，本公開涉及可用于保護哺乳動物免受狂犬病病毒感染的組合物和用于生產免疫原性組合物的方法。
背景技術：
：狂犬病仍然是感染人類和動物的最可怕的傳染性疾病之一，盡管在其預防和控制方面已取得顯著的科學進展。在世界不同地區，狂犬病表現為不同的問題。在美國，狂犬病儲存宿主存在于許多野生動物種類中，包括浣熊、臭鼬、狐貍和蝙蝠(Rupprecht等人，五merg./"/e".1(4):107-114,1995)。在橫跨美國的廣大地理區域發現了狂犬病傳染在這些陸生哺乳動物中的爆發。例如，浣熊狂犬病影響從佛羅里達州到緬因州超過1百萬平方公里的區域。盡管發達國家仍然存在野生動物狂犬病，但利用野生動物的口服免疫在控制和消除野生動物狂犬病方面已經取得進展。盡管如此，狂犬病仍然是對公共衛生的一種主要威脅，每年持續造成50,000至60,000人死亡(世界衛生組織，2003年4月)。人類主要是通過被患有狂犬病的家養或者野生動物咬傷而感染狂犬病病毒。在發展中國家，狗導致大約94%的人類狂犬病死亡。在非洲、亞洲和南美洲的大多數國家狗，狂犬病仍然是動物流行性的，并且在這些國家中，狗導致該疾病引起的大部分人類死亡。因此，控制家養和野生動物中的狂犬病病毒感染不僅降低這些動物的死亡率而且降低人類接觸的風險。狂犬病病毒通過被感染動物的咬傷或者抓傷造成的破裂皮膚傳送。接觸狂犬病病毒導致其滲透入外周、無髓鞘的神經末梢，繼而通過逆向軸突運輸傳播，復制只在神經元中發生，并最后到達中樞神經系統(CNS)。CNS的感染造成細胞機能障礙和死亡(Rupprecht&Dietzschold,LabInvest.57:603,1987)。因為狂犬病病毒直接從細胞傳播到細胞，它基本上逃脫了免疫識別(Clark&Prabhakar,Rabies,In:Olson等人,eds"ComparativePathologyofViralDisease,2:165,BocaRaton,FL,CRCPress,1985)。狂犬病病毒(RV)是一種彈狀病毒-一種具有陰性有義極性的非節段RNA病毒。在彈狀病毒科(Rhabdoviridae)家族中，狂犬病病毒是狂犬病毒(Lyssavirus)屬的原型。RV由兩個主要結構成分構成核衣殼或者核糖核蛋白(RNP)，和圍繞RNP核的雙層膜形式的被膜。所有彈狀病毒的感染性成分是RNP核，由負鏈RNA基因組組成，所述負鏈RNA基因組被核蛋白(N)結合RNA依賴性RNA聚合酶(L)和磷蛋白(P)包裝。環繞RNP的膜包含兩種蛋白跨膜糖蛋白(G)和基質(M)蛋白，位于膜內部位置。因此，病毒基因組編碼這5種蛋白RNP中的3種蛋白(N，L禾卩P)，基質蛋白(M)，和糖蛋白(G)。不同狂犬病病毒株致病性的分子決定簇還沒有被完全闡明。RV致病性歸因于多基因事件(Yamada等人，Microbiol,/mm腳/.50:25-32,2006)。例如，RV基因組中的一些位置如果突變，則影響病毒轉錄或者復制，減輕毒性。N基因磷酸化位點的絲氨酸殘基389處(Wu等人，J.fW.76:4153-4161,2002)或者L基因高度保守的C模體的GDN核心序列(Schnell和Conzelmann，Virol.214:522-530,1995)的突變，顯著降低RV轉錄和復制。G蛋白，還稱為刺突蛋白，參與RV的細胞粘附和膜融合。已經鑒定G蛋白330到340位的氨基酸區域(稱為抗原部位III)對RV某些株的毒性重要。數個研究支持以下觀點，即固定RV株的致病性由糖蛋白氨基酸殘基333處存在的精氨酸或者賴氨酸決定(Dietzschold等人Proc.」cflc/.CASL480:70-74,1983;Tuffereau#X,K.ra/.172:206-212,1989)。這種現象似乎至少適用于固定的狂犬病病毒例如CVS,ERA,PV，SAD-B19和HEP-Flury株(Anilionis等人，Nature294:275-278，1981;Morimoto等人，Virol.173:465-477，1989)。例如，具有不同于糖蛋白333位Arg的氨基酸的狂犬病疫苗病毒描述于，例如，WO00/32755(描述RV突變體，其中與親代病毒相比，G蛋白八巧333密碼子的所有3種核苷酸都被改變，因此333位Arg被另一種氨基酸取代)；歐洲專利350398(描述無毒力的RV突變體SAG1，來自RV的BernSAD株，其中糖蛋白333位的Arg己經被替換為Ser);和歐洲專利申請583998(描述減毒的RV突變體，SAG2，其中G蛋白333位的Arg被Glu替換)。其他株，例如RC-HL株，在G的333位具有精氨酸殘基，但在成年小鼠中不造成致命感染(Ito等人，Microl./mmwm/.38:479-482，1994;Ito/K>o/.75:9121-9128,2001)。因此，整個G可能有助于RV的毒性，盡管決定簇或者區域之前還沒有被鑒定。G基因編碼誘導病毒中和抗體的唯一蛋白。已知RV糖蛋白的至少3種狀態負責受體結合的天然狀態(N);膜融合過程初始步驟必需的活性疏水狀態(A)(Gaudin，J.Ce諸o/.150:601-612,2000)，和融合無活性構象(I)。G的正確折疊和成熟在免疫識別中起著重要作用。ERAG胞外結構域中3個潛在糖基化位置分別存在于Asn37,Asn^和Asn，殘基(Wojczyk等人，Glycobiology.8:121-130,1998)。G的非糖基化不僅影響構象，而且抑制蛋白在細胞表面的呈遞。因此，闡明導致狂犬病病毒致病性的分子決定簇提出了一個復雜的問題。發明概述此處公開了對應于狂犬病病毒Evelyn-Rokitnicki-Abelseth(ERA)固定疫苗的病毒株的完整序列，以及對其和狂犬病病毒屬其他株進行測序的方法。還描述了狂犬病病毒的反向遺傳系統，尤其是利用狂犬病病毒株ERA作為示范。T7RNA聚合酶的使用促進病毒復原，所述T7RNA聚合酶在N末端包含一個八氨基酸核定位信號(NLS)。除親代ERA病毒株外，還描述了數種其他衍生病毒，包括ERA-(缺失psi-區域)，ERAgreenl(在psi-區域插入綠色熒光蛋白基因)，ERAgreen2(在磷蛋白和基質蛋白基因間區域插入綠色熒光蛋白)，ERA2g(在psi-區域包含糖蛋白的額外拷貝)，ERAg3(在糖蛋白氨基酸333處有突變)，ERA2g3(在psi-區域氨基酸333處具有改變的糖蛋白的額外拷貝)，ERA-G(其中已經刪除糖蛋白)，ERAgm(M和G基因在基因組中互換)，禾BERAgmg(重排的ERAgm構建體中G的兩個拷貝)。額外轉錄單位被整合入ERA病毒基因組用于開放閱讀框(ORF)的有效表達。通過優化此處描述的繁殖條件，在生物反應器或者固定的組織燒瓶中恢復病毒的滴度達到超過109ffu/mL。還公開了一種組成性表達ERA糖蛋白的改造細胞系。該細胞系，命名為BSR-G，用于重組的，包括減毒和/或復制缺陷的，狂犬病病毒的制備。根據下列詳細說明，本發明的上述以及其他目的、特征和優點將更顯而易見。附圖簡述圖1A.ERA轉錄質粒的示意圖。錘頭核酶和反基因組ERA基因組的位置如圖解所示。按5'到3'方向顯示N,P,MG和L蛋白的相對位置。圖1B.構建全長ERA狂犬病病毒基因組cDNA質粒pTMF的示意圖。RT-PCR產物F1、F2片段，和限制性酶識別位點(Nhel，Kpnl,Blpl,Pst和Notl)(未按比例繪制)。左邊的條顯示RdRz-錘頭核酶，右邊的條顯示HDVRz-丁型肝炎病毒核酶。符號令表示Kpnl或者Pstl位點被刪除，+垂直箭頭表示Nhel或者Notl位點仍是完整的。圖2.通過pNLST7質粒的NLST7RNA聚合酶自身基因作用設想機理的示意圖。DNA轉染試劑復合物通過胞吞作用攝入細胞。從溶酶體和內體釋放的大部分DNA保留在細胞的細胞質中。有限量的質粒轉移到細胞核1)通過CMV立即早期啟動子，NLST7基因通過細胞RNA聚合酶II轉錄；2)成熟的NLST7mRNA從細胞核轉運到細胞質用于NLST7RNA聚合酶合成；3)新合成的NLST7RNA聚合酶轉移到細胞核，而痕量NLST7保留在細胞質中；4)NLST7RNA聚合酶通過pT7啟動子起始轉錄。通過轉錄后修飾，產生額外的NLST7mRNA用于蛋白合成，從而提高病毒恢復效率。圖3.IO種衍生ERA病毒基因組的示意圖。各基因的大小不是按比例繪制。符號"*"標明在Aa333殘基處G的突變，*是Psi-區域。圖4A.轉染細胞中回收的ERA-G病毒，在BHK-G細胞系中傳播和生長的分析。在A中，甚至在以用于病毒恢復的質粒轉染后的7天后，ERA-G病毒病灶仍被抑制。在B中，在正常BSR細胞中傳代后，恢復的ERA-G病毒不傳播。只有個別細胞被DFA染色。在C中，ERA-G病毒在組成型BHK-G細胞系中生長良好。圖4B.BHK-G細胞系中G表達的分析。通過間接熒光染色法，ERA狂犬病病毒G在穩定的細胞系BHK-G的細胞質中表達。圖4C.利用G探針，通過Northern印跡對ERA-G病毒感染細胞中GmRNA的分析。第2道顯示在ERA-G病毒感染的BHK-G細胞中檢測到G基因mRNA，而未檢測到病毒基因組RNA。第1道是ERA-狂犬病病毒感染的BHK-G細胞的總RNA對照，其中GmRNA和病毒基因組RNA均被檢測到。圖5.單步病毒生長曲線所有恢復狂犬病病毒ERA株生長到109或者101Gffu/mL，但ERA-G只達到107ffu/mL。圖6.ERAgreenl/ERAgreen2狂犬病病毒感染的BSR細胞中的綠色病灶Transl是在Psi和L基因間區域整合的翻譯單位。Trans2是在P和M基因間區域的翻譯單位。ERAgreen2和ERAgreenl均在病毒感染的BSR細胞中穩定表達GFP蛋白，而病毒感染后ERAgreen2綠色病灶的出現比在ERAgreenl中早48小時。圖7.在雙G，和G、M重排的ERA-狂犬病病毒中GmRNA表達的分析。在利用G探針的Northern印跡中，與ERA-病毒感染的細胞(第2道)相比，對ERA2g(第1道)、ERAgm(第3道)和ERA2g3(第4道)中GmRNA光密度的測量顯示增強的mRNA水平。利用ERA-病毒作為100%，計算比例。圖8A.通過體內接種重組ERA和衍生物誘導的發病率。三周齡小鼠肌內接種8種恢復病毒。在接種后10天，在ERA、ERA-和ERAgreenl組中，50%、50%和20%的小鼠分別顯示狂犬病的相應臨床癥狀，但沒有死亡。其他組中沒有觀察到不良征象。圖8B.接種重組ERA和衍生物的小鼠中攻擊后的存活率。從圖8A中所示的試驗中存活的小鼠用Texas犬/山狗(coyote)狂犬病病毒進行肌內攻擊。在攻擊后5天，在ERA和ERA-組中，40和62%的小鼠分別顯示狂犬病征象并被處安樂死。在所有其他組中，沒有觀察到狂犬病征象。圖8C.腦內接種重組ERA和ERAg3病毒后的存活。三周齡小鼠分別腦內接種ERA和ERAg3病毒株。ERA組中所有小鼠在接種后15天死亡，而在ERAg3組中，所有小鼠都存活，沒有臨床癥狀。圖8D.乳鼠腦內接種后的存活。兩日齡的乳鼠分別腦內接種ERAg3和ERA-G病毒構建體。ERAg3組中所有小鼠死亡，而ERA-G組中沒有小鼠死亡。圖8E.接種重組ERA和衍生病毒的小鼠的中和抗體滴度。利用RFFIT測定小鼠中和抗體滴度，在病毒接種組中范圍從每mll.36到5.61IU。圖9A.感染Albama蝙蝠狂犬病病毒后的存活。倉鼠接種活的Albama蝙蝠狂犬病病毒，然后用ERAg3病毒或者狂犬病免疫球蛋白和商品化供應的滅活RV疫苗進行接觸后處理。在超過3個月期間進行存活評定。圖9B.感染ThaiStreet犬狂犬病病毒后的存活。倉鼠接種活的Albama蝙蝠狂犬病病毒，然后用ERAg3病毒或者狂犬病免疫球蛋白和商品化供應的滅活RV疫苗進行接觸后處理。在超過3個月期間進行存活評定。圖9C.感染Texas山狗狂犬病病毒后的存活率。倉鼠接種活的Albama蝙蝠狂犬病病毒，然后用ERAg3病毒或者狂犬病免疫球蛋白和商品化供應的滅活RV疫苗進行接觸后處理。在超過3個月期間進行存活評定。序列表如37C.F.R.1.822所定義，利用核苷酸堿基的標準字母縮寫和氨基酸3字母編碼，顯示所附序列表中所列的核酸和氨基酸序列。每個核酸序列只顯示一條鏈，但應當理解為通過任意參考所顯示的鏈，還包括互補鏈，除非上下文明確表示只意在一條鏈。適當的話應理解，通過用尿嘧啶取代硫胺殘基，表示為DNA的序列可以轉換為RNA。SEQIDNO:l.ERACDC野生型病毒，11,931個核苷酸1-58核苷酸，前導區71-1420核苷酸，N基因1514-2404核苷酸，P基因2496-3101核苷酸，M基因3317-4888核苷酸，G基因4964-5362核苷酸，Psi-區域5417-11797核苷酸，L基因11862-11931核苷酸，Trailer區SEQIDNO:2.ERACDC:71至U1420:450aa,N蛋白.SEQIDNO:3.ERACDC:1514至lj2404:297aa,P蛋白.SEQIDNO:4.ERACDC:2496至U3101:202aa,M蛋白.SEQIDNO:5.ERACDC:3317至lj4888:524aa,G蛋白.SEQIDNO:6.ERACDC:5417to11797:2127aa，L蛋白.SEQIDNO:7.通過反向遺傳系統恢復的重組ERA(rERA)有U,930個核苷酸。在重組ERA反向遺傳系統中，野生型ERA株中G基因和psi-區之間的特異性poly(A8)tract被突變為poly(A7)tract,作為序列標記物。因此，rERA比野生型ERA少一個核苷酸。所有其他序列信息都是完全相同的。SEQIDNO:8.ERAg3株(11,930個核苷酸)，G蛋白中的氨基酸(333Aa)已經改變；相應的核酸在4370到4372位。SEQIDNO:9.ERA-(11，577個核苷酸)，無psi(假-基因)區；額外轉錄單位已經導入核苷酸4950到5008位。SEQIDNO:10.ERA-2GU3,150個核苷酸)，該株具有G基因的兩個拷貝；第二個拷貝在4988到6559位插入。SEQIDNO:11.ERAgreen(12,266個核苷酸)，該株在4993到5673位包含GFP的編碼序列；細胞或者組織感染后在紫外光下顯示綠色。SEQIDNO:12.ERA-G(10,288個核苷酸)，該株不含G基因。SEQIDNO:13.ERA-2g3(13,150個核苷酸)；該株具有G基因的兩個拷貝(其中第二個在4988到6559位)，兩個均是在氨基酸333被取代(對應于所示序列中核苷酸位置4370-4372和6041-6043)。SEQIDNO:14.ERA-pt(11,976個核苷酸，P基因后2469到2521位處具有一個額外的轉錄單位)。SEQIDNO:15.ERA-pt-GFP(12,662個核苷酸，在P基因后2505到3185位插入GFP基因)。SEQIDNO:16.ERAgm(11,914個核苷酸)G和M基因的位置分別與G在2505-4076位和M在4122-4727位互換。SEQIDNO:17.ERAg3m(11，914個核苷酸)G和M基因的位置分別與G在2505-4076位和M在4122-4727位互換。G基因在氨基酸333位突變。SEQIDNO:18.ERAgmg(13,556個核苷酸)，該株在2505-4076位和4943-6514位具有G基因的兩個拷貝，在4122-4727位側翼帶有M基因。SEQIDNO:19.綞頭核酶的前10個核苷酸對應于狂犬病病毒ERA基因組的5'端。SEQIDNO:20.核苷酸序列編碼SV40T抗原核定位信號(NLS)。SEQIDNO:21-23.人工Kozak序列。SEQIDNO:24-57.合成寡核苷酸。SEQIDNO:58.在氨基酸333位突變的G蛋白的氨基酸序列(從Arg到Glu)。SEQIDNO:59-65.合成寡核苷酸。具體內容/.分薪病毒性人畜共患病很難預防。一種主要范例是通過口服免疫控制野生動物狂犬病。所有當前得到許可的口服狂犬病疫苗基于一個共同來源。Evelyn-Rokitnicki-Abelseth(ERA)的固定狂犬病病毒(RV)來源于Street-Alabama-Dufferin(SAD)株，1935年首先從阿拉巴馬(USA)的一條瘋狗中分離。在小鼠腦、幼倉鼠腎(BHK)細胞和雞胚中進行SADRV的多次傳代后，獲得ERA株。ERA在BHK細胞中的重復克隆最終獲得B-19克隆，其被命名為SAD-B19，用于疫苗研究。通過反向遺傳恢復的第一個RV株是SAD-B19。盡管SAD-B19和ERARV來自相同來源，但是在不同動物的口服疫苗研究中觀察到不同的結果。例如，ERA在臭鼬或者浣熊中口服不誘導明顯的中和抗體，而SAD-B19誘導。為了闡明這兩種RV株之間的潛在差異，需要一種用于ERARV株的反向遺傳系統。反向遺傳學提出了一種按照指定路線修飾RNA病毒的可行途徑。一種用于狂犬病病毒原始株的反向遺傳系統在1994年成功建立(Schnell等人，TheEMBOJ.13，4195-4203,1994)。在十年間，已經對該系統作出改進，導致病毒恢復的效率增加。這種增加的效率有助于闡明病毒致病性、蛋白-蛋白以及蛋白-RNA相互作用。在狂犬病病毒基因組內，已經認為一些區域包含重要的信號，例如病毒遠端啟動子區，核蛋白包裝，RNA依賴性RNA聚合酶L轉錄起始位點，多腺苷酸化和終止位點。這些信號對于確保病毒的有效恢復和設計額外的轉錄單位是非常重要的，所述額外轉錄單位用于將外源的開放閱讀框(ORF)接納到狂犬病病毒基因組中。本公開提供一種有效的反向遺傳系統，并描述其產生ERA株病毒的變異體的用途。此處描述的修飾獲得適合用于接納ORF表達和疫苗開發的候選株。反向遺傳系統由一組質粒組成。第一種質粒包括ERA病毒cRNA。為了在轉錄的病毒cDNA中產生可靠的病毒反基因組末端，ERA基因組在cDNA3'端側翼為錘頭核酶，5'端側翼為丁型肝炎病毒核酶。反基因組盒與細菌噬菌體T7轉錄起始信號融合，這還任選在巨細胞病毒(CMV)立即早期啟動子的控制下。該系統還包括大量輔助質粒，所述輔助質粒編碼參與病毒包裝的蛋白。例如，該系統通常包括編碼病毒核蛋白(N)、磷蛋白(P)、RNA依賴性聚合酶(L)、和任選的病毒糖蛋白(G)的輔助質粒。該系統還包括編碼噬菌體T7RNA聚合酶(T7)的質粒，其可以通過添加核定位信號(NLS)進行修飾，以增加轉染細胞的細胞核中T7聚合酶的表達。T7RNA聚合酶表達質粒被構建為"自身基因"，其在轉染到細胞中之后轉錄全長的病毒反基因組cRNA用于核蛋白包裝。反向遺傳系統可用于設計和制備用于狂犬病病毒治療(接觸前和/或后)的免疫原性組合物，和用于制備表達外源開放閱讀框(ORF)的狂犬病病毒ERA載體。例如，額外轉錄單位可以被設計、檢測并在Psi-區和/或磷蛋白(P)-基質(M)蛋白基因間區域處整合到ERA基因組中。基本上任何感興趣的ORF都可以在ERA載體的環境中表達，包括編碼病毒抗原和其他病原體的ORF，例如其他狂犬病病毒屬的抗原，以及用于表達其他治療感興趣的蛋白。因此，此處公開的方法和組合物可用于設計和制備狂犬病病毒免疫原性組合物，包括適合作為疫苗的組合物，所述疫苗用于狂犬病病毒接觸前和/或后的治療。II.縮寫ADE抗體依賴性增強Ag-ELISA抗原-捕獲ELISADNA脫氧核糖核酸ERA狂犬病病毒株Evelyn-Rokitnicki-AbelsethELISA酶聯免疫吸附分析G糖蛋白i.e.腦內IFA間接免疫-熒光分析i.m.肌內RNA依賴性RNA聚合酶M基質蛋白mAb單克隆抗體N核蛋白ORF開放閱讀框P磷蛋白PCR聚合酶鏈式反應RACEcDNA末端5'快速擴增RNA核糖核酸RNP核糖核蛋白RT-PCR逆轉錄-聚合酶鏈式反應RV狂犬病病毒trans1額外轉錄單位1trans2額外轉錄單位2瓜術語除非另有解釋，所有此處使用的技術和科學術語的含義與本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同。類似地，除非另作注解，技術術語根據常規用法使用。分子生物學常見術語的定義可以參見BenjaminLewin，基因V(GenesV),OxfordUniversityPress出版，1994(ISBN0-19-854287-9);Kendrew等人(編著)，分子生物學全編(77^￡"wc_yc/oped/flo/Afo/ecw/or，BlackwellScienceLtd.出版,1994(ISBN0-632-02182-9);和RobertA.Meyers(編著)，分子生物學和生物技術綜合參考(Mo/ecw/arSio/ogytmcWc^ec/mo/ogyzaCompre/ze,.veZ)e^e/e簡ce),VCHPublishers,Inc.出版,1995(ISBN1-56081-569-8)。單數術語"a"、"an"和"the"包括復數指代，除非上下文另有明確指示。類似地，單詞"或"意在包括"和"，除非上下文另有明確指示。因此"包括A或者B"意思是包括A，或者B，或者A和B。還應了解，對于核酸或者多肽給出的所有堿基大小或者氨基酸大小，和分子量或者分子質量值，都是近似的，提供來說明。為了有助于瀏覽本發明的不同實施方式，提供下列專用術語的解釋佐劑非特異性增強針對抗原的免疫應答的物質。Singh等人綜述了在人類中使用的疫苗佐劑的發展(Nat.Ao,ec/z"o/.17:1075-1081,1999)，在其出版時公開了鋁鹽和MF59微乳劑是僅有的被批準用于人的疫苗佐劑。擴增核酸分子的擴增(例如，DNA或者RNA分子)是指一種實驗技術的使用，該技術增加樣品中核酸分子的拷貝數。一個擴增的實例是聚合酶鏈式反應(PCR)，其中在允許引物與樣品中核酸模版雜交的條件下，樣品接觸寡核苷酸引物對。引物在合適的條件下延伸，從模板解離，再退火，延伸，再解離以擴增核酸的拷貝數。擴增產物可以利用電泳、限制性核酸內切酶切割模式、寡核苷酸雜交或者連接、和/或核酸測序這類技術進行表征。擴增方法的其他實例包括鏈置換擴增，如美國專利5,744,311所公開；無轉錄等溫擴增，如美國專利6,033,881所公開；修復鏈式反應擴增，如WO90/01069所公開；連接酶鏈式反應擴增，如EP-A-320,308所公開；間隙填補連接酶鏈式反應擴增，如美國專利5,427,930所公開；和NASBATM無RNA轉錄擴增，如美國專利6,025,134所公開。擴增方法可以改變，包括例如通過其他的步驟或者將擴增與另一個方案聯動物活的多細胞脊椎生物體，包括例如哺乳動物和鳥類的范疇。術語哺乳動物包括人和非人哺乳動物。類似地，術語"對象"包括人類和獸類對象，例如，人，非人靈長類，狗，貓，馬，和牛。抗體一種蛋白(或者蛋白復合物)，包括基本上由免疫球蛋白基因或者免疫球蛋白基因片段編碼的一種或者多種多肽。識別的免疫球蛋白基因包括k、人、a、Y、5、s和p恒定區基因，以及眾多的免疫球蛋白可變區基因。輕鏈被分為K或者X。重鏈被分為Y、p、a、5或者s，分別依次定義免疫球蛋白類型，IgG,IgM，IgA,IgD和IgE。基本的免疫球蛋白(抗體)結構單位通常是四聚體。每個四聚體由多肽鏈的兩個相同對組成，每個對具有一個"輕"(大約25kDa)鏈和一個"重"(大約50-70kDa)鏈。每條鏈的N-末端確定一個大約100到110或者更多氨基酸的可變區，主要負責抗原識別。術語"可變輕鏈"(VL)和"可變重鏈"(VH)分別指代這些輕鏈和重鏈。此處使用的術語"抗體"包括完整的免疫球蛋白以及許多明確表征的片段。例如，結合靶蛋白(或者在蛋白或者融合蛋白內的表位)的Fabs,Fvs和單鏈Fvs(SCFvs)也是所述蛋白(或者表位)的特異結合劑。這些抗體片段如下所示(1)Fab，通過用木瓜蛋白酶消化整個抗體產生的包含抗體分子的單價抗原結合片段的片段，產生完整的輕鏈和一種重鏈的一部分；(2)Fab'，通過用胃蛋白酶處理整個抗體然后還原獲得的抗體分子片段，產生完整的輕鏈和一部分重鏈；每個抗體分子得到兩個Fab'片段；(3)(Fab')2，通過用胃蛋白酶處理整個抗體而沒有后續的還原得到的抗體片段；(4)F(ab')2，通過兩個二硫鍵連接在一起的兩個Fab'片段的二聚體；(5)Fv，包含輕鏈可變區和重鏈可變區、表達為兩條鏈的遺傳工程片段；和(6)單鏈抗體，一種包含輕鏈可變區和重鏈可變區的遺傳工程分子，通過合適的多肽接頭連接為基因融合的單鏈分子。制備這些片段的方法是常規的(參見,例如，Harlow和Lane，抗體應用實驗室手冊(UsingAntibodies:ALaboratoryManual),CSHL,NewYork,1999)。本公開方法和組合物中使用的抗體可以是單克隆或者多克隆的。僅僅舉例來說，單克隆抗體可以根據Kohler禾BMilstein(Nature256:495-97,1975)的傳統方法或者其衍生方法從鼠類雜交瘤制備。單克隆抗體制備的詳細步驟描述于Harlow和Lane,抗體應用實驗室手冊(UsingAntibodies:ALaboratoryManual),CSHL,NewYork,1999。抗體結合親合力單一抗體結合位點和配體(例如，抗原或者表位)之間結合的強度。抗體結合位點x對配體Y的親合力表示為解離常數(Kd)，這是占據溶液中存在的一半X結合位點所需的Y濃度。較小(Kd)表明X和Y之間較強或者較高的親合力相互作用，并且占據位點需要的配體濃度較低。通常，抗體結合親合力受到互補位識別的表位中一個或多個氨基酸的改變、修飾和/或取代的影響。在一個實例中，在Ag-ELISA分析中通過終點滴定測量抗體結合親合力。如果與未改變的表位相比，針對修飾/取代表位的特異抗體的終點滴度相差至少4倍，例如至少10倍，至少100倍或者更大，則通過修飾和/或取代互補位識別的表位中的一個或者多個氨基酸，抗體結合親合力顯著降低(或者可測量地降低)。抗原能夠刺激動物抗體產生或者t細胞應答的化合物、組合物或者物質，包括注射或吸收到動物中的組合物。抗原與特異性體液或者細胞免疫的產物反應，包括那些被異源免疫原誘導的產物。在一個實施方式中，抗原是病毒抗原。減毒在活病毒的情況下，例如狂犬病病毒，如果病毒感染細胞或者對象的能力和/或其致病的能力降低(例如，消除)，則該病毒被減毒。通常，在給具有免疫能力的對象施用后，減毒病毒至少保留一些引發免疫應答的能力。在一些情況下，減毒病毒能夠引發保護性免疫應答而不引起任何感染的征象或者癥狀。結合或者穩定結合如果足量的寡核苷酸形成堿基對或者與其靶核酸雜交，則寡核苷酸與靶核酸結合或者穩定結合，以允許對所述結合的檢測。通過靶:寡核苷酸復合物的物理或者功能特性可以檢測結合。靶和寡核苷酸之間的結合可以利用本領域技術人員已知的任何方法進行檢測，包括功能或者物理結合分析。通過檢測結合是否對生物合成過程例如基因表達、DNA復制、轉錄、翻譯等等有可觀察到的影響，可以對結合進行功能檢測。檢測DNA或者RNA互補鏈結合的物理方法是本領域公知的，這類方法包括DNaseI或者化學足跡法，凝膠遷移和親合力切割分析，Northern印跡，Southern印跡，點印跡，和光吸收檢測方法。例如，一種廣泛使用的方法，因為它如此簡單并且穩定，包括當溫度緩慢升高時，在220到300nm處觀察溶液光吸收的變化，所述溶液包含寡核苷酸(或者類似物)和靶核酸。如果寡核苷酸或者類似物與其靶結合，當寡核苷酸(或者類似物)和靶解離或者熔解時，在特征溫度處的吸收突然增加。寡聚物和其靶核酸之間的結合經常表征為溫度(Tm)，在該溫度下，50%的寡聚物從其靶熔解。相對于具有較低Tm的復合物，較高的Tm表示更強或者更穩定的復合物。cDNA(互補DNA):—段DNA，缺失內部、非編碼段(內含子)和確定轉錄的調控序列。在實驗室中通過從細胞提取的信使RNA逆轉錄，合成cDNA。電泳電泳是在電場影響下，帶電荷的溶質或者顆粒在液體介質中的遷移。電泳分離被廣泛用于高分子分析。特別重要的是蛋白和核酸序列的鑒定。這類分離可基于大小或者電荷的差異。核苷酸序列帶有相同的電荷，因此根據大小差異進行分離。電泳可以在無支持的液體介質中進行(例如，毛細管電泳)，但更常見的是液體介質穿行過固相支持介質。最廣泛使用的支持介質是凝膠，例如，聚丙烯酰胺和瓊脂糖凝膠。篩分凝膠(例如，瓊脂糖)阻礙分子的流動。凝膠孔徑決定能夠自由流過凝膠的分子大小。當分子大小增加時，穿過凝膠的時間值也增加。結果，小分子比大分子更快地通過凝膠，因此在給定時間段內比更大的分子從加樣區前進得更遠。這類凝膠用于核苷酸序列基于大小的分離。線性DNA片段遷移通過瓊脂糖凝膠，其遷移率與它們分子量的loglO成反比。通過利用具有不同瓊脂糖濃度的凝膠，能夠分辨不同大小的DNA片段。較高濃度的瓊脂糖有利于小DNA的分離，而低瓊脂糖濃度能夠分辨更大的DNA。表位抗原決定簇。這些是特定化學基團，例如分子上的連續或者非連續的肽序列，所述基團是抗原性的，即引發特異性免疫應答。基于抗體的三維結構和匹配(或者同源)的表位三維結構，抗體結合特定抗原表位。"取代表位"包括在表位中的至少一種結構取代，例如一個氨基酸取代另一個。雜交寡核苷酸和它們的類似物通過互補堿基之間的氫鍵合雜交，包括Watson-Crick，Hoogsteen或者反向Hoogsteen氫鍵合。通常，核酸由含氮堿基組成，所述含氮堿基是嘧啶(胞嘧啶(C),尿嘧啶(U),和胸腺嘧啶(T))或者嘌呤(腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G))。這些含氮堿基在嘧啶和嘌呤之間形成氫鍵，嘧啶與嘌呤的成鍵稱為"堿基配對"。更具體地，A與T或者U形成氫鍵，G與C形成鍵。"互補"是指在不同的核酸序列或者相同核酸序列的兩個不同區域之間發生的堿基配對。"可特異雜交"和"特異互補"是表明互補性的足夠程度使得在寡核苷酸(或者其類似物)和DNA或者RNA靶之間發生穩定和特異結合的術語。寡核苷酸或者寡核苷酸類似物無需與其靶序列100%互補以便可特異雜交。當寡核苷酸或者類似物與靶DNA或者RNA分子的結合干擾耙DNA或者RNA的正常功能時，寡核苷酸或者類似物是可特異雜交的，在需要特異結合的情況下，例如在體內分析或者系統中的生理條件下，存在足夠程度的互補性以避免寡核苷酸或者類似物與非靶序列的非特異結合。這類結合稱為特異雜交。根據所選雜交方法和組合物的性質和雜交核酸序列的長度，雜交條件導致的特定嚴謹程度是不同的。通常，雜交溫度和雜交緩沖液的離子強度(尤其是^+和/或^8++濃度)將決定雜交的嚴謹性，盡管洗滌時間也影響嚴謹性。關于達到特定嚴謹程度所需的雜交條件的計算論述于Sambrook等人(編著)，分子克隆實驗室手冊第二版1-3冊(A/o/ecw/arC7om'wgvJZ^fl6oratoryAfawwa/,2nded.,vol.1-3),9禾口11章節，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989,;和Ausubel等人分子生物學簡編第四版(Wort7^Woco/""Mo/eciz/flr4thed.),JohnWiley&Sons,Inc.,1999。對于本公開來說，"嚴謹條件"包括如下條件，即在該條件下雜交只在雜交分子和靶序列之間的錯配小于25%的情況下發生。為了更精確的定義，"嚴謹條件"可以分解為特定水平的嚴謹性。因此，此處使用的"適度嚴謹"條件是指序列錯配大于25%的分子不會雜交的條件；"中等嚴謹"條件是指錯配大于15%的分子不會雜交的條件，而"高度嚴謹"條件是指錯配大于10%的序列不會雜交的條件。"非常高度的嚴謹"條件是指錯配大于6%的序列不會雜交的條件。"特異雜交"是指當所述序列存在于復雜混合物(例如，總細胞DNA或者RNA)中時，分子只與或者基本上只與特定核苷酸序列結合、形成雙鏈或者雜交。特異雜交也可能在不同嚴謹條件下發生。免疫刺激組合物此處使用的術語是指用于刺激或者引發脊椎動物特異性免疫應答(或者免疫原性應答)的組合物。免疫刺激組合物可以是蛋白抗原或者用于表達蛋白抗原的質粒載體。在一些實施方式中，免疫原性應答是保護性的或者提供保護性免疫，從而它使脊椎動物能夠更好抵抗來自免疫刺激組合物針對的生物體的感染或者疾病進展。不希望受到特定理論的約束，認為免疫刺激組合物誘導的免疫原性應答可能起于抗體的產生，所述抗體對免疫刺激組合物提供的一種或者多種表位特異。或者，該應答可能包括基于T-輔助細胞或者細胞毒性細胞的應答，所述應答針對免疫刺激組合物提供的一種或者多種表位。所有這3種應答可能源于幼稚或者記憶細胞。這類免疫刺激組合物的一個特定實例是疫苗。在一些實施方式中，免疫刺激組合物的"有效量"或者"免疫-刺激量"是當施用于對象時足夠引起可檢測的免疫應答的量。這類應答可能包括，例如，對免疫刺激組合物提供的一種或者多種表位特異的抗體的產生。或者，該應答可能包括基于T-輔助細胞或者CTL的應答，所述應答針對免疫刺激組合物提供的一種或者多種表位。所有這3種應答可能源于幼稚或者記憶細胞。在其他實施方式中，免疫刺激組合物的"保護有效量"是當施用于對象時足夠賦予對象保護性免疫的量。抑制或者治療疾病例如在處于患病風險的對象中抑制疾病或者病癥的完全發展。疾病的一個特定實例是狂犬病。"治療"是指疾病或病理狀態開始發展后，改善其征象或者癥狀或者病理病癥的治療介入。就疾病、病理狀況或者癥狀而言，此處使用的術語"改善"是指任意可觀察到的治療的有益作用。有益作用可以證明，例如，通過在易感對象中疾病臨床癥狀的延遲發作，疾病的一些或者全部臨床癥狀的嚴重程度減輕，疾病的進展減慢，疾病的復發次數減少，對象的整體健康或者康復改善，或者通過本領域公知的對特定疾病特異的其他參數。分離的"分離的"或者"純化的"生物組分(例如核酸，肽，蛋白，蛋白復合物，或者顆粒)已經從組分天然存在的生物體細胞中的其他生物學組分中，即其他染色體和染色體外DNA和RNA和蛋白中，被基本上分離、分離產生或者純化。因此"分離的"或者"純化的"核酸、肽和蛋白包括通過標準純化方法純化的核酸和蛋白。該術語還包含在宿主細胞中利用重組表達制備的核酸、肽和蛋白，以及化學合成的核酸或者蛋白。術語"分離的"或者"純化的"并不需要絕對的純度；它只是用來作為一個相對術語。因此，例如，分離的生物學組分是其中生物學組分比在細胞內其自然環境或者其他生產容器中的生物學組分更富集的生物學組分。優選的，制品被純化使生物學組分代表制品的全部生物學組分含量的至少50%，例如至少70%，至少90%，至少95%或者更多。標記一種可檢測的化合物或者組合物，其與另一個分子直接或者間接結合以促進該分子的檢測。標記的特定、非限制實例包括熒光標簽，酶連接物，和放射性同位素。核酸分子核苷酸的多聚形式，包括RNA、cDNA、基因組DNA和上述的合成形成和混合聚合物的有義和反義鏈。核苷酸是指核糖核苷酸、脫氧核苷酸或者任一種類型核苷酸的修飾形式。此處使用的術語"核酸分子"與"核酸"和"多核苷酸"同義。核酸分子通常至少長10個堿基，除非另作說明。該術語包括DNA的單鏈和雙鏈形式。多核苷酸可以包括連接在一起天然存在的或者修飾的核苷酸的任一種或者兩者，通過天然存在和/或非天然存在的核苷酸連接進行連接。寡核苷酸一種核酸分子，通常包括300個堿基或者以下的長度。尤其是，該術語經常是指單鏈脫氧核糖核苷酸，但它也可以指單鏈或者雙鏈核糖核苷酸，RNA:DNA雜交和雙鏈DNA。術語"寡核苷酸"還包括寡聚核苷(oligonucleosides)(也就是說，去除磷酸鹽的寡核苷酸)和任何其他的有機堿基聚合物。一些實例中，寡核苷酸長度為大約IO到大約90個堿基，例如，長度為12,13,14,15,16,17,18,19或20個堿基。其它寡核苷酸長度為大約25，大約30，約35，大約40，大約45，大約50，大約55，大約60個堿基，大約65個堿基，大約70個堿基，大約75個堿基或者大約80個堿基。寡核苷酸可以是單鏈的，例如，用作探針或引物，或者可以是雙鏈的，例如，用于突變體基因的構建。寡核苷酸可以是有義或反義寡核苷酸。寡核苷酸可以按照上述關于核酸分子的論述來修飾。寡核苷酸能夠從現有的核酸來源(例如，基因組或CDNA)獲得，但是也能夠是合成的(例如，通過實驗室或者體外寡核苷酸合成來生產)。開放閱讀框(ORF):編碼氨基酸的一系列核苷酸三聯體(密碼子)，沒有任何內部終止密碼子。這些序列通常可翻譯為肽/多肽/蛋白/多蛋白。本領域已識別下列密碼子(顯示為RNA)可以互換地用于編碼各特定氨基酸或者終止丙氨酸(Ala或者A)GCU,GCG,GCA,或者GCG;精氨酸(Arg或者R)CGU,CGC,CGA,CGG,AGA,或者AGG;天門冬酰胺(Asn或者N)AAU或者AAC;天冬氨酸(Asp或者D)GAU或者GAC;半胱氨酸(Cys或者C)UGU或者UGC;谷氨酸(Glu或者E)GAA或者GAG;谷氨酰胺(Gin或者Q)CAA或者CAG;甘氨酸(Gly或者G)GGU，GGC,GGA,或者GGG;組氨酸(His或者H)CAU或者CAC;異亮氨酸(lie或者I)AUU,AUC,或者AUA;亮氨酸(Leu或者UUA,UUG,CUU,CUC,CUA，或者CUG;賴氨酸(Lys或者K)AAA或者AAG;甲硫氨酸(Met或者M)AUG;苯丙氨酸(Phe或者F)UUU或者UUC;脯氨酸(Pro或者P)CCU，CCC,CCA,或者CCG;絲氨酸(Ser或者S)UCU,UCC，UCA,UCG,AGU,或者AGC;終止密碼子UAA(赭石)或者UAG(琥珀)或者UGA(蛋白石)；蘇氨酸(Thr或者T)ACU,ACC,ACA,或者ACG;酪氨酸(Tyr或者Y)UAU或者UAC;色氨酸(Trp或者W)UGG;和纈氨酸(Val或者V)GUU,GUC，GUA，或者GUG。在每種情況下對于DNA的相應密碼子用T取代U。可操作地連接當第一核酸序列置于與第二核酸序列的功能關系時，第一核酸序列與第二核酸序列可操作地連接。例如，啟動子可操作地連接到編碼序列表示啟動子影響編碼序列的轉錄或者表達。通常，可操作地連接的DNA序列是連續的，并且必要時在相同閱讀框內連接兩個蛋白編碼區域。如果存在內含子，可操作連接的DNA序列可能不是連續的。互補位抗體的一部分，負責抗體與抗原上的抗原決定簇(表位)的結合。藥學上可接受的載體用于本公開的藥學上可接受的載體是常規的。E.W.Martin的雷氏藥物科學(iem/"g""iP/^rmacew"ca/Sc/e"c^)第15版(1975),,MackPublishingCo.,Easton,，描述了適于一種或者多種治療化合物或者分子的藥物輸送的組合物和制劑，例如一種或者多種SARS-CoV核酸分子，蛋白或者結合這些蛋白的抗體，和其他藥劑。通常，載體的性質將取決于所使用的特定給藥方式。例如，腸胃外制劑通常包括注射液，所述注射液包括藥學上和生理上可接受的液體，例如水、生理鹽水、平衡鹽溶液、水性右旋糖、甘油等作為介質。對于固體組合物(例如，粉劑，丸劑，片劑，或者膠囊形式)，常規的無毒固相載體可以包括，例如，藥物級的甘露醇，乳糖，淀粉，或者硬脂酸鎂。除生物中性載體外，要給藥的藥物組合物可以包含少量無毒的輔助物質，例如濕潤或者乳化劑，防腐劑，和pH緩沖劑等等，例如乙酸鈉或者脫水山梨醇單月桂酸酯。多肽一種聚合物，其中單體是通過酰胺鍵連接在一起的氨基酸殘基。當氨基酸是a-氨基酸時，可以使用L-光學異構體或者D-光學異構體，對許多生物用途來說L-異構體是優選的。此處使用的術語"多肽"或者"蛋白"旨在包括任意氨基酸分子并包括修飾的氨基酸分子。術語"多肽"特別旨在涵蓋天然存在的蛋白，以及重組或者合成產生的那些蛋白。保守氨基酸取代是指當進行取代時，最少干擾最初蛋白的性質，也就是說，蛋白的結構、尤其功能是保守的，不會被這種取代顯著改變。保守取代的實例如下所示。原始殘基保守取代AlaSerArgLysAsnGin,HisAspGluCysSerGinAsnGluAspHisAsn;GinlieLeu,ValLeulie;ValLysArg;Gin;GluMetLeu;liePheMet;Leu;TyrSerThrThrSerTrpTyrTyrTrp;PheVallie;Leu保守取代通常保持(a)取代區域內多肽骨架的結構，例如，片層或者螺旋構象，(b)分子在靶位點的電荷或者疏水性，或者(c)側鏈的體積。根據它們的側鏈，通常將氨基酸分類為一種或者多種類型，包括極性，疏水性，酸性，堿性和芳香族的。極性氨基酸的實例包括那些具有側鏈功能基團例如羥基、巰基和酰胺的氨基酸，以及酸性和堿性氨基酸。極性氨基酸包括，不限于，天門冬酰胺，半胱氨酸，谷氨酰胺，組氨酸，硒代半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，色氨酸和酪氨酸。疏水性或者非極性氨基酸的實例包括那些具有非極性脂肪族側鏈的殘基的氨基酸，例如，不限于，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，甘氨酸，丙氨酸，脯氨酸，甲硫氨酸和苯丙氨酸。堿性氨基酸殘基的實例包括那些堿性側鏈的殘基，例如氨基或者胍基基團。堿性氨基酸殘基包括，不限于，精氨酸，同聚賴氨酸和賴氨酸。酸性氨基酸殘基的實例包括那些具有酸性側鏈功能基團的殘基，例如羧基。酸性氨基酸殘基包括，不限于，天冬氨酸和谷氨酸。芳香族氨基酸包括那些具有芳香族側鏈基團的氨基酸。芳香族氨基酸的實例包括，不限于，聯苯基丙氨酸，組氨酸，2-萘基丙氨酸(napthylalananine)，五氟苯丙氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸。注意到一些氨基酸被分到多于一個組，例如，組氨酸，色氨酸和酪氨酸被分類為極性和芳香族氨基酸。被分類到上述各組的其他氨基酸是本領域普通技術人員已知的。通常預期產生蛋白性質最大變化的取代將是非保守性的，例如在以下方面的變化(a)親水性殘基，例如，絲氨酰或者蘇氨酰取代(或者被取代)疏水性殘基，例如，亮氨酰，異亮氨酰，苯丙氨酰，纈氨酰或者丙氨酰；(b)半胱氨酸或者脯氨酸取代(或者被取代)任意其他殘基；(c)具有正電性側鏈的殘基，例如，賴氨酰，精氨酰，或者組胺酰(histadyl)，取代(或者被取代)負電性的殘基，例如，谷氨酰或者天冬氨酰基；或者(d)具有龐大側鏈的殘基，例如，苯丙氨酸，取代(或者被取代)沒有側鏈的殘基，例如，甘氨酸。探針和引物探針包括連接于可檢測的標記物或者其他報告分子的分離核酸分子。典型標記物包括放射性同位素，酶底物，輔因子，配體，化學發光或者熒光劑，半抗原和酶。標記方法和選擇適合于不同目的的標記物的指導論述于，例如Sambrook等人編著)，分子克隆實驗室手冊第二版1-3冊(Mo/ecw/wC/o"/"g:^丄Wor^oo;Mawwa/,2nded.，vol.1-3)，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989和Ausubd等人的分子生物學簡編第四版(57ioWiVc^oco/si"Afo/ecw/ar5Zo/ogy,4thed.),JohnWiley&Sons,Inc.,1999。引物是短的核酸分子，例如6個核苷酸以上長度的DNA寡核苷酸，例如與連續互補核苷酸或者待擴增的序列雜交的寡核苷酸。更長的DNA寡核苷酸可以是大約10，12，15，20，25，30或者50個核苷酸以上的長度。引物可以通過核酸雜交與互補靶DNA鏈退火，在引物和耙DNA鏈之間形成雜交，然后引物通過DNA聚合酶沿著靶DNA鏈延伸。引物對可以用于核酸序列的擴增，例如，通過聚合酶鏈式反應(PCR)或者本領域已知的其他核酸擴增方法。擴增的其他實例包括鏈替代擴增，如美國專利5,744,311所公開；無轉錄等溫擴增，如美國專利6,033,881所公開；修復鏈式反應擴增，如WO90/01069所公開；連接酶鏈式反應擴增，如EP-A-320308所公開；間隙填補連接酶鏈式反應擴增，如5,427,930所公開；和NASBA1^無RNA轉錄擴增，如美國專利6,025,134所公開。制備和使用核酸探針和引物的方法描述于例如Sambrook等人(編著)的分子克隆實驗室手冊第二版1-3冊(Afo/eoJwC/om'"g.'爿ZaZora組jMa肌a/,2nded.,vol.1-3),ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989;Ausubel等人的分子生物學簡編第四版(iSTzoWiVoZoco/sAfo/ecw/ar4thed).,JohnWiley&Sons,Inc.,1999;和Innis等人的PCR教程-方法和應用指導(jFVotoco/s,爿GwzWeMeAoAawdy4/p/z'ca"'ows),AcademicPress,Inc.,SanDiego,CA,1990。擴增引物對可以來源于已知序列，例如，通過利用用于該目的的計算機程序例如Primer(Version0.5,1991,WhiteheadInstituteforBiomedicalResearch,Cambridge,MA)。本領域普通技術人員了解特定探針或者引物的特異性隨其長度而增加。因此，為了獲得更高的特異性，可以選擇探針和引物包括靶核苷酸序列的至少20，25，30，35，40，45，50或者更多個連續核苷酸。蛋白一種生物分子，尤其是多肽，由基因表達并由氨基酸組成。純化的術語"純化的"并不需要絕對的純度；它用作一個相對術語。因此，例如，純化的蛋白制品是其中目標蛋白比其在細胞內自然環境中更純的蛋白制品。通常，純化蛋白制品使得所述蛋白占制品總蛋白含量的至少50%。重組核酸一種核酸分子，其不是天然存在的或者具有一個由序列的兩個本來分離的片段人工組合制備的序列。這種人工組合通過化學合成或者，更常見的，通過核酸分離片段的人工處理實現，例如，通過遺傳工程技術，例如描述于Sambrook等人(編著)的分子克隆實驗室手冊第二版1-3冊(Mo/ec"/arC7om'"g:JA/a,fl/,2nded.,vol.1-3),ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor，NY,1989。術語重組包括只是通過天然核酸分子一部分的添加、取代或者缺失改變的核酸。調控序列或者元件這些術語通常是指影響或者控制基因表達的一類DNA序列。該術語包括的是啟動子，增強子，基因座控制區(LCR)，絕緣子/臨界元件，沉默子，基質結合區(MAR，還稱為支架附著區)，阻遏子，翻譯終止子，復制起點，著絲粒，和減數分裂重組熱點。啟動子是鄰近基因5'端的DNA序列，作為DNA依賴性RNA聚合酶的結合位點，從這里起始轉錄。增強子是提高從啟動子起始的轉錄水平的控制元件，通常與增強子方向或者與啟動子的距離無關。對與它們連接的基因的表達，LCRs提供組織特異的和短暫的調節。LCR功能和它們與基因的相對位置無關，但取決于拷貝數。據認為它們作用于打開核小體結構，從而其他因子可以結合DNA。LCR還可能影響復制時間和起點的使用。絕緣子(亦稱臨界元件)是通過阻斷周圍染色質的作用，阻止基因轉錄活化(或者滅活)的DNA序列。沉默子和阻遏子是抑制基因表達的控制元件；它們對基因的作用與它們的方向或者與基因的距離無關。MAR是結合核支架的DNA內序列；它們能夠通過將染色體分離成調控結構域影響轉錄。據認為MAR介導染色體內高級的環結構。轉錄終止子是基因鄰近區域，在此RNA聚合酶從模板釋放。復制起點是在DNA合成或者細胞分裂的復制期基因組開始DNA復制過程的區域。減數分裂重組熱點是基因組比減數分裂期間平均值更頻繁重組的區域。復制子體內作為DNA復制的自主、自我復制單位的任意遺傳元件(例如，質粒，染色體，病毒)。樣品代表整體的一部分、一塊或者片段。該術語包括任意物質，包括例如從動物、植物或者環境獲得的樣品。"環境樣品"包括從室內或者室外環境中無生命的物體或者儲庫(reservoir)中獲得的樣品。環境樣品包括，但不限于土壤，水，灰塵和空氣樣品；大體積樣品，包括建筑材料，家具和垃圾填埋物；和其他儲庫樣品，例如動物垃圾，收獲的谷物和食品。"生物樣品"是從植物或者動物對象獲得的樣品。此處使用的生物樣品包括可用于檢測對象病毒感染的所有樣品，包括但不限于細胞，組織和體液，例如血液；血液的衍生物和部分(例如血清)；提取的膽汁；活組織切片或者手術去除的組織，包括例如，未固定的、冷凍的、福爾馬林固定的和/或埋入石蠟的組織；淚液；乳汁；皮膚刮擦物；表面沖洗物；尿液；痰液；腦脊液；前列腺液；膿；骨髓抽吸物；BAL;唾液；子宮頸拭子；陰道拭子；和口咽洗滌物。序列同一性兩個核酸序列或者兩個氨基酸序列之間的相似性，根據序列之間的相似性表達，還稱為序列同一性。序列同一性經常根據百分比同一性(或者相似性或者同源性)來測量；百分比越高，兩個序列越相似。用于比較的序列比對方法是本領域公知的。不同的程序和比對算法描述于Smith和Waterman(Adv.Appl.Math"2:482,1981);Needleman禾口Wunsch(J.Mol.Biol"48:443，1970);Pearson禾口Lipman(Proc.Natl.Acad.Sci.,85:2444,1988);Higgins禾口Sharp(Gene,73:237-44,1988);Higgins和Sharp(CABIOS,5:151-53,1989);Corpet等人(Nuc.AcidsRes"16:10881-90,1988);Huang等人(Comp.Appls.Biosci"8:155-65,1992);和Pearson等人(Meth.Mol.Biol"24:307-31,1994)。Altschul等人(NatureGenet.,6:119-29，1994)提出了序列比對方法和同源性計算的詳細考慮因素。比對工具ALIGN(Myers和Miller,CABIOS4:11-17,1989)或者LFASTA(Pearson禾口Lipman,1988)可用于進行序列比較(InternetProgram1996,W.R.PearsonandtheUniversityofVirginia,"fasta20u63，，version2.0u63,出廠日期1996年12月)。ALIGN比較彼此的完整序列，而LFASTA比較局部相似的區域。在因特網的NCSA站點上現有這些比對工具和它們各自的教學軟件。或者，為了比較大于大約30個氨基酸的氨基酸序列，可以使用"Blast2sequences"功能，用默認BLOSUM62矩陣設置為默認參數，(空位開放罰分ll，每個殘基空位罰分l)。當比對短肽(少于約30個氨基酸)時，應使用"Blast2sequences"功能進行比對，采用PAM30矩陣設為默認參數(開放空位9，延伸空位1罰分)。BLAST序列比較系統是可用的，例如，來自NCBI站點；還可參見Altschul等人，J.Mo/.215:403-10,1990;Gish禾卩States,7Va^re3:266-72,1993;Madden等人，Meth.Enzymol.，266:131-41，1996;Altschul等人，NucleicAcidsRes.,25:3389-402，1997;和Zhang和Madden,Ge"o/we,7:649-56,1997.在一些情況下蛋白的直向同源物(等同于其他種類的蛋白)表征為具有超過75%的序列同一性，所述序列同一性利用設置到默認參數的ALIGN,與特定蛋白的氨基酸序列進行全長比對算出。當利用這種方法評估時，與參照序列具有更高相似性的蛋白將顯示同一性的百分比增加，例如至少80%，至少85%，至少90%，至少92%，至少95%，或者至少98%的序列同一性。此外，可以對已公開的融合蛋白的一個或者兩個結合結構域的全長比較序列同一性。當顯著小于完整序列進行序列同一性比較時，同源序列在10-20短窗口(shortwindows)上將通常具有至少80%的序列同一性，可能具有至少85%，至少90%，至少95%，或者至少99%的序列同一性，取決于它們與參照序列的相似性。可以使用LFASTA確定這類短窗口上的序列同一性；方法描述于NCSA站點。本領域技術人員清楚這些序列同一性范圍只提供指導；完全有可能獲得超出所提供范圍的非常顯著的同系物。與對蛋白描述的相同，相似的同源性概念適用于核酸。兩個核酸分子緊密相關的另一種表示是兩個分子在嚴謹條件下彼此雜交。因為遺傳密碼的簡并性，不顯示高度同一性的核酸序列仍可能編碼相似的氨基酸序列。應了解利用這種簡并性可以造成核酸序列的變化以產生多重核酸序列，所述多重核酸序列各編碼基本上相同的蛋白。特異結合劑一種基本上只結合指定靶的試劑。因此蛋白特異結合劑基本上只結合指定蛋白，或者蛋白內的特定區域。此處使用的蛋白特異結合劑包括基本上結合特定多肽的抗體和其他試劑。抗體可以是對多肽特異的單克隆或者多克隆抗體，以及其免疫有效部分("片段")。通過使用或者調節常規步驟，可以輕易地確定特異試劑基本上只結合特異多肽。利用Western印跡步驟的合適的體外分析實例包括IFA和Ag-ELISA，在許多標準文本中有描述，包括Harlow和Lane,抗體應用實驗室手冊(UsingAntibodies:ALaboratoryManual),CSHL,NewYork,1999。轉化"轉化"細胞是其中通過分子生物學技術已經導入核酸分子的細胞。該術語包括可以將核酸分子導入這類細胞的所有技術，包括利用病毒載體轉染，利用質粒載體轉化，和通過電穿孔導入裸DNA，脂質體轉染，和粒子槍加速。載體作為導入宿主細胞的核酸分子，從而產生轉化的宿主細胞。載體可以包括允許其在宿主細胞中復制的核酸序列，例如復制起點(參與啟動DNA合成的DNA序列)。載體還可以包括一種或者多種選擇性標志基因和其他本領域已知的遺傳元件。病毒在活細胞內復制的微小感染性生物體。病毒通常基本上由一個蛋白被膜包圍的單核酸核組成，具有只在活細胞內復制的能力。"病毒復制"是通過至少一個病毒生活周期發生的其它病毒的產生。病毒可以摧毀宿主細胞的正常功能，造成細胞表現為病毒決定的方式。例如，病毒感染可能導致細胞產生細胞因子，或者對細胞因子應答，而未感染的細胞通常不會這樣。盡管與此處描述的相似或者等同的方法和材料可用于本發明的實踐或者檢驗，但合適的方法和材料在下面描述。所有此處提及的出版物、專利申請、專利和其他參考文獻在此完整引入作為參考。在不一致的情況下，以本說明書為準，包括術語的解釋。此外，材料、方法和實例只是說明性的，而不是為了限制。教個實嚴方式游撒迷此處第一個實施方式提供的是重組狂犬病病毒基因組，包括SEQIDNO:l(全長ERA序列)所示的核酸。還提供該基因組編碼的分離的狂犬病病毒蛋白，包括包含下列序列所示的氨基酸序列的特定蛋白SEQIDNO:2(N蛋白)；SEQIDNO:3(P蛋白)；SEQIDNO:4(M蛋白)；SEQIDNO:5(G蛋白)；或者SEQIDNO:6(L蛋白)；和編碼這類蛋白的分離核酸分子。舉例來說，這類分離的核酸分子包括下列所示的核苷酸序列SEQIDNO:l的核苷酸71-1423(N蛋白)；SEQIDNO:l的核苷酸1511-2407(P蛋白)；SEQIDNO:l的核苷酸2491-3104(M蛋白)；SEQIDNO:l的核苷酸3318-4892(G蛋白)；或者SEQIDNO:l(L蛋白)的核苷酸5418-11,801。還提供具有SEQIDNO:7所示核酸序列的重組病毒基因組，其不同于SEQIDNO:l，因為在G基因和psi-區之間的polyAtract上缺失一個腺苷殘基。SEQIDNO:7還編碼如SEQIDNO:2-6所示的蛋白。還提供ERA病毒株衍生物的基因組，如SEQIDNO:8-18所示。在某些實施方式中，基因組存在于載體中，例如質粒。另一個描述的實施方式是使用此處描述的方法測序全長狂犬病病毒基因組的系統。還描述了用于異源蛋白表達的病毒載體系統。另一個實施方式提供包括此處提供的一種或者多種核酸分子，或者一種或者多種蛋白的組合物。任選的，這類組合物包含藥學上可接受的載體，佐劑，或者其兩種或更多種的組合。還提供在對象中引發針對抗原表位的免疫應答的方法，包括給對象導入包括此處描述的核苷酸、肽或者多肽的組合物，從而在對象中引發免疫應答。本公開的另一個方面涉及用于產生重組狂犬病病毒的載體系統。該載體系統包括第一載體(轉錄載體)，包含全長狂犬病病毒反基因組DNA(或者其衍生物)，和一組輔助載體，包含編碼至少一種狂犬病病毒株ERA蛋白的核酸。轉染宿主細胞中載體的表達引起活的重組狂犬病病毒的產生。在某些實施方式中，反基因組DNA是ERA株(例如，SEQIDNO:l或者SEQIDNO:7)或者其衍生物，例如SEQIDNO:8-18中的一種。在某些實施例中，載體是質粒。為了促進全長病毒RNA的恢復，轉錄載體可以包括，按5'到3'方向錘頭核酶；狂犬病病毒反基因組cDNA;和丁型肝炎病毒核酶。選擇錘頭核酶的核苷酸與狂犬病病毒的反義基因組序列互補。反基因組cDNA的轉錄受至少一個CMV啟動子和噬菌體T7RNA聚合酶啟動子的轉錄調控，通常是在這兩個啟動子的控制下。輔助載體通常包括包含編碼狂犬病病毒N蛋白的多核苷酸序列的載體；包含編碼狂犬病病毒P蛋白的多核苷酸序列的載體；包含編碼狂犬病病毒M蛋白的多核苷酸序列的載體；包含編碼狂犬病病毒L蛋白的多核苷酸序列的載體；和包含編碼噬菌體T7RNA聚合酶的多核苷酸序列的載體。在一個實施方式中，T7RNA聚合酶包括核定位信號(NLS)。任選的，載體系統還包括包含編碼狂犬病病毒G蛋白的多核苷酸序列的載體。編碼狂犬病病毒P、M、L或G蛋白或者T7聚合酶的一種或者多種多核苷酸序列的轉錄受CMV啟動子和T7啟動子二者的轉錄調控。相反，編碼狂犬病病毒N蛋白的多核苷酸序列的轉錄受T7啟動子的轉錄調控，并且轉錄是帽-非依賴性的(cap-independent)。另外一種實施方式是活狂犬病疫苗，每種都包括此處提供的重組狂犬病病毒基因組。這類重組狂犬病基因組的實例包括ERAG333(SEQIDN0:13)所示序列；ERA2G(SEQIDNO:8)所示序列；和此處ERA2G333(SEQIDNO:IO)所示序列。任選的，狂犬病疫苗是減毒的。還提供一種產生活狂犬病病毒(例如，用于免疫原性組合物，例如疫苗)的方法，通過將載體系統導入宿主細胞。在載體系統轉染到合適的宿主細胞中后，活的和任選減毒的病毒被恢復。通過這類方法產生的活狂犬病疫苗的制備和給藥也是本文所預期的。還公開了一種接種對象抗狂犬病的方法，該方法包括向對象施用有效量的根據提供的說明所述的活狂犬病疫苗，使對象的細胞感染狂犬病疫苗，其中在對象中產生抗-狂犬病免疫應答。在一個實施方式中，對象是人。在另一個實施方式中，對象是非人動物。例如，在有些情況下非人動物是貓，狗，大鼠，小鼠，蝙蝠，狐貍，浣熊，松鼠，負鼠，山狗或者狼。在某些實施方式中，狂犬病疫苗腸道給藥。例如，在一些情況下腸道給藥包括口服給藥。口服給藥包括例如通過為接種野生動物群接種而設計的食物誘餌進行給藥。還提供包括所述活狂犬病疫苗(例如，減毒的活狂犬病疫苗)和藥學上可接受的載體或者賦形劑的藥物組合物。K游完微犬諒癆毒虜翻歸旅為了便利全長ERA基因組的測序，開發了一種對全長負鏈RNA病毒進行測序的方法。該方法適合于狂犬病病毒屬的測序，例如狂犬病病毒，以及其他負鏈RNA病毒。狂犬病病毒是單負鏈RNA病毒，具有大約12kb的基因組，范圍在11,918(澳大利亞蝙蝠狂犬病病毒屬)和11,940(Mokola病毒)個堿基之間。GENBANK中提供的狂犬病病毒核酸序列主要集中于編碼下述蛋白的序列--核衣殼蛋白(N)，糖蛋白(G)，磷蛋白(P)和基質蛋白(M)基因，它們接近基因組的3'端。現有的種系發生分析主要基于N和G基因。但是，對于關系較遠的狂犬病病毒株，RNA依賴性RNA聚合酶(L)基因是用于種系發生分析的最合適候選者。令人遺憾地，公共基因數據庫中很少提供L基因序列。此外，據認為狂犬病病毒末端的前導區和trailer區對病毒轉錄和復制(的調節)非常重要。這些可能是例如用于核蛋白包裝的保守區域或者L/P蛋白的結合位點。在前導-N，N-P,P-M，M-G,假-基因區和G-L中的基因間區域還作為病毒轉錄啟始的信號。因此，不僅編碼區域，而且病毒基因組內的非編碼區域，都可以用于種系發生分析或者進化研究。利用此處提供的全基因組測序方法，這些序列都可以更容易地進行分析。該方法包括單步逆轉錄和二步克隆進合適的載體。該方法在載體中產生容易測序的基因組，無需進行易出錯的反復RT-PCR反應。利用在狂犬病基因組末端發現的反向重復(和其他狂犬病病毒屬的基因組)，已經設計出通用引物，并在此處描述用于此處所述的快速全基因組測序步驟。狂犬病病毒的前導和trailer區包含用于病毒轉錄和復制的信號。基于對GenBank提供的基因組序列的分析，在狂犬病病毒或者狂犬病相關病毒包括Mokola病毒中，末端11個核苷酸是嚴格保守的。此處提供的測序方法原理基于末端11個互補核苷酸。因為這兩種11個核苷酸的序列是互補的，它們不能用于后續PCR反應。應了解，具有反向重復的其他病毒利用對應于所述重復的引物能夠類似地進行擴增。該11個反基因組有義核苷酸被設計為用于純化的ERA基因組的逆轉錄引物，其完整性通過大小比較和Northern印跡進行驗證。利用N,P，M，G，L基因探針和11個核苷酸作為寡核苷酸探針，其只結合基因組RNA而不是病毒mRNA，通過Northern印跡確認全基因組cDNA。利用精心設計的保守末端序列對應引物，完全可以在一個反應中逆轉錄狂犬病病毒全基因組，條件是病毒基因組制備物的質量要高。ERA序列與SAD序列密切相關，SAD序列是其衍生物。這并不奇怪，因為在1970年代ERA從CDC送到瑞士，在其被寄到德國前，在那里研究人員對它進行改造以便在細胞中生長，在德國它進一步衍生，并且衍生物在1990年左右被完全測序。迄今為止，根據血清交叉保護和遺傳研究，已經將狂犬病和狂犬病相關病毒分為7種不同類型典型狂犬病病毒1型(包括ERA)，2型(Lagos蝙蝠)，3型(Mokola)，4型(Duvenhage)，5型(歐洲蝙蝠狂犬病病毒屬[EBL]I)，6型(EBLII)和7型(澳大利亞蝙蝠病毒)。序列分析在下列領域起著重要作用系統發生學、進化研究、基因功能預測研究和其他相關領域，包括定位病毒轉錄和復制調控區域，因此生物信息學趨向于潛在的治療藥物。本領域普通技術人員已經知道，隨著逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)技術的發展，現在在一個反應中多達12kb以上的RNA逆轉錄為cDNA是相對容易的。在優化條件下，PCR可以在一個反應中擴增大于30kb的靶。利用此處提供的產生全長病毒基因組序列的方法，尤其是狂犬病基因組序列，分析不同病毒株現在已成為現實。利用得到的全長基因組還能夠有效設計減毒病毒，例如用于免疫刺激組合物和疫苗的免疫作用或者生產。不存在"通用"狂犬病病毒基因組，但這些基因組是相關的。在不同類型中相似性從60%到100%。一些區域，例如L基因，似乎更保守，而其他區域，例如不編碼多肽的psi區，是更可變化的。不僅狂犬病和狂犬病相關病毒漂變，而且任意RNA病毒也將隨時間變化。病毒如何改變和出現仍是未解決的問題。因此，全基因組序列分析對于進化、致病性和基因功能研究是重要的。就涉及全基因組測序而言，此處描述的該系統是用于狂犬病病毒的第一個。相信其適合其他RNA病毒，尤其在狂犬病病毒屬中。目前，對于狂犬病病毒種系發生研究，科學家只利用N，P或者G基因，它們在被感染的細胞或者組織中是最豐富的。已知對于關系較遠的株的比較，包括大半基因組的L基因可能是一個理想的候選位點，應該被使用。令人遺憾地，由于只有非常有限的資料可以利用，這類進化比較是不可能的，更不用說全基因組序列了。還是對于病毒轉錄和復制研究來說，據推測位于基因組3'和5'末端的前導和trailer區起著重要作用。基因間區域還是病毒反式和順式研究的信號。所有這些數據是相當有限的，因為它們不包括在mRNA內。只有全基因組序列可以提供這個水平的必要信息。全基因組測序不僅可用于疫苗開發，它還適用于基本的病毒轉錄和復制研究。它還可應用于開發siRNA和基因治療。扁基鵬游利用此處描述的方法，已經產生ERA狂犬病病毒基因組的唯一序列。該序列顯示于SEQIDNO:l。在基因組下列位置編碼ERA狂犬病病毒的5種蛋白(SEQIDNO:2-6):N,71-1423;P,1511-2407;M,2491-3104;G,3318-4892;和L,5418-11801。ERA和SAD-B19之間的同源性分別是:N99.56%，P98.65%，M96.53%，G99.05%和L99.20%。ERA和SAD-B19之間的一個特定差異是G和假基因之間的基因間區域，SAD-B19G轉錄終止/多腺苷酸化信號被破壞。ERA狂犬病病毒全基因組序列是利用反向遺傳學進行疫苗開發和致病性研究的先決條件。F//.^f產f瘋毒游汰眾,統實施例6和7提供了用于產生ERA病毒的一組優化條件，其中滴度高達每mll01Qffu。在生物反應器中，恢復的病毒可以生長到109到101Qffu/ml。這種高生產水平對于口服疫苗開發是最為重要的，這樣可以在合理時間段內利用合理的資源分配產生足夠的疫苗材料。對于親代和重組ERA株來說，提供的生長條件可以穩定產生這種高病毒滴度。這些生產數據對于潛在的狂犬病口服疫苗開發非常重要。F///.^f產全G-靂毒游557-G激應系盡管先前已經從BHK細胞拯救了缺失G蛋白的RV株，但用缺失G蛋白的ERA株病毒仍然是不可能的。在小鼠腦內或者肌內接種ERA-G后，沒有小鼠死亡或者顯示任何狂犬病癥狀。只有補充糖蛋白，ERA-G(不含糖蛋白)才能在細胞中生長。另外，突變的病毒不能傳播。為了幫助ERA-G生長，建立了BSR-G細胞系，其組成性表達ERA糖蛋白。在下面的實施例中描述該細胞系的產生。該細胞系用于RV株的恢復，例如在缺乏G下難以恢復的ERA-G，以及用于優化其他株的恢復。/X工薦眾汪犬瘋諒毒疫度浙#薪歪^表達游及/^遺傳系統直接通過分子生物學方法不易操縱RNA。傳統的RNA病毒疫苗來自天然減毒的分離物，其難以控制并造成不可預測的結果。反向遺傳技術使操縱RNA病毒成為DNA成為可能，其可以根據精心設計被突變、切除或者重建。每個基因功能都可以仔細、獨立和一致地研究，這有利于疫苗開發。反向遺傳學涉及將RNA病毒基因組逆轉錄成cDNA，并且克隆入載體，例如質粒。在轉染宿主細胞后，載體被轉錄成RNA，被結構蛋白質包裝，所述結構蛋白質還可以由質粒提供。包裝的RNA形成核糖核蛋白復合物，這導致可以被恢復的病毒顆粒。盡管已經公開了用于狂犬病病毒(RV)反向遺傳學的3個系統(Schnell等人，TheEMBOJ.13,4195-4203,1994;Inoue箏乂，P7ro/.M"W,107,229-236,2003;Ito等乂，MZc威o/./mm,/.47,613-617,2003)，但這些系統不易適應其他株。目前，即使當病毒株之間是緊密相關的，也沒有狂犬病病毒株借助不同病毒株的輔助質粒而恢復。因此，對于任意特異病毒株突變或者疫苗開發來說，必須開發一種特定處理系統。ERA株是用于狂犬病口服疫苗開發的合適候選物，但其殘余致病性是明顯的。在1970年代間，對ERARV進行了廣泛的疫苗開發(Black和Lawson，Can.Com/.M/.44:169-176，1980;Charlton，禾卩Casey,Ca".b.20:168-172,1978;Lawson,禾口C麗ley，C肌版36:339-344,1972)。ERA和SAD-B19均起源于SAD。在初期口服疫苗試驗中，SAD-B19在浣熊和臭鼬中均是有效的，而ERA不是。此外，在動物試驗中證實，ERA殺死腦內(i.e.)給藥的兩周齡小鼠。這些觀察引起這兩種RV株之間關系和微細改變的潛在影響的疑問。根據全病毒基因組序列比較，ERA和SAD-B19共享極高的核苷酸同一性和氨基酸同源性。為了闡明狂犬病病毒這些高度相關株的免疫原性和致病性的遺傳基礎，開發出一種針對ERA的有效反向遺傳系統，其不同于先前報道的針對狂犬病病毒的反向遺傳系統。此處公開的狂犬病反向遺傳系統可用于各種目的，包括(1)以指定方式減毒ERA病毒用于疫苗開發；(2)產生ERA病毒載體用于表達異源ORF(例如，在治療組合物的情況下，例如疫苗和基因治療)；(3)確定ERARV發病機理的遺傳基礎；和(4)確定ERA和SAD病毒之間遺傳差異的生物學影響。反向遺傳系統具有下列特征中的一些或者全部，利用示范性ERA株反基因組cDNA，示意性圖示于圖1A。該系統基于一個全長轉錄質粒外加多個輔助質粒(例如，5個輔助質粒)。輔助質粒編碼N、P、L蛋白，和任選的G蛋白，以及T7聚合酶。盡管G蛋白不是病毒拯救必需的，但當包括在轉染中時，它改善病毒恢復效率或者病毒出芽。轉錄涉及細胞RNA依賴性RNA聚合酶II，其是哺乳動物細胞中現有的，和T7RNA聚合酶，其由pNLST7質粒提供。這兩種聚合酶使病毒恢復率又高又穩定。在轉錄質粒中，錘頭和丁型肝炎病毒核酶在狂犬病病毒(例如，ERA株)反基因組cDNA的側翼，通過轉錄能夠產生可靠的反基因組vRNA的5'和3'末端。將錘頭序列的前10個核苷酸設計成與反義基因組序列的前IO個核苷酸互補。例如，對于ERA反基因cDNA來說，錘頭序列的前IO個核苷酸是TGTTAAGCGT(SEQIDNO:19)。己經建立兩種修飾的T7RNA聚合酶構建體，它們比先前應用的野生型T7RNA聚合酶更有效地支持病毒恢復。一種T7RNA聚合酶已經從第一個ATG突變到AT。第二種T7RNA聚合酶具有源自SV40病毒大T抗原的八氨基酸核定位信號(NLS)，融合在親代T7的第一個ATG后ATGCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGAA(SEQIDNO:20)。NLS有下劃線。NLS的添加導致T7RNA聚合酶主要存在于細胞核中。按照NLS修飾質粒的轉染機理，DNA/轉染劑復合物與細胞表面結合。通過胞吞作用，復合物被攝入內體/溶酶體，DNA被釋放入胞漿。在沒有NLS的情況下，大多數轉染的質粒保留在胞漿中，只有小百分比釋放的DNA到達細胞核，在那里其轉錄成RNA。在蛋白合成后，NLST7RNA聚合酶被轉運回細胞核，細胞核中的輔助質粒(含T7/CMV啟動子)將通過NLST7和細胞聚合酶II轉錄。因此，更多輔助質粒的mRNA和全長pTMF的cRNA或者其衍生物被合成，引起高效的病毒恢復。在NLST7通過CMV啟動子的初始表達后，NLST7聚合酶結合pT7進行NLST7基因的轉錄。通過在細胞核中轉錄物的修飾，更多NLST7mRNA被合成，引起NLST7聚合酶的更多表達。NLST7聚合酶以及全長反基因組轉錄單位的pT7受NLST7聚合酶的控制，其充當"自身基因"。NLST7RNA聚合酶的自身基因機理圖示于圖2。在T7RNA聚合酶在細胞核中表達后，轉染的T7構建體繼續轉錄全長RNA模板用于N蛋白包裝和/或L蛋白結合，增強病毒恢復效率。T7聚合酶，和所有其他質粒，除了編碼N蛋白的質粒pTN夕卜，都處于CMV和T7轉錄調控元件二者的控制之下。編碼N蛋白的核酸受T7啟動子控制，并基于IRES(InternalRibosomeEntrySite,內部核糖體進入位點)按照帽-非依賴性的方式被翻譯。如果所有質粒在CMV啟動子(19)的控制下克隆，則細胞RNA聚合酶II獨自就可以輔助RV的恢復。在此處公開的ERA反向遺傳系統中，只有pTN受T7啟動子控制并以帽-非依賴性的方式翻譯。所有其他構建體受CMV和T7轉錄調控元件二者的控制。通常，在RV中，N合成是豐富的，N、P和L之間的比例是大約50:25:1。為了在RV反向遺傳中模擬野生型病毒轉錄和組裝，N表達應該是最高的。借助于NLST7聚合酶和IRES翻譯模式，質粒轉染后N蛋白被有效表達。這減少了與宿主細胞中持家基因對轉錄的競爭，因為哺乳動物細胞中不存在T7轉錄起始信號，并導致T7轉錄效率的增加。為了增強病毒蛋白的產生，可以構建輔助質粒以摻入Kozak序列，為了每種蛋白編碼序列的翻譯效率，所述Kozak序列己經優化。示范性的優化Kozak序列顯示于表2。表2:優化的Kozak序列.<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>CMV/T7表示CMV啟動子在pT7啟動子之前。HdRz代表錘頭核酶，而HDVRz是丁型肝炎病毒核酶。pTMF是全長轉錄質粒，pTN、pMP、pMG、pML和pNLST7是輔助質粒。在ERA反向遺傳系統中轉染5天后，拯救的病毒可靠和可重復地(repatably)生長到107ffu/ml，無需進一步擴增。Z穀諒毒狂犬病病毒致病性的完整機理還沒有被完全表征，使得合理的疫苗設計成問題。例如，RV糖蛋白看來在狂犬病病毒的致病性和免疫原性中起作用。突變(例如在糖蛋白的333位)產生在成年小鼠中不造成致命感染的病毒(Ito等人，Microl./m聽"o/.38，479-482,1994;Ito等乂，J.F/ra/.75,9121-9128,2001)。但是，已經顯示RV糖蛋白的過表達引起凋亡和抗病毒免疫應答的增強(Faber等人，J.F/ra/.76,3374-3381,2002)。因此具有修飾(例如，去除，氨基酸取代)的G蛋白的ERA病毒株可以是用于疫苗開發的特定毒株。利用此處公開的反向遺傳系統，可以設計出具有有利性質的重組狂犬病病毒。在親代ERA株以外，此處公開的示范性重組病毒還包括，無Psi-區的ERA(ERA-)，ERAgreenl(在Psi-區插入的綠色熒光基因)，ERAgreen2(在P-M基因間區域克隆的綠色熒光基因)，ERA2g(在Psi-區包含G的額外拷貝)，ERAg3(G在333位氨基酸處突變)，ERA2g3(在Psi-區包含突變G的額外拷貝)，ERAgm(在基因組中M和G基因互換)，和ERAgmg(在重排的ERAgm構建體中G的兩個拷貝)。這些示范性株示意性圖解于圖3。具有去除和/或突變的糖蛋白的修飾株特別適合用作免疫原性組合物，用于狂犬病病毒的接觸前和后的治療，因為這類病毒不能在細胞之間傳播和造成疾病。此外，修飾的病毒例如ERA2g3，其因為編碼突變糖蛋白的序列的加倍而過表達G蛋白，被預測增強凋亡并引發增強的抗病毒免疫應答。例如，小鼠腦內和肌內接種G缺失(ERA-G)后，沒有觀察到不良事件。此外，ERA-G保護小鼠免受RV街毒株的致命攻擊。因此，ERA-G看起來是用于疫苗開發的ERA的更安全的株。此外，ERAG氨基酸333位的精氨酸突變為谷氨酸(從核苷酸AGA到GAG，和在ERAg3和ERA2g3株中一樣)，產生一種減毒病毒。減毒作用通過動物接種試驗得到證實。因為RVG的過表達引起凋亡和抗病毒免疫應答的增強，減毒病毒例如具有多拷貝G的ERA2g3作為疫苗候選物特別有利。此處描述的用于狂犬病疫苗開發的系統不限于G基因的修飾，而是可類似地應用于每種病毒蛋白。為了促進修飾不同蛋白組分的系統化方法，根據此處提供的序列數據，通過反向遺傳學可以解決致病性的詳細定位。此處描述的反向遺傳系統還使狂犬病病毒載體系統能夠用于外源(異源)的基因表達。所述的非限制性實施方式是基于ERA病毒。在整合到ERARV基因組后，此處顯示的額外轉錄單位是在兩個不同位置起作用的。在一個實施方式中，額外轉錄單位整合到psi區的位置(trans1)中。在另一個實施方式中，額外轉錄單位被插入RVP-M基因間區域。在單鏈負性RNA病毒中，基因組3'末端序列主要作為轉錄啟動子，而基因組5'末端序列作為復制啟動子(Conzelmann禾BSchnell，J.R>o/.68:713-719,1994;Finke箏乂，K^o/.71:7281-7288,1997)。因此，tmns2占據了導致比transl更強轉錄的位置，所述轉錄驅動ORF表達。因此，此處公開的載體可用于調節異源ORF的表達到所需水平，只需通過選擇ORF插入載體的位置。例如，當需要蛋白的高水平表達時，trans2通常是異源ORF插入的理想位置。類似地，如果需要更適中水平的表達，異源ORF可以插入trans1。無需過度實驗，本領域技術人員就能確定對于每個ORF和特定應用來說的最適表達水平。因此，此處提供的病毒載體是用于外源基因插入和表達的優異構建體，正如此處根據綠色熒光蛋白基因的表達所證實的那樣。盡管所公開的載體的功用和效果是針對GFP進行證實的，但是應注意到該載200680038314.4說明書第43/63頁體同樣適用于表達感興趣的任何基因或者ORF。如所述，此處提供的基于狂犬病的異源表達系統可用于表達任何外源(異源)蛋白。尤其預期，舉例來說，這類異源基因來自于另一種病原生物，例如其他致病性病毒，例如SARS病毒，Nipah病毒，等等。此外，公開的載體可以用于輸送其他治療基因，包括例如，編碼具有治療價值的蛋白或者功能RNA分子，例如siRNAs。丑藥激浙競i^W激資合激及其I遂藥物組合物包括減毒的或者固定的拯救病毒，包括至少一個病毒表位的病毒核酸序列或者病毒多肽也包括在本公開中。這些藥物組合物包括治療有效量的一種或者多種活性化合物，例如減毒或者固定病毒，包含至少一個病毒表位的病毒多肽，或者一種或者多種編碼這些多肽的核酸分子，與藥學上可接受的載體結合。預期在某些實施方式中，包括多個病毒表位的病毒核酸序列或者病毒多肽將用于制備本公開的藥物組合物。此處公開的是適合用作免疫刺激組合物的物質，所述組合物用于病毒感染的抑制或者治療(接觸前或者接觸后)，例如，狂犬病病毒感染。在一個實施方式中，免疫刺激組合物包含減毒的或者固定的拯救(重組)病毒。在另一個實施方式中，組合物包含分離的或者重組的病毒多肽，所述多肽包括至少一種病毒表位(例如狂犬病病毒G蛋白)。在另一個實施方式中，免疫刺激組合物包含一種核酸載體，所述載體包括至少一種此處描述的病毒核酸分子，或者包括編碼至少一種病毒表位的核酸序列。在一個特定的、非限制性實施例中，編碼至少一種病毒表位的核酸序列在一個翻譯單位中表達，例如那些描述于公開的PCT申請PCT/US99/12298和PCT/US02/10764(兩篇均在此完整引入)。免疫刺激病毒、病毒多肽、編碼這類多肽的構建體或者載體，與藥學上可接受的載體或者賦形劑組合，用于作為免疫刺激組合物施用于人或者動物對象。免疫原性制劑可以方便地作為單位劑型，并利用常規藥物技術制備。這類技術包括將活性成分和藥物載體或者賦形劑結合的步驟。通常，通過將活性成分與液體載體均勻和緊密地結合來制備制劑。適于腸胃外給藥的制劑包括含水和不含水的無菌的注射溶液，其可以包括抗氧化劑，緩沖液，抑菌劑和溶質，所述溶質使制劑與目標接受者的血液等滲；以及含水和不含水的無菌懸浮液，其可以包括懸浮劑和增稠劑。制劑可以是單位劑量或者多劑量容器，例如，密封的安瓿和小瓶，并可以保存于冷凍干燥(凍干)條件，只需使用前即刻添加無菌液體載體，例如，注射用水。從本領域普通技術人員通常使用的無菌粉劑、顆粒和片劑可以制備即用注射溶液和懸浮液。在某些實施方式中，單位劑量制劑是包括給藥成分的劑量或單位，或者其合適的部分的制劑。應了解除了上面特別提及的成分外，此處包括的制劑還可以包含本領域普通技術人員經常使用的其他藥劑。此處提供的組合物，包括那些用作免疫剌激組合物的，可以通過不同的途徑給藥，例如口服，包括頰和舌下，直腸的，腸胃外，氣霧劑，鼻，肌內，皮下，真皮內和局部。它們可以不同形式給藥，包括但不限于溶液，乳液和懸浮液，微球，顆粒，微粒，納米顆粒和脂質體。根據給藥途徑，給藥的體積將不同。舉例來說，肌肉注射可以為大約O.lml到大約1.0ml。本領域普通技術人員將了解不同給藥途徑的合適體積。免疫刺激化合物(例如，疫苗)領域的較為近期的發展是直接注射編碼肽抗原的核酸分子(概述于Janeway&Travers,Immunobiology:TheImmuneSystemInHealthandDisease,13.25頁,GarlandPublishing,Inc.,NewYork,1997;禾卩McDonnell&Askari,五"g/.丄Med334:42-45，1996)。包括此處所述核酸分子的載體或者包括編碼病毒多肽的核酸序列的載體可以在這類DNA免疫方法中使用，所述病毒多肽包括至少一個病毒表位。因此，此處使用的術語"免疫刺激組合物"還包括核酸疫苗，其中編碼病毒多肽的核酸分子在藥物組合物中施用于對象，所述病毒多肽包括至少一個病毒表位。對于基因免疫來說，本領域技術人員已知的合適輸送方法包括直接肌肉注射質粒DNA(Wolff等人，Hum.Mo/.1:363,1992)，輸送與特定蛋白載體復合的DNA(Wu等人，J.腸/.C/zem.264:16985,1989)，DNA與磷酸鈣的共沉淀(Benvenisty和Reshef,Proc.Wa".JcfldSc/.83:9551,1986)，DNA在脂質體中的包裹(Kaneda等人，Science243:375，1989),粒子轟擊(Tang等人，Nature356:152,1992;Eisenbraun等人，DNACellBiol.12:791,1993)，和利用克隆逆轉錄病毒載體進行體內感染(Seeger等人，Proc.Wfl"cac/.<SW.81:5849,1984)。類似地，核酸疫苗制品可以通過病毒載體給藥。選擇各劑量免疫刺激組合物中免疫刺激化合物的量為誘導免疫刺激或者免疫保護應答，而沒有顯著的不良副作用。這種量將根據所使用的特異免疫原以及它如何呈遞而不同。初始注射可以從大約1到大約lmg，一些實施方式從大約10wg到大約800yg，其他實施方式從大約25"g到大約500ug。在免疫刺激組合物的初始給藥后，對象可以接受一次或者數次加強給藥，充分間隔開。加強給藥可以從大約1ug到大約lmg，其他實施方式從大約10yg到大約750yg，還有的其他從大約50Pg到大約500iig。間隔l-5年的周期性加強，例如3年，可以是合乎需要的，以保持所需水平的保護性免疫。還預期提供的免疫刺激分子和組合物可以間接施用于對象，通過體外首先刺激細胞，然后受刺激的細胞施用于對象以引發免疫應答。此外，藥物或者免疫刺激組合物或者治療方法可以與其他療法聯合給藥。含有免疫刺激組合物的食物-誘餌的制備也是本領域普通技術人員已知的。例如，含有活RV疫苗的食物誘餌的制備公開于Wandder等人(Rev.版10(suppl.4):649-653,1988),Aubert等乂(pp.219-243,inLvsssvimses(Rupprecht#Vl，編著),Springer-Verlag,NewYork,1994)，和Fu等乂(pp.607-617,inNewGenerationVaccines(2ndEdit.)(Levine箏乂，編著)，MarcelDekker，Inc.,NewYork,1997)，各文獻的完整公開均在此引入作為參考。此處還提供用于病毒感染檢測和/或診斷的試劑盒，例如感染狂犬病病毒或者其他狂犬病病毒屬。此處提供的分析試劑盒的實例是作為抗原的重組病毒多肽(或者其片段)和作為第二抗體的酶聯抗人抗體。這類試劑盒的實例還可以包括一種或者多種酶底物。如果來自對象的樣品包含抗病毒特異性蛋白的抗體，則這類試劑盒可用于檢測。在這類試劑盒中，合適量的病毒多肽(或者其片段)提供于一個或者多個容器中，或者附著在底物上。例如，病毒多肽可以提供在水溶液中或者作為冷凍干燥的或者凍干的粉劑。提供病毒多肽的容器可以是任何常規容器，即能夠保持供給形式，例如，微量離心管，安瓿或者瓶子。試劑盒提供的各多肽的量可以是任何合適的量，并可以取決于該產品針對的市場。例如，如果試劑盒適合于研究或者臨床用途，提供的各多肽的量將可能是足以進行數次分析的量。確定合適量的一般性指導可以參見，例如，Ausubel等人(編著)，分子生物學簡編(Wow/Vofoco/s!'wMo/ecw/ar5io/ogy),JohnWileyandSons,NewYork,NY，1999和Harlow和Lane，抗體應用實驗室手冊("/"gJ"WoAwJ丄aZ固^yMo7zwa/),CSHL,NewYork,1999。提供下列實施例以說明某些特定特征和/或實施方式。這些實施例不應解釋為將本發明限制于所述的特定特征或者實施方式上。實施例實施例1:ERARV的測序本實施例提供用于測序彈狀病毒全長基因組方法的說明，在該情況下尤其是狂犬病病毒。狂犬病病毒株ERA從CDC保藏獲得，并在幼倉鼠腎(BHK-21)細胞中繁殖。在37'C、5。/。C02孵箱中感染4天后，收集病毒并進行純化。簡單來說，收集細胞上清，在2,000rpm離心15分鐘以去除細胞碎片。澄清的上清進一步在18,000rpm離心1小時。沉淀團在PBS中重懸浮，進行狂犬病基因組RNA提取。按照制造商推薦的方案，利用Trizol試劑(GIBCOInvitrogen)從ERA感染的BHK-21細胞提取總RNA。利用Roche的高純度病毒RNA試劑盒，從濃縮的ERA病毒上清純化ERA基因組RNA。通過凝膠電泳和利用N、P、G和M雜交探針的Northern印跡，確認純化的ERA基因組RNA的完整性。簡單來說，5Pg基因組RNA加樣到變性RNA凝膠中，并轉移到尼龍膜用于雜交。按照制造商的說明書，利用Roche的DigDNA標記試劑盒對探針進行標記。狂犬病病毒5'反基因組的11個保守核苷酸被設計為逆轉錄引物。利用Invitrogen的第一鏈cDNA合成試劑盒進行RT反應。通過Northern印跡，利用N，P，M，和G探針雜交，以及11個保守寡核苷酸作為地高辛標記的寡核苷酸探針，確認來自ERA基因組的完整cDNA。選擇兩組引物用于PCR反應，其在兩個連續片段中擴增全ERA基因組。一組引物由5'反基因組末端的11個核苷酸組成，Le5:ACGCTTAACAA(SEQIDNO:24)禾卩BLp3:GTCGCTTGCTAAGCACTCCTGGTA(SEQIDNO:25)。另一組包含5'基因組末端的11個互補核苷酸，Le3:TGCGAATTGTT(SEQIDNO:26)和BLp5:GAGTGCTTAGCAAGCGACCT(SEQIDNO:27)。Blp3禾口Blp5引物位于狂犬病病毒基因組的相對保守區域。純化PCR片段并克隆入TOPO載體，所述載體購自Invitrogen。在ABI310測序儀上進行測序，利用Accelrys的BioEdit軟件或者SeqMerge軟件在GCG環境中對序列進行裝配。ERA基因組完整比對的序列如SEQIDNO:l所示。參照SEQIDNO:l，表3提供個體蛋白編碼序列的位置。N，P，M，G和L蛋白的氨基酸序列分別在SEQIDNO:2到6中提供。表3:狂犬病病毒ERA株的蛋白編碼序列的位置<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>該方法可用于狂犬病和狂犬病相關病毒。狂犬病和狂犬病相關病毒至少有7種推斷的類型。提供的序列方法還可以用于其他負鏈RNA病毒。這是因為幾乎所有的負鏈RNA病毒基因組在兩個末端均具有大約12個保守核苷酸，它們類似地可以用作RT-PCR的引物。對于不同的病毒種類引物當然會不同，普通技術人員根據此處的教導能夠確定特異引物的序列。實施例2:用于狂犬病病毒反向遺傳系統的質粒的構建本實施例描述用于狂犬病病毒的反向遺傳系統的設計和發展。狂犬病病毒株ERA從ATCC獲得，按描述的(Wu等人，J.KVo/.76,4153-4161，2002)進行制備。為了獲得病毒基因組全長病毒cDNA，BSR細胞(幼倉鼠腎，BHK，細胞的克隆)感染ERA株病毒，在補充10%胎牛血清的Dulbecco最低限必需培養基中生長。收集上清，在22,000g離心1小時。收集病毒沉淀團利用購自Qiagen(Valencia,CA)的RNA病毒提取試劑盒，按照制造商的說明書，用于病毒基因組RNA純化。通過凝膠電泳確認病毒基因組RNA的完整性。利用Invitrogen(Carlsbad,CA)的第一鏈cDNA合成試劑盒轉錄病毒基因組cDNA。應用逆轉錄(RT)反應混合物，通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增，分別用于全長病毒基因組cDNA、N、P、G和L基因的合成。為了組裝全長病毒基因組cDNA，按照圖IB示意性圖解的4個連續步驟構建pTMF質粒。SuperscriptIII逆轉錄酶和高保真platinumpfx聚合酶(Invitrogen,Carlsbad,Ca)用于cDNA轉錄產物合成和連續PCR擴增。對于逆轉錄反應，在RT反應混合物中使用1ug純化的基因組RNA，在5(TC孵育80分鐘，然后在85"加熱5分鐘以滅活SuperscriptIII。在RT反應后，添加1單位RNaseH以消化cDNA-RNA雜交物中的模板RNA。為了產生全長病毒基因組cDNA，通過RT-PCR擴增的兩個重疊片段如下片段1(Fl)利用下列引物進行RT-PCR擴增Le5-Kpn(CCGGGTACCACGCTTAACAACCAGATCAAAGA;SEQIDNO:28,下劃線為Kpnl識別位點)和Le3-Blp(TAGGTCGCTTGCTAAGCACTCCTGGTAGGAC;SEQIDNO:29,下劃線為Blpl識別位點)。片段2(F2)利用下列引物進行RT-PCR擴增Tr5-Blp(GTCCTACCAGGAGTGCTTAGCAAGCGACCTA:SEQIDNO:30，下劃線為Blpl識另U位點)禾卩Tr3-PstN0:31，下劃線為Pstl識別位點)。在成功合成上述兩個片段后，對Kpnl和Blpl限制性酶消化的Fl進行凝膠純化，并克隆到pBluescriptlISK(+)噬菌粒(Stratagene，LaJolla，Ca)，以形成pSKFl質粒。凝膠純化的F2片段，通過Blpl和Pstl切割，被連續克隆到pSKFl質粒以形成全長病毒反基因組cDNA。合成錘頭核酶(oligol,TATAGGAAAGGAATTCCTATAGTCGGTACCACGCT:SEQIDNO:32,下戈U線為Nhel和Kpnl識別位點；01igo2,ACGGACTCATCAGACGCTTAACAGCTAGCCTTG:SEQIDNO:33,下劃線為Kpnl和Nhel識別位點)，在5'端包含Nhel識別位點，在3'端包含Kpnl位點。這融合在F1片段5'端的前面。合成丁型肝炎病毒核酶(oligo3,GGAGGGCGCGGCCGCACTC;SEQIDNO:34,下劃線為Pstl和Notl識別位點；01igo4，ATGCCGACCCCTGCAGGTC:SEQIDNO:35,下劃線為Notl和Pstl識別位點)(Symons，iev.61:641-671,1992)，在其5，端具有Pstl位點，其3，端具有Notl位點，融合到F2片段的3，端。錘頭核酶和Fl片段之間的連接性Kpnl識別位點，和F2片段和丁型肝炎病毒核酶之間的Pstl位點，通過定點突變被去除。全長病毒反基因組cDNA被夾在錘頭和丁型肝炎病毒核酶之間。其被移出并克隆到pBluescriptlISK(+)噬菌粒以制備pSKF構建體。具有兩個核酶的完整病毒反基因組cDNA被融合到T7轉錄起始位點的下游，受pcDNA3.1/Neo(+)質粒(Invitrogen,Carlsbad,CA)中CMV立即早期啟動子的控制。這最后一個步驟完成pTMF質粒的構建。野生型ERA病毒基因組在G和Psi區之間的基因間區域包括8個殘基(polyAs)的polyAtract。為了從親代株區分拯救的ERA(rERA)病毒，通過去除一個A，將一段7A(polyA7)導入pTMF構建體，而不是原始的polyA8。在回收rERA病毒后，進行RT-PCR，隨后的序列數據證實導入的polyA7序列標記物的存在。pTN質粒利用引物(5N:ACCACdGGATGCCGACAAGATTG:SEQIDNO:36，下劃線為Ncol識別位點和起始密碼子；和3N:GGCCCATGG77MTGAGTCACTCGAATATGTCTT:SEQIDNO:37,下劃線為Ncol識別位點和終止密碼子)，通過RT-PCR擴增N基因，克隆至ljpCITE-2a(+)(帽-非依賴性翻譯增強子，G叩-IndependentIranslation旦nhancer)質粒(Novagen，MadisonWI)。pMP質粒利用引物(5P:TTGGTACCACC4rGAGCAAGATCTTTGTCAATC:SEQIDNO:38,下劃線為Kpnl識別位點和起始密碼子；和3P:GGAGAGGAATTCrTMGCAAGATGTATAGCGATTC:SEQIDNO:39,下劃線為EcoRl識別位點和終止密碼子)，通過RT-PCR擴增P基因，并克隆到pcDNA3.1/Neo(+)質粒。pMG質粒利用引物(5G:TTGGTACCACC4r(GTTCCTCAGGCTCTCCTG:SEQIDNO:40，下劃線為Kpnl識別位點和起始密碼子；和3G:AAAACTGCAGrC4CAGTCTGGTCTCACCCCCAC:SEQIDNO:41,下劃線為Pstl識別位點和終止密碼子)，通過RT-PCR擴增G基因，并克隆到pcDNA3.1/Neo(+)質粒。pML質粒利用引物(5L:ACCGCTAGCACCACC4rGCTCGATCCTGGAGAGGTC;SEQIDNO:42,下劃線為Nhel識別位點和起始密碼子；禾B3L:AAAACTGCAGrC4CAGGCAACTGTAGTCTAGTAG;SEQIDNO:43,下劃線為Pstl識別位點和終止密碼子)，通過RT-PCR擴增L基因，并克隆到pcDNA3.1/Neo(+)質粒。pT7質粒按照制造商的說明書，利用Dneasy組織試劑盒(Qiagen,Valencia,CA)，從細菌BL-21(Novagene,Madison，WI)提取基因組DNA。利用弓|物(5T7:TCGCTAGCACCACCK7AACACGATTAACATCGCTAAG;SEQIDNO:44,下劃線為Nhel識別位點和起始密碼子；和3T7:GATGAATTCr度GCGAACGCGAAGTCCGACTC:SEQIDNO:45,下劃線為EcoRl識別位點和終止密碼子)，通過PCR從純化的基因組DNA擴增T7RNA聚合酶基因并克隆到pcDNA3.1/Neo(+)質粒。pNLST7質粒源自SV40大T抗原的8氨基酸核定位信(NLS)，利用pT7質粒作為模版，和引物(5T7NLS:GATTAACATCGCTAAGAAC;SEQIDNO:46,下劃線為NLS，禾口3T7引物)，通過PCR擴增添加到T7RNA聚合酶的N端。擴增的片段命名為NLST7，被克隆到pcDNA3.1/Neo(+)，形成pNLST7構建體。pGFP質粒Monster綠色熒光蛋白(GFP)質粒phMGFP購自Promega(Madison,WI)。禾U用引物(GFP5:AAAACTGCAGGCCACC4rGGGCGTGATCAAG:SEQIDNO:47,下劃線為Pstl識別位點和起始密碼子；和GFP3:CCGCTCGGTACCTA77MGCCGGCCTGGCGGG:SEQIDNO:48,下劃線為Kpnl識別位點和終止密碼子)，通過PCR擴增GFP基因，并克隆到pcDNA3.1/Neo(+)質粒。對所有質粒構建體至少測序3次，以證實不存在克隆后預料不到的突變或者缺失、定點突變或者基因缺失。此外，證實了糖蛋白和Psi區之間存在由polyAtract組成的標記序列，而不是野生型ERA基因組中觀察到的8個殘基，所述polyAtmct具有7個腺苷殘基。實施例3:BSR細胞中的T7RNA聚合酶表達本實施例證明，向噬菌體T7RNA聚合酶添加核定位信號，指導聚合酶在轉染細胞的細胞核中表達。按照Wu,等人(J.Virol.76,4153-4161,2002)的描述進行BSR細胞的轉染。簡單來說，6孔板中接近80%匯合的BSR細胞每孔分別用0.5gpT7或者pNLST7質粒轉染。在轉染后48小時，細胞用80%冷丙酮固定1小時，并在室溫下干燥。依次添加抗T7RNA聚合酶的小鼠單克隆抗體和山羊抗小鼠的IgG-FITC偶聯物，并在兩步驟間接熒光染色法程序中洗滌。在UV顯微鏡檢查后記錄結果。觀察到pT7表達的無核定位信號的T7RNA聚合酶主要在胞漿中，而包含核定位信號的NLST7聚合酶主要存在于細胞的細胞核中。這些結果表明NLS的添加有效地將T7RNA聚合酶耙定到轉染細胞的細胞核。實施例4:組成性表達ERA糖蛋白的BSR細胞系的建立本實施例描述組成性表達ERA糖蛋白的BHK細胞系的設計和產生。利用Flp-InTM系統(Invitrogen，Carlsbad,CA)構建表達ERA糖蛋白的BHK細胞系。簡單來說，轉染前，Flp-InTM-BHK細胞(含有單一整合的Flp重組靶位點)在一個6孔板中生長到大約20%匯合，并在補充100yg/mlZeocin的普通DMEM培養基中維持。利用pMG質粒作為模版，用引物EF5G5(CACCATGGTTCCTCAGGCTCTCCTG;SEQIDNO:49)和EF5G3(TCACAGTCTGGTCTCACCCCCAC;SEQIDNO:50)通過PCR擴增ERAG基因，并克隆到pEF5/FRT/V5-D-TOPO載體(Invitrogen,Carlsbad,CA)，以產生pEFG構建體。表達Flp重組酶的pOG44質粒和pEFG—起，以10:1的比例共轉染Flp-InTM-BHK細胞。轉染后，細胞在無Zeocin、但含有400wg/ml潮霉素B的DMEM中維持。48小時后，劃開細胞使次日發生的匯合不超過20%。細胞在潮霉素B選擇性培養基中在37'C生長大約1周。利用人抗-G單克隆抗體和山羊抗人IgG-FITC偶聯物，通過間接熒光染色法檢測靶ERAG的表達。組成性表達G的細胞系被命名為BHK-G，用于生長ERA-G病毒。實施例5:狂犬病病毒Evelyn-Rokitnicki-Abelseth(ERA)株的限定修飾除了上述的親代ERA病毒株外，利用此處公開的反向遺傳系統開發了衍生病毒株。產生了數個示范性的修飾病毒，即ERA-(完整psi-區的缺失)，ERAgreenl(綠色熒光蛋白基因插入ERA病毒基因組psi區)，ERAgreen2(綠色熒光蛋白基因插入磷蛋白和基質蛋白的基因間區域)，ERA2g(在psi-區包括糖蛋白的額外拷貝)，ERAg3(在糖蛋白氨基酸333位具有突變)，ERA2g3(在psi-區Aa333具有突變糖蛋白的額外拷貝)，ERA-G(去除糖蛋白)，ERAgm(基因組中M和G基因互換)，和ERAgmg(重排ERAgm構建體中G的兩個拷貝)。這些衍生物示意性圖解于圖3。通過優化所述的生長條件，在組織培養瓶和生物反應器中，所有的拯救病毒都可以達到109到1(Tffu/ml的病毒滴度。反向遺傳系統中的基因缺失和定點突變ff犬瘋瘃毒^^基歷蘊i^',游欽關狂犬病病毒ERA基因組的完整Psi-區如下被刪除利用pTMF作為模板，用引物(5Axj/:AG;SEQIDNO:51，下劃線為Pstl和Kpnl識別位點；和Le3-Blp引物)，通過PCR擴增3，A\|/片段，并克隆到pCR-Bluntll-TOPO載體(Invitrogen,Carlsbad,CA)，用于pPA5v(/質粒的構建。利用相同的模板，用引物(SnaB5:ATGAACTTTCTACGTAAGATAGTG:SEQIDNO:52,下劃線為SnaBl識別位點；和3Av|/:G;SEQIDNO:53,下劃線為Pstl識別位點)，通過PCR擴增5'A\|/片段，連續克隆到上述pPA5v質粒，完成pPAy質粒的構建。通過SnaBl和Pstl限制性酶消化pP△W質粒回收的片段，取代pSKF構建體中的對應物以制備pSKFAnr質粒。通過用Nhel和Notl消化pSKF△V質粒得到的包含ERA基因組cDNA的全DNA片段，被重新克隆到pcDNA3.1/Neo(+)質粒，完成pTMFAv的構建。為了驗證缺失Psi的拯救株，命名為ERA-，在用ERA-感染BSR細胞總RNA的RT-PCR中，使用覆蓋Psi-區的引物。只有從rERA病毒擴增出對應于Psi區的400bp片段，而非ERA。序列數據證實Psi-區的完全缺失。發犬諒諒毒五iM基尿邀^瀞歪^基厲游凝關.'利用pSKF作為模板，用引物(SnaB5引物，禾卩3Ag:SEQIDNO:54)通過PCR擴增5，gA\|/片段。在SnaBl和Pstl限制性酶消化后，該回收的片段被克隆，以取代其在pSKFAv構建體中的對應物。利用相同模板，用引物(5Ag:SEQIDNO:55,和Le3-Blp引物)通過PCR擴增3，gA\|/片段，并被連續克隆到修飾的pSKFAV，以取代其對應物。最終片段，通過SnaBl和Blpl限制性酶從不含G基因的pSKFAv上切割回收，被重新克隆到pcDNA3.1/Neo(+)質粒，以形成pTMFAg構建體用于病毒恢復。J^歪A基房定^突變；按照先前描述的(Wu等人，J.KZro/.76:4153-4161,2002)進行定點突變，在糖蛋白的333位氨基酸處引入從AGA到GAG的3個核苷酸改變。誘變反應中的引物是M5G引物CTCACTACAAGTCAGTCGAGACTTGGAATGAGATC(SEQIDNO:56,黑體為3個突變的核苷酸)和M3G引物GACTGACTTTGAGTGAGCATCGGCTTCCATCAAGG(SEQIDNO:57)。對于恢復株(ERAg3)，在利用引物5G和3G進行RT-PCR后，通過測序證實氨基酸333位(aa333)AGA到GAG的3個核苷酸變化。通過DNA測序確認后，突變的G被克隆回pTMF質粒，以制備pTMFg3構建體用于病毒恢復。該突變的G基因編碼的糖蛋白如SEQIDNO:58所示。外源ORF整合入ERA狂犬病病毒基因組為了在RV中表達外源ORF，制備含Pstl和Kpnl識別位點的額外轉錄單位，分別整合在Psi或者P-M基因的基因間區域。簡單來說，為了在Psi-區制備額外的轉錄單位，遵循相同的步驟，除了5'Av片段擴增步驟，3△V引物變為3△Vcis:CCCCCCAAGGGGAGG(SEQIDNO:59)。不含Psi-區、但具有額外轉錄單位的最終構建體被命名為pMTFAvcis。GFP，ERAG,或者氨基酸殘基333位突變的G分別被克隆到該翻譯單位中，以形成pMTFgfpl，pMTF2g，pMTFg3，pMTF2g3構建體，用于病毒拯救。為了將額外轉錄單位整合到P-M基因間區域，利用pMTF作為模板，用引物cis55擴增cisp5片段GACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCTGTTAAG(SEQIDNO:60)，cis53:TTTAGGACATCTCGG(SEQIDNO:61)，并被克隆以取代其在pMTF質粒中的對應物。禾'J用引物cis35:CCACTGATAAAATGAAC(SEQIDNO:62)禾卩cis33:CCTCCCCTTCAAGAGGGCCCCTGGAATCAG(SEQIDNO:63),以相似的方法擴增和克隆cisp3片段。在cisp5和cisp3片段組裝到一起后，最終構建體被命名為pMTFcisp，用于接受ORF。包含GFP基因的重組構建體被命名為pTMFgfp2，用于病毒恢復。為了產生ERA衍生物，命名為ERAgm，其中糖蛋白編碼序列與基質蛋白編碼序列的順序相反，按如上所述刪除糖蛋白基因。然后將G基因(按上面公開的進行擴增)插入P和M基因之間，按照N-P-G-M-L的順序獲得狂犬病病毒基因組。類似地，使用相同策略產生ERAg3m衍生物，其中糖蛋白通過取代由上述定點突變產生的G基因，在333位氨基酸殘基具有3個核苷酸突變(從AGA到GAG)。為了產生ERAgmg構建體，將糖蛋白基因的額外拷貝插入P和M基因之間，按照N-P-G-M-G-L的順序制備狂犬病病毒基因組。額外轉錄單位被修飾和整合入ERA基因組的兩個不同區域，即psi-區和P-M基因間區域。當異源ORF被整合入這些轉錄單位時，分別稱為trans1和trans2，導致有效產生編碼的產物。轉錄單位的序列是A(SEQIDNO:64,下劃線是Pstl和Kpnl)。實施例6:親代和衍生病毒的恢復本實施例描述利用此處公開的反向遺傳系統對親代ERA病毒和示范性衍生物的恢復。按照制造商推薦的方案，BSR細胞在6孔板中接近80%融合時，用3ug/孔的病毒全長轉錄質粒pTMF(分別是pTMFAV,pTMFg3,pTMF2g，pTMF2g3,pTMFgfpl,pTMFgfp2,pTMF△g，pTMFgm或者pTMFgmg)禾卩5種輔助質粒pTN(1ug/孔)，pMP(0.5ng/孔)，pML(0.5ug/孔)，pMG(0.5ug/孔)和pNLST7(1ug/孔)，通過TransIT-LTl試齊U(Mirus,Madison,WI)進行轉染。轉染后4天，每孔添加1ml新鮮BSR細胞懸液(大約5X1()5細胞)。細胞在37°C，5%C02中孵育3天。收集細胞上清用于病毒滴定。為了滴定恢復的病毒，LAB-TEK8孔板(N叩erville，IL)中的單層BSR細胞用IO倍系列稀釋的病毒上清感染，在37。C、0.5%<:02中孵育48小時。室溫下細胞在80%冷丙酮中固定1小時，在37'C用FITC標記的抗狂犬病病毒N單克隆抗體染色30分鐘。用PBS洗板3次后，利用直接熒光顯微鏡計數染色灶。在萬維網(worldwideweb)cdc.gov/ncidod/dvrd/rabies/professional/publications/DFA-diagnosis/DFA_protocol.htm可以找到直接RV熒光分析(DFA)的詳情。如表3所示，除ERA-G外的所有病毒都從培養的BSR細胞中高滴度地恢復。令人驚訝的是，G基因與M基因的重排和轉換沒有妨礙重組衍生ERA病毒的恢復。先前認為RV基因組中G基因的重排是不可行的，因為G蛋白的過表達造成細胞死亡(Faber等人，J.K>o/.76:3374-3381，2002)。但是，這些結果證明，在ERA株中重排是可能的。因此，有可能不僅對于G基因，而且對于其他基因來說，RV基因改組也是可能的。按照與其他病毒構建體拯救相同的步驟進行質粒轉染后，ERA-G(不含G)病毒被,復，但在第一輪轉染后，病毒灶是非常有限的，并限制于局部區域。即使在37"C、5%(302中孵育1周后，拯救的病毒也不能進一步傳播到鄰近的正常BSR細胞(圖4A)。利用上述轉染上清感染的正常BSR細胞在DFA試驗中呈現單細胞染色，這表明恢復的病毒不能傳播。為了擴增ERA-G病毒，按照實施例4所述，建立組成性表達ERAG的BHK細胞系(命名為BHK-G)。通過間接熒光分析篩選，對表達G的BHK細胞庫進行篩選，并維持用于ERA-G病毒的擴增(圖4B)。借助BHK-G細胞系，ERA-G病毒生長到107ffu/ml。從感染ERA-G病毒的BHK-G細胞提取總RNA，利用G基因探針進行Northern印跡分析(圖4C)。病毒基因組RNA中不存在G基因，但是檢測到GmRNA，其來自感染的支持性BHK-G細胞。在純化的ERA-G病毒基因組RNA中，利用G探針沒有檢測到雜交信號，表明ERA基因組中G基因的缺失。實施例7:在生物反應器中拯救的ERA病毒和其衍生物生長到高滴度在口服疫苗開發中，通常需要高病毒滴度以便在給藥后引發可靠的免疫。本實施例證明，ERA病毒和衍生物可以在適合商品化規模放大的體積的生物反應器中生長到高滴度。所有10種拯救的ERA病毒在生物反應器CELLineADlOOO(IBSIntegraBioscience,Chur，瑞士)中擴增到滴度從107到101Qffu/ml。簡單來說，如上所述，用示范性的反基因組轉錄載體和輔助載體轉染BSR細胞。在十分之一生物反應器容積中，以106細胞/1111濃度，每細胞1個病毒粒子的感染復數接種細胞。37°C、5%C02條件下，轉染細胞在添加10%胎牛血清的DMEM中生長。每3到5天收集上清，收集2到3次。與其他病毒相比，缺陷型ERA-G生長較差，對于ERA-G來說只有1()8ffii/niK表3和圖5)。表3.全長質粒構建體和對應的拯救病毒<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>實施例8:狂犬病病毒中來自額外翻譯單位的外源蛋白的表達本實施例證明了來自異源ORF的重組蛋白的表達，所述ORF插入狂犬病病毒載體。在本實施例中，ERA病毒載體被用作原型狂犬病病毒載體。為了構建ERA病毒作為接受ORF的載體，N和P基因之間的保守RV轉錄單位被修飾，并在兩個不同位置導入ERA基因組1)在psi區(trans1)，和2)在P-M基因間區域(trans2)。將轉錄單位設計成具有兩個獨特的限制性酶識別位點，以便異源多核苷酸序列的導入:TCTTTTTTT:SEQIDNO:65,下劃線為Pstl和Kpnl位點)。在第一個實施例中，為了病毒恢復，GFP基因被克隆入該單位，因為當轉染的BSR細胞仍在孵育時，可以直接在UV顯微鏡下觀察GFP表達。利用470±20nm的激發濾波器，通過熒光顯微鏡檢查直接可見GFP蛋白的表達。ERAgreen2(在RV基因組中P基因后插入的GFP基因-trans2)-感染的細胞在質粒轉染3天后，顯示清晰的綠色灶，而ERAgreenl(在"傳統"W區G基因后插入的GFP基因-trans1)直到轉染后5天才顯示明顯的綠色灶(圖6)。導入的轉錄單位在RV基因組兩個位置都是有功能的，盡管當GFP從tmns2表達時，表達和積聚顯然更快。因此，這些結果還表明，通過選擇其中克隆ORF的轉錄單位，可以調節異源ORF的表達水平。在其他實施例中，l)ERAG的額外拷貝；或者2)在333位具有氨基酸取代的ERAG的額外拷貝，被整合到ERA病毒基因組中。成功拯救的病毒分別被命名為ERA2g和ER2g3。因為定量病毒G的表達是不現實的，所以利用G探針通過Northern印跡來證實ERA2g和ERA2g3-感染的細胞中G表達水平的相對增加。簡單來說，利用DigDNA標記試劑盒(Roche，Indianapolis,IN)標記ERAG基因探針，用Dig核酸檢測試劑盒(Roche，Indianapolis,IN)進行成像，通過密度分光光度法測量(圖7)。利用5G和3G引物通過RT-PCR還證實了恢復病毒中串聯連接的G基因。觀察到表示單一G拷貝的主要條帶位于1.5kb。此外，在大約3.0kb處觀察到第二條較弱的條帶，指示串聯排列的兩個G。這些結果證明，轉錄單位導入ERA基因組可用于從導入的ORF表達各種異源蛋白。此外，通過ORF插入的位置，調節異源ORF編碼蛋白的表達。因此，ERA病毒是一個用于重組蛋白表達的可廣泛適用的載體。實施例9:針對工程化病毒的體內免疫應答本實施例證實接種工程化ERA病毒和示范性衍生物的體內影響。所有動物管理和實驗步驟均遵循CDC實驗動物管理和使用指導(CDCInstitutionalAnimalCareandUseGuidelines)。80只3周齡小鼠被分成8組，每組10只，肌內(i.m)使用恢復病毒(每只小鼠1()Sffu病毒)。10只健康小鼠留作未感染的模擬對照。對于ERA和ERAg3構建體，對另一組10只3周齡小鼠進行相同劑量病毒的額外腦內(i.c)注射。在2日齡乳鼠中，只進行相同劑量的ERAg3和ERA-G病毒腦內接種。每天檢査動物的患病情況。所有動物利用C02中毒安樂死，取出大腦用于狂犬病病毒診斷。感染后10天，通過眶后途徑取血，獲得血清用于中和抗體分析，然后進行標準快速熒光灶抑制試驗(RFFIT)(Smith等人，BulletinoftheWorldHealthOrganization.48:535-541,1973)。感染后1個月，存活的動物用致死量的狂犬病街病毒(狗/山狗唾液腺勻漿)攻擊(Orciari等人，Vaccine.19:4511-4518,2001)。抗狂犬病病毒G的小鼠單克隆抗體(Mab52311)保存在CDC(Hamir等人，VetRec.136,295-296，1995)，FITC-偶聯抗-N單克隆抗體購自Centocor(Horsham,PA)。T7RNA聚合酶單克隆抗體來自Novagen(Madison,WI)。山羊抗-小鼠IgG-FITC偶聯物購自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。抗狂犬病病毒G單克隆抗體(Mab1-909)保存在CDC，山羊抗人IgG-FITC偶聯物購自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。在肌內接種8種不同病毒構建體的3周齡小鼠中，50%接種ERA(rERA)或者ERA-的小鼠，和20%接種ERAgreenl的小鼠在接種后19天顯示輕度神經征象。其他組都未顯示提示狂犬病病毒感染的任何征象(圖8A)。在攻擊前收集血清用于中和抗體滴定。ERA2g(5.60IU)和ERA2g3(5.61IU)比單拷貝的G病毒構建體引發更高的滴度(圖8E)。接種后1個月存活的小鼠接受致命的狗/山狗街病毒(0.05ml，保存在CDC用于標準動物攻擊試驗)的攻擊。在ERA和ERA-組中，40到62%的小鼠分別顯示輕度狂犬病征象，然后處以安樂死。所有其他組都存活，沒有狂犬病的任何征象(圖8B)。在i.c組中，3周齡小鼠在接種ERAg3后存活，但在注射ERA后死亡(圖8C)。ERA-G構建體不殺死2日齡乳鼠，但是ERAg3具有足以殺死所有感染乳鼠的毒力(圖8D)。示例性的抗體滴度顯示于表4。表4:狂犬病特異抗體的制備組平均滴度ERA433G3334682G5602G333561-PSI490GFP437Ggreen833Gminus136Controls<1/5這些數據證明，所有基于ERA的病毒都能夠在接種后引發免疫應答。與預期一致，親代ERA病毒是有毒力的，在感染動物中造成顯著的發病和死亡。相反，各種示范性衍生物當在攻擊前接種小鼠時，引發保護性免疫應答。除了如上所述的接觸前評價外，還檢測了在用毒性狂犬病病毒感染后，ERA病毒衍生物引發保護性免疫應答的能力。簡單來說，倉鼠組用3種不同狂犬病病毒株中的一種感染(每組n-9)，并且接受重組疫苗(ERA-g333)或者狂犬病免疫球蛋白加滅活的商業狂犬病疫苗。如圖9A-C所示，大約80-100%的對照動物死亡，而大約60-100%的接種動物存活。這些結果證明，衍生的狂犬病病毒的接觸后給藥基本上可以防護不同的狂犬病病毒株。鑒于本發明公開的原理可以應用到許多可能的實施方式，應當認識到，舉例說明的實施方式只是本發明優選的實施例，不應被用于限制本發明的范圍。而是，本發明的范圍由所附權利要求確定。因此要求所有在這些權利要求的范圍和精神內的都作為我們的發明。權利要求1.一種載體系統，包括含有全長狂犬病病毒反基因組DNA的第一載體，其中全長反基因組DNA選自全長狂犬病病毒反基因組DNA或者其衍生物；和，含含有編碼至少一種狂犬病病毒株ERA蛋白的核酸的多個輔助載體，其中轉染的宿主細胞中多個載體的表達引起重組狂犬病病毒的產生。2.權利要求l的載體系統，其中全長反基因組DNA包括ERA株反基因組DNA或者其衍生物。3.權利要求2的載體系統，其中全長反基因組DNA選自SEQIDNO:8,SEQIDN0:9，SEQIDNO:10,SEQIDNO:11,SEQIDNO:12,SEQIDNO:13，SEQIDNO:14,SEQIDNO:15,SEQIDNO:16,SEQIDNO:17或者SEQIDNO:18。4.權利要求1-3中任一項的載體系統，其中的載體是質粒。5.權利要求1-4中任一項的載體系統，其中第一載體按5'到3'方向包括錘頭核酶；狂犬病病毒反基因組cDNA;和丁型肝炎病毒核酶，其中錘頭核酶的多個核苷酸與狂犬病病毒的反義基因組序列互補。6.權利要求5的載體系統，其中反基因組cDNA的轉錄受CMV啟動子和噬菌體T7RNA聚合酶啟動子中至少一種的轉錄調控。7.權利要求6的載體系統，其中反基因組cDNA的轉錄受CMV啟動子和噬菌體T7RNA聚合酶啟動子兩者的轉錄調控。8.權利要求l-4任一項的載體系統，其中多個輔助載體包括含有編碼狂犬病病毒N蛋白的多核苷酸序列的載體；含有編碼狂犬病病毒P蛋白的多核苷酸序列的載體；含有編碼狂犬病病毒M蛋白的多核苷酸序列的載體；含有編碼狂犬病病毒L蛋白的多核苷酸序列的載體；和含有編碼噬菌體T7RNA聚合酶的多核苷酸序列的載體。9.權利要求8的載體系統，還包括一種載體，所述載體含有編碼狂犬病病毒G蛋白的多核苷酸序列。10.權利要求8或者9的載體系統，其中T7RNA聚合酶包括核定位信號(NLS)。11.權利要求10的載體系統，其中編碼狂犬病病毒N蛋白的多核苷酸序列的轉錄受T7啟動子的轉錄調控，并且其中轉錄是獨立于帽的。12.權利要求8-11中任一項的載體系統，其中編碼狂犬病病毒P、M、L或者G蛋白或者T7聚合酶的一種或者多種多核苷酸序列的轉錄受CMV啟動子和T7啟動子兩者的轉錄調控。13.—種重組病毒基因組，包括如SEQIDNO:l所示的核酸。14.一種重組病毒基因組，或者其衍生物，包括如SEQIDNO:7所示的核酸。15.權利要求14的重組病毒基因組，其中衍生病毒基因組包括SEQIDNO:8，SEQIDNO:9，SEQIDNO:10,SEQIDNO:11,SEQIDNO:12,SEQIDNO:13，SEQIDNO:14,SEQIDNO:15,SEQIDNO:16,SEQIDNO:17或者SEQIDNO:18。16.權利要求13-15中任一項的重組病毒基因組，還包括載體。17.權利要求16的重組病毒基因組，其中的載體是質粒。18.—種重組病毒，包括權利要求14或者15所述的基因組。19.權利要求18的重組病毒，其中的病毒是減毒病毒。20.—種包括至少一種重組狂犬病病毒基因組的活狂犬病疫苗，其中至少一種重組狂犬病基因組包括SEQIDNO:8所示的序列；SEQIDNO:10所示的序列；或者SEQIDNO:13所示的序列。21.權利要求20的狂犬病疫苗，其是減毒的。22.—種分離蛋白，包括如下列所示的氨基酸序列SEQIDNO:2(N蛋白)；SEQIDNO:3(P蛋白)；SEQIDNO:4(M蛋白)；SEQIDNO:5(G蛋白)；SEQIDNO:6(L蛋白)；或者SEQIDNO:58(G蛋白Aa333)。23.—種分離核酸分子，編碼根據權利要求22的任一種蛋白。24.權利要求23的分離核酸分子，包括如下所示的核苷酸序列a)SEQIDNO:1的核苷酸71-1423(N蛋白)；b)SEQIDNO:1的核苷酸1511-2407(P蛋白)；c)SEQIDNO:1的核苷酸2491-3104(M蛋白)；d)SEQIDNO:1的核苷酸3318-4892(G蛋白);e)SEQIDNO:1的核苷酸5418-11,801(L蛋白)，或者f)只是由于遺傳密碼簡并性而不同于a)到e)之一的核苷酸序列。25.權利要求23的分離核酸分子，包括SEQIDNO:8的核苷酸3317-4888所示的核苷酸序列，或者只是由于遺傳密碼簡并性而與其不同的核苷酸序列。26.—種組合物，包括至少一種權利要求22的分離蛋白。27.權利要求26的組合物，還包括藥學上可接受的載體，佐劑，或者其兩種或更多種的組合。28.—種在對象中引發針對抗原表位的免疫應答的方法，包括給對象導入權利要求26的組合物，從而在對象中引發免疫應答。29.—種用于全長狂犬病病毒基因組測序的方法，包括逆轉錄狂犬病病毒基因組以產生互補DNA鏈；擴增互補DNA鏈的第一部分和第二部分以產生第一和第二擴增的狂犬病病毒基因組片段；克隆第一和第二擴增的狂犬病病毒基因組片段到載體中以產生連續的狂犬病病毒反基因組；和對全長狂犬病病毒反基因組進行測序。30.—種制備活狂犬病病毒疫苗的方法，包括將權利要求8-19中任一項的載體系統導入宿主細胞，并恢復活的重組狂犬病病毒。31.權利要求30的方法，其中恢復的活重組狂犬病病毒適于用作活狂犬病病毒疫苗。32.—種活狂犬病病毒疫苗，由權利要求31的方法制備。33.—種對對象接種抗狂犬病的方法，包括給藥對象有效量的權利要求20或者權利要求32的活狂犬病疫苗，使對象的細胞感染狂犬病疫苗，其中在對象中產生抗-狂犬病免疫應答。34.權利要求33的方法，其中對象是人。35.權利要求33的方法，其中對象是非人動物。36.權利要求35的方法，其中非人動物是貓，狗，大鼠，小鼠，蝙蝠，狐貍，淙熊，松鼠，負鼠，山狗或者狼。37.權利要求34-36中任一項的方法，其中的給藥包括口服給藥。38.權利要求37的方法，其中口服給藥包括通過設計成接種野生動物群體的食物-誘餌給藥。39.—種藥物組合物，包括權利要求20或者權利要求32的活狂犬病疫苗和藥學上可接受的載體或者賦形劑。40.權利要求39的藥物組合物，其中狂犬病疫苗是減毒的。全文摘要提供了狂犬病病毒組合物和方法。公開了狂犬病病毒株Evelyn-Rokitnicki-Abelseth(ERA)的全長序列。提供一種用于產生重組ERA病毒和其衍生物的反向遺傳系統，以及包括ERA和/或ERA衍生病毒株、核酸和/或蛋白的組合物。在一些情況下，組合物是可用于狂犬病病毒接觸前或者接觸后治療的免疫原性組合物。文檔編號C12N15/867GK101287838SQ200680038314公開日2008年10月15日申請日期2006年10月13日優先權日2005年10月14日發明者吳賢福,查爾斯·E·盧普里希申請人:美國政府健康及人類服務部，疾病控制和預防中心