Glp-2模擬體、多肽、組合物、方法和用途的制作方法

專利名稱：：Glp-2模擬體、多肽、組合物、方法和用途的制作方法GLP-2沖莫擬體、多肽、組合物、方法和用途發明領域本發明涉及哺乳動物GLP-2多肽和模擬體，以及它們作為治療劑的用途。發明背景胰高血糖素樣肽2(GLP-2)是經胰高血糖素原的翻譯后加工產生的33個氨基酸的促腸肽激素(Orskov等，FEBSLett.247:193-196(1989);Hartmann等，Peptides21:73-80(2000))。在哺乳動物中，由于激素原轉化酶在腸內分泌細胞中的細胞特異性表達，GLP-2由腸和腦中的胰高血糖素原釋放，但不由胰腺中的胰高血糖素原釋放(Dhanvantari等，Mol.Endocrinol.10:342-355(1996);Rothenberg等，Mol.Endocrinol.10:334-341(1996);Damholt等，Endocrinology140:4800-4808(1999);Hoist,TrendsEndocrinolMetab.10:229-235(1999))。使用高效液相層析和位點特異性GLP-2抗血清的組合分析大鼠和人血漿揭示，存在兩種主要的循環分子形式GLP-2""和GLP-23-33(Hartmann等，出處同上；Brubaker等，Endocrinol.138:4837-4843(1997);Hartmann等，J.Clin.Endocrinol.Metab.85:2884-2888(2000))。GLP-2Ws在體內被蛋白酶二肽基肽酶IV(Dppiv)切割，二肽基肽酶IV去除前兩個殘基組氨酸和丙氨酸(HA)。產生的肽GLP-23—33基本上無活性。GLP-2調節胃動力、胃酸分泌、腸己糖運輸，并增加腸上皮的屏障功能(綜迷于Drucker,J.Clin.Endocr.Metab.86:1759-1764(2001))。其通過刺激隱窩細胞增殖以及抑制腸細胞和隱窩區凋亡顯著增加粘膜上皮的表面積。(Drucker等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:7911-7916(1996))。GLP-2降低小腸炎和大腸炎的死亡率，減少粘膜損傷、細胞因子表達和細菌敗血癥(Boushey等，Am.J.Physiol.277:E937-E947(1999);Prasad等,J.Pediatr.Surg.35:357-359(2000》。GLP-2還增強患有短腸綜合征(SBS)的嚙齒動物或人的營養吸收和腸適應(Jeppesen等，Gastroenterology120:806-815(2001))。GLP-2的作用由GLP-2受體(GLP-2R)轉導，GLP-2受體是在胃、小腸、結腸的腸內分泌細胞以及腸神經元和內皮下肌成纖維細胞中表達的G蛋白偶聯受體(Munroe等，Proc.Natl.Acad.SciU.S.A.96:1569-1573(1999);Yusta等，Gastroenterology119:744-755(2000);Bjerknes等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:12497-12502(2001);Orskov等，Regul.Pept.124:105-112(2005))。在表達GLP-2受體的轉染幼年倉鼠腎成纖維細胞(BHK-GLP-2R細胞)中直接活化GLP-2R信號轉導賦予對環己酰亞胺誘導的凋亡的抗性(Yusta等，J.Biol.Chem.275:35345-35352(2000))。GLP-2的細胞保護、修復和能量保留特性提示，GLP-2潛在地可用于治療特征在于腸粘膜上皮的損傷和/或功能異常的人類疾病。腸上皮損傷可見于包括克羅恩氏病和潰瘍性結腸炎的炎性腸病(IBD)患者，以及可見于與腸中的炎性反應有關的自身免疫病(例如乳糜瀉)患者(綜述于Hanauer,NewEnglandJ.Med.334:841-848(1996))。另外，某些化療藥物引起腸上皮的損傷，產生劑量限制性的毒性副作用(Oster，Oncology13:41(1999))。還報告急性胰腺炎時的腸滲透性增加(Kouris等，Am.J.Surg.181:571-575(2001))，其可能通過允許大分子進入內皮下區室而促發食物變態反應(Troncone等，Allergy49:142-146(1994))。作為營養吸收中的重要調節激素，GLP-2還有希望治療短腸綜合征(SBS)患者(Dmcker等，出處同上；Rubin,Gastroenterol.117:261-263(1999);Nightingale,Gut45:478-479(1999》。SBS被定義為由顯著長度的小腸的形態或功能損失引起的吸收障礙(綜述于Jeppesen,丄Nutr.133:3721-3724(2003))。短腸綜合征的病因在成人和兒童之間不同在成人中，其最經常是針對克羅恩氏病或腸系膜梗阻的手術之后的結果；而在嬰兒中，病因更通常包括壞死性小腸結腸炎、腹裂、閉鎖和腸扭轉(Platell等，WorldJ.Gastroenterol.8:13-20(2002))。替度魯肽(Teduglutide)為DPP-IV抗性的GLP-2肽類似物(其中丙氨酸-2被甘氨酸取代(A2G))，正被開發用于胃腸(GI)疾病的潛在治療，所述疾病包括SBS、克羅恩氏病和兒科GI疾病。替度魯肽還具有治療與癌癥化療相關的粘膜炎和IBD的潛力。然而，由于4齊度魯肽的分子量低，所以該肽因半衰期不足30分鐘而被快速清除。因此，需要每曰給藥來保持治療劑水平(Shin等，Curr.Opin.Endocrin.Diabetes12:63-71(2005))。因此，需要修飾的GLP-2,其將克服短半衰期，同時保持其功能，并保證易于開發和制造。炎性腸梗阻為侵入性手術或外傷性損傷之后的協調胃腸動力的短暫損傷，仍是臨床上的大問題，延長住院期，并經常在康復期當中促發藥物并發癥(Holte和Kehlet,Br.J.Surg.87:1480-1493(2000》。腸梗阻的特征在于延遲的胃排空、小腸和結腸的擴張、腹脹、失去正常推進收縮模式和不能排空氣體或糞便，導致患者不適延長(腹脹、惡心、嘔吐)。在諸如老年人或心肺損傷患者的易感個體中，腸梗阻可產生更嚴重的并發癥，包括急性胃擴張、心律失常、呼吸窘迫、吸入性肺炎和不能手術吻合。在嚴重情況下，長期失去GI道的正常"看家(houseke印ing)"收縮活性可促發細菌過度生長和腸屏障功能的破壞，之后細菌移位，并進入系統循環(Anup和Balasubmmanian,J.Surg.Res.92:291-300(2000))。這又可導致內毒素血癥、敗血癥、多器官衰竭，并最終導致老年患者最易感的結果一死亡。即便在沒有并發癥時，正常腸功能的恢復也是患者出院的主要限制因素，炎性腸梗阻增加住院期達3-5天。因此，死亡率增加和住院期延長增加的成本可能是顯著的。促使腸梗阻發展和維持的因素包括將去甲腎上腺素釋放到腸壁中的中樞交感抑制反射的活化、抑制性體液物質、麻醉劑和止痛劑以及炎性介導物(Livingston和Passaro,Dig.Dis.Sci.35:121-132(1990);Bauer等，Curr.Opin.Crit.Care8:152-157(2002》。嚙齒動物研究的結果提示，GI道壁中的炎癥在發作和維持腸梗阻方面起核心作用。使用手術后腸梗阻的嚙齒動物模型的研究表明，外肌層為高度免疫活性區室。一般定居于外肌層中的是大量普通白細胞(Mikkelsen,Histol.Histopathol.10:719-736(1995);Kalff等，Ann.Surg.228:652-663(1998))。其中最豐富的是定居的巨噬細胞，其形成了由食道至結腸的廣泛細胞網絡，隨時保護胃腸道免遭潛在的損傷和疾病。在腹部手術當中的腸失調活化該巨噬細胞網絡，啟動局部分子炎性反應。活化的巨噬細胞釋放促炎細胞因子(IL-6、IL-1(5、TNFa)和趨化因子(MCP-l)，它們抑制肌層中的神經肌肉聯系，誘導血管內皮上的粘附分子(ICAM-1、P-選擇素)表達(Kalff等，J.Leukoc.Biol.63:683-691(1998);Josephs等,J.Surg.Res.86:50-54(1999);Kalff等,Gastroenterology117:378-387(1999);Kalff等，Gastroenterology118:316-327(2000);Wehner等，Surgery137:436-46(2005))。這又產生以由系統循環募集白細胞(單核細胞、嗜中性粒細胞、T細胞、肥大細胞)為特征的細胞炎性反應，其中在炎性細胞浸潤程度和腸梗阻嚴重性之間存在正相關(Kalff等，Surgery126:498-509(1999》。浸潤白細胞釋放額外的細胞因子以及前列腺素、一氧化氮、蛋白酶和活性氧物質，它們進一步促發神經肌肉功能障礙(vonRitter等，Gastroenterology97:605-609(1989);Bielefeldt和Conklin,Dig.Dis.Sci.42:878-884(1997》。迄今為止，在臨床中幾乎沒有可用于治療炎性腸梗阻的選擇。業已表明，諸如西沙比利和新斯的明的促動力藥改善手術后腸動力(Shibata和Toyoda,Surg.Today28:787-791(1998》。然而，結果前后矛盾，且這些藥物的心血管副作用風險增加，這些心血管副作用就嚴重性和患者易感性而言已^^皮證實難以預測。已在動物研究中表明8COX-2抑制劑起抗手術后小腸蠕動異常的保護作用(Schwarz等，Gastroenterology121:1354-1371(2001)),但對結腸蠕動異常幾乎沒有作用(Turler等，Anal.Surg.,231(1):56-66(2002))。完成了對比塞來昔布和羅非昔布的人體I期臨床試驗(Bouras等，Neurogastroenterol.Modi.16:729-735(2004))，未發現哪一種藥物改善手術后動力性。業已提議將手術后快速恢復進食作為刺激正常激素調節的腸動力才莫式的方法。發現該方法加速腸功能的恢復，而且用作腸恢復多樣才莫式方法的一部分時改善一部分患者的舒適性(Holte&Kehlet,Minerva.Anestesiol.,68(4):152-156(2002))。但是，該治療不會導致住院期長度顯著下降。而且，對激素模式的足夠刺激需要許多患者不能耐受的熱載量閾值。其中一種有助于延長的腸梗阻發展的最常見因素是給予鴉片類鎮痛劑，用于減輕手術后疼痛。鴉片類物質通過與大腦的疼痛處理中心中的神經元上存在的3種受體亞型中的一種或多種相互作用發揮它們的鎮痛作用。最新的鴉片類鎮痛劑如嗎啡主要通過活化p和S鴉片類受體起作用。但是，這些相同的受體還在控制腸動力性的胃腸道中的神經元上表達。無論存在還是不存在炎性腸梗阻，受體的活化都顯著抑制胃腸收縮功能，引起腸淤積和便秘。AdalorCorporation已使用愛維莫潘進行了I期和II期臨床試驗，愛維莫潘是外圍限制性和選擇性的)i-OR拮抗劑，不穿過血腦屏障。當連同鴉片類鎮痛劑聯合給予時，愛維莫潘阻止鴉片類鎮痛劑誘導的腸動力性抑制(Gonenne等，Clin.Gastroenterol.Hepatol.3:784-791(2005))。在與安慰劑相比時，發現愛維莫潘加速腸功能恢復，在進行腹部手術后經歷輕微至中等手術后腸梗阻的患者縮短了住院期(Viscusi等，Surg.Endosc.20:64-70(2006))。愛維莫潘對炎癥沒有影響。迄今為止，沒有可用于治療炎性腸梗阻的安全且可靠的治療選擇。目前可用的最有效的治療法實際上是輔助性的，或者改善鴉片類鎮痛法的復合效應。它們沒有解決作為腸梗阻基礎病因的炎癥。因此，仍然存在明顯未被滿足的醫療需求。附圖簡述圖1表明，GLP-2模擬體Pro取代變體(SEDIDNO:43和44)與U937細胞裂解物溫育后的SDS-PAGE凝膠圖像。圖2表明，用A2GGLP-2模擬體治療小鼠的粘膜刮屑的濕重劑量依賴性增加。圖3表明，在A2G-GLP-2肽治療小鼠中腸轉運顯著加速。統計學顯著性通過非配對StudentT檢驗確定。圖4表明，在A2GGLP-2模擬體治療小鼠中腸轉運顯著加速。統計學顯著性通過非配對StudentT檢驗確定。圖5表明，在鼠A2GGLP-2模擬體治療小鼠中與手術后炎性腸梗阻相關的胃腸轉運延遲顯著衰減。統計學顯著性通過ANOVA后接Bonferroni事后檢驗確定。圖6顯示了在腹部手術后具有含增加數量的髓過氧物酶(MPO)的白細胞的腸肌層整封標本。用鼠A2GGLP-2模擬體治療顯著降低浸潤細胞的數目，而IgG2a沒有作用。圖7顯示了采用已編輯的圖6細胞計數的直方圖。統計學顯著性通過ANOVA后接Bonferroni事后檢驗確定。發明概述本發明的一個方面是具有通式(n)的模擬體(GLP2RAg-Lk-V2-Hg-CH2-CH3)(t)(II)其中GLP2RAg為哺乳動物GLP-2R激動劑，Lk為多肽或化學4定，V2為免疫球蛋白可變區C末端的一部分，Hg為免疫球蛋白可變鉸鏈區的至少一部分，CH2為免疫球蛋白重鏈CH2恒定區，CH3為免疫球蛋白重鏈CH3恒定區，t獨立地為l-10的整數。本發明的另一方面是模擬體，其包含具有示于SEQIDNO:4、5、6、7、8、9、10、11、42、43、44、45、58、59、60、61、62、63、64、65、75或77的序列的多肽。本發明的另一方面是多核普酸，其包含具有示于SEQIDNO:12、13、14、15、16、17、18、46、47、48、49、66、67、68、69、70、71、72、73、76或78的序列或互補序列的多核苷酸。本發明的另一方面是多核苷酸，其包含編碼示于SEQIDNO:4、5、6、7、8、9、10、11、42、43、44、45、58、59、60、61、62、63、64、65、75或77的氨基酸序列的多核苦酸。本發明的另一方面是多肽，其包含具有示于SEQIDNO:52、54、55或74的序列的多肽。本發明的另一方面是多核普酸，其包含編碼示于SEQIDNO:52、54、55或74的氨基酸序列的多核苷酸。本發明的另一方面是減輕疾病癥狀或治療疾病的方法，所述疾病的特征在于腸粘膜上皮的損傷和/或功能障礙，所述方法包括給予其需要的患者GLP-2多肽組合物或GLP-2才莫擬體組合物。本發明的另一方面是預防炎性腸梗阻、減輕炎性腸梗阻癥狀或治療炎性腸梗阻的方法，其包括給予其需要的患者GLP-2多肽組合物或GLP-2模擬體組合物。發明詳迷在本說明書中提及的所有出版物，包括但不限于專利和專利申請，都如同完整陳述一樣在此引入作為參考。單字母氨基酸密碼如本領域技術人員所理解的一樣在本文使用。免疫球蛋白恒定區中的氨基酸殘基編號基于為野生型IgGl或IgG4Fc結構域中的N末端氨基酸的殘基編號。本發明提供具有哺乳動物GLP-2特性和活性的蛋白構建體。本發明的一個實施方案是模擬不同類型的免疫球蛋白分子(例如IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)及其任何亞類(例如IgAl、IgA2、IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)或其組合的蛋白構建體，在后文稱為"GLP-2才莫擬體"或僅稱為"模擬體"。本發明的另一個實施方案是為GLP-2變體的多肽，其中所述多肽具有野生型分子的特性和活性。本發明還提供編碼GLP-2才莫擬體、多肽的核酸、包含這些核酸的載體、宿主細胞、制備和使用GLP-2才莫擬體和多肽的組合物和方法。GLP-2模擬體、多肽和組合物一般地講，本發明涉及具有通式(I)的模擬體多肽(Pep-Lk-V2-Hg-CH2-CH3)(t)(I)其中Pep為具有需要的生物特性的多肽，Lk為多肽或化學鍵，V2為免疫球蛋白可變區C末端的一部分，Hg為免疫球蛋白鉸鏈區的至少一部分，CH2為免疫球蛋白重鏈CH2恒定區，CH3為免疫球蛋白重鏈CH3恒定區，t獨立地為l-10的整數。更具體地說，本發明涉及能夠在結合時活化GLP-2R的GLP-2模擬體多肽。所述多肽具有通式(II):(GLP2RAg-Lk-V2-Hg-CH2-CH3)(t)(II)其中GLP2RAg為哺乳動物GLP-2R激動劑，Lk為多肽或化學4定，V2為免疫球蛋白可變區C末端的一部分，Hg為免疫球蛋白鉸鏈區的至少一部分，CH2為免疫球蛋白重鏈CH2恒定區，CH3為免疫球蛋白重鏈Qi3恒定區，t獨立地為1-10的整數。本文使用的"GLP-2R激動劑"包括在結合GLP-2R時活化GLP-2R的任何分子。GLP-2R激動劑包括野生型哺乳動物GLP-2和GLP-2的肽類似物。代表性的野生型GLP-2肽具有示于SEQIDNO:l的氨基酸序列。已知天然GLP-2中的某些氨基酸殘基可被其它氨基酸殘基取代，類似物保持野生型GLP-2的GLP-2R結合特性。例如，野生型人GLP-2肽的Ala2可被Ser(A2S)或Gly(A2G)取代。獲得的氨基酸序列分別示于SEQEDNO:2和3。在本發明中，已開發了用作GLP-2R激動劑的野生型人GLP-2的新類似物。這些類似物的氨基酸序列示于以下所示的SEQIDNO:50、51、52、53、54、55、56、57和74(針對野生型GLP-2命名的突變)。這些類似物可用作才莫擬體的GLP2RAg組分。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>已觀察到GLP-2肽可自締合，造成了均一治療候選物的開發和制造問題。參見美國專利申請公布號20040122210Al。如在以下的實施例中所述，具有示于SEQIDNO:52、54、55和74的氨基酸序列的多肽被設計成于pH7.5為單體，具有降低的螺旋傾向性。因此，這些人GLP-2肽類似物在^t擬體構建體中或作為棵治療肽時應特別有用。在本發明的模擬體中，連接物部分(Lk)通過使才莫擬體具有可變的方向和結合特性而提供了結構靈活性。代表性的連接物包括非肽化學鍵或通過肽鍵連接的l-20個氨基酸，其中所述氨基酸選自20個天然氨基酸。連接物部分可包含大部分在結構上不受阻礙的氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸，包括GS、GGGS(SEQIDNO:19)、GSGGGS(SEQIDNO:20)及其聚合物或組合。在本發明范圍內的其它代表性連接物可長于20個殘基，并可以包括非甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸的殘基。在本發明的模擬體中，V2是免疫球蛋白可變區(例如重鏈可變區)C末端結構域的一部分。代表性的V2氨基酸序列為GTLVTVSS(SEQIDNO:21)。業已表明，O-糖基化可在V2區的兩個Tyr殘基處發生，但糖基化程度高度依賴于宿主細胞系，并還有可能受到培養條件影響。O-聚糖可用于阻斷聚集和蛋白水解，導致體內穩定性更大。然而，由于不均一性和較差的重現性，可能需要廢除O-糖基化。因此，替代的代表性V2氨基酸序列為GALVAVSS(SEQIDNO:22)。在本發明的模擬體中，Hg為免疫球蛋白可變區(例如重鏈可變區)鉸鏈結構域的一部分。代表性的Hg氨基酸序列包括EPKSCDKTHTCPPCP(SEQIDNO:23)、EPKSADKTHTCPPCP(SEQIDNO:24)、ESKYGPPCPSCP(SEQIDNO:25)、ESKYGPPCPPCP(SEQIDNO:26)和CPPCP(SEQIDNO:27)。在本發明的模擬體中，CH2為免疫球蛋白重鏈CH2恒定區。代表性的CH2氨基酸序列包括APEIXGGPSWLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK(SEQIDNO:28)、APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK(SEQIDNO:29)、KEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK(SEQIDNO:30)和APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK(SEQIDNO:31)。在本發明的沖莫擬體中，CH3為免疫球蛋白重鏈CH3恒定區。代表性的CH3氨基酸序列包括固EALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO:32)和MHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQIDNO:33)。本領域技術人員會認識到，本發明模擬體的CH3區在某些重組系統中表達時其C-末端氨基酸可被切除。在本發明的模擬體中，免疫球蛋白分子的FcRn清道夫受體結合位點保留在CH2和CH3區的接合處。因為FcRn結合能夠將被胞飲的免疫球蛋白返回到胞外間隙，所以預期GLP-2才莫擬體的半衰期相對于GLP-2肽將顯著延長。在本發明模擬體的一個實施方案中，單體結構(GLP2-Lk-V2-Hg-CH2-CH3)可非共價地或通過共價鍵(例如但不限于Cys-Cys二硫一睫)連接至其它單體。IgGl和IgG4亞類在鉸鏈區中的半胱氨酸數目不同。和IgGl亞類一樣，在IgG4鉸鏈中有兩個半胱氨酸參與重鏈之間的二硫鍵鍵合。但是，在IgGl鉸鏈中一般涉及和輕鏈二硫鍵鍵合的半胱氨酸在IgG4鉸鏈中不存在。因此，IgG4鉸鏈不如IgGl鉸鏈靈活。另外，兩種同種型介導補體依賴性細胞毒性(CDC)和抗體依賴性細胞毒性(ADCC)的能力不同。CDC是存在補體時靶的裂解。補體活化途徑因補體系統的第一個組分(C1q)與復合關連抗原的分子的結合而啟動。IgGl是補體級聯和隨后的CDC活性的強誘導物，而IgG4幾乎沒有補體誘導活性。ADCC是細胞介導的反應，其中表達Fc受體(FcR)的非特異性細胞毒性細胞(例如天然殺傷(KK)細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞)識別靶細胞上的結合抗體，隨后引起靶細胞裂解。IgGl亞類以高親和性結合Fc受體，并有助于ADCC，而lgG4僅微弱結合。IgG4相對不能活化效應子功能是合乎需要的，因為有可能在沒有細胞殺傷作用的情況下將模擬體傳送至細胞。而且，在lgG4和IgGl同種型中存在FcRn清道夫受體的結合位點，二者具有類似的結合特征。因此，預期本發明的IgGl和lgG4模擬體的藥代動力學是類似的。免疫球蛋白區的鉸鏈-CH2-CH3部分(Hg-CH2-CH3)也可以被廣泛修飾，以形成符合本發明的變體。例如，可去除提供沖莫擬體分子不需要的結構特征或功能活性的一個或多個天然位點。這些位點例如可通過取代或缺失殘基、向所述位點插入殘基或截斷含所述位點的部分而被去除。下文討論了代表性的Hg-CH2-CH3變體。1.涉及二硫鍵形成的位點可通過缺失或被本發明模擬體中的其它氨基酸取代而被去除。典型地，存在于這些基序中的半胱氨酸殘基被去除或取代。這些位點的去除可避免與生產模擬體的宿主細胞中存在的其它含半胱氨酸的蛋白二硫鍵鍵合，或者避免基于IgG4的構建體中的重鏈內二硫鍵鍵合，同時仍允許非共價保持在一起的二聚化CH3-CH2-鉸鏈結構域存在。大部分IgG型抗體，例如IgGl，是由兩個相同重(H)鏈和兩個相同輕(L)鏈組成的同二聚化分子，通常縮寫為H2L2。因此，這些分子就抗原結合而言一般是2價的，即IgG分子的兩個抗原結合(Fab)臂具有相同的結合特異性。IgG4同種型重鏈在它們能夠形成重鏈間或重鏈內二辟d建的鉸鏈區中包含CPSC(SEQIDNO:34)基序，即CPSC基序中的兩個Cys殘基可與其它H鏈中的對應Cys殘基二硫鍵鍵合(之間)，或者給定CPSC基序中的兩個Cys殘基彼此可以二硫鍵鍵合(之內)。據信體內異構酶能夠將IgG4分子的重鏈間鍵轉變為重鏈內鍵，反之亦然(Aalberse和Schuurman，Immunology105,9-19(2002》。因此，因為那些IgG4分子中的HL對與鉸鏈區中的重鏈內鍵彼此不共價結合，所以它們可解離為HL單體，然后HL單體與來自其它IgG4分子的HL單體再結合，形成雙特異性的異二聚化IgG4分子。在雙特異性IgG抗體中，抗體分子的兩個Fab的不同之處在于它們結合的表位。用Pro取代IgG4鉸鏈區中的Ser228產生"IgGl樣行為"，即所述分子在重鏈之間形成穩定的二硫鍵，因此對與其它IgG4分子的HL交換不敏感。2.可修飾H-Ch2-Ch3,以產生與選定宿主細胞更匹配的本發明模擬體。例如，當本發明的模擬體在細菌細胞如大腸桿菌中重組表達時，鉸鏈中的Pro-Ala序列可一皮去除，以防止大腸桿菌酶脯氨酸亞氨基肽酶消化。3.—部分鉸鏈區可缺失或被本發明模擬體中的其它氨基酸取代，以防止在選定宿主細胞中表達的產物中的不均一性。4.本發明模擬體中的一個或多個糖基化位點可被去除。通常被糖基化的殘基(例如Asn)可賦予模擬體Fc依賴性的細胞介導的細胞裂解活性。這樣的殘基可缺失或被不糖基化的殘基如Ala取代。5.在本發明的模擬體中參與和補體的相互作用的位點如Clq結合位點被去除。6.在本發明才莫擬體中影響與非FcRn補救受體的Fc受體結合的位點可去除。例如，在本發明模擬體中涉及ADCC活性的Fc受體可被去除。例如，IgGl鉸鏈區中Leu234/Leu235突變為L234A/L235A或IgG4鉸鏈區中Phe234/Leu235突變為P234A/L235A使FcR結合最小化，減弱了免疫球蛋白介導補體依賴性細胞毒性和ADCC的能力。本發明的一個實施方案是式(II)的GLP-2模擬體，其中Hg-CH2-CH3來自IgG4亞類，并含有Ser228Pro(S228P)取代和P234A/L235A突變。在GLP-2肽序列中具有這些突變以及A2S和A2G的代表性GLP-2才莫擬體的完整多肽序列分別示于SEQIDNO:4和5。這些序列包含模擬體構建體的所有結構域，即GLP2RAg-Lk-V2-Hg-CH2-CH3結構域。預期這些才莫擬體構建體是均一且穩定的群，不觸發FcR介導的效應子功能。本文所示的取代和突變是代表性的；在本發明范圍內的Hg-CH2-CH3結構域可包括其它取代、突變和/或缺失。基于A2G的、具有可變連接物長度的其它代表性的本發明GLP-2模擬體的部分多肽序列示于SEQIDNO:6、7、8、9、lO和ll。這些序列顯示了除CH2和CH3結構域以外的所有結構域。本領域技術人員會理解，CH2和CH3結構域應包含在功能性模擬體中。基于具有SEQIDNO:50、51、52、53、54、55、56和57所示的分多肽序列分別示于SEQIDNO:58、59、60、61、62、63、64和65。這些序列顯示了除CH2和CH3結構域以外的所有結構域。本領域技術人員會理解，Ch2和Ch3結構域應包含在功能性模擬體中。本發明包括能夠在結合時活化GLP-2R的GLP-2模擬體。本發明的模擬體可以廣泛范圍的親和力結合GLP-2R。GLP-2模擬體對GLP-2R的親和力可使用任何合適的方法經試驗確定，例如使用Biacore或KinExA設備的方法、ELISA和竟爭性結合測定。本發明的GLP-2模擬體和多肽可用于治療以腸粘膜上皮炎癥、損傷和/或功能障礙為特征的疾病或癥狀。由于GLP-2作為中樞飽感因子的作用，所以其在骨形成和保持以及中樞神經系統介導的疾病中的作用也是顯著的。可使用本發明的GLP-2沖莫擬體或多肽治療的疾病或癥狀包括但不限于GI疾病，包括SBS、炎性腸病(IBD)、克羅恩氏病、結腸炎、胰腺炎、回腸炎、炎性腸梗阻(手術后的和其它病因的)、與癌癥化療和/或放療相關的粘膜炎、由完全腸胃外營養或局部缺血引起的腸萎縮癥、骨相關疾病如骨質疏松癥、包括肥胖在內的營養相關疾病以及兒科GI疾病，包括在新生嬰兒中由于壞死性小腸結腸炎引起的腸衰竭。本發明的GLP-2;f莫擬體或多肽還可以用于預防炎性腸梗阻、減輕炎性腸梗阻的癥狀和治療炎性腸梗阻。因此，本發明的另一方面是包含至少一種本發明的GLP-2模擬體或多肽和本領域已知的藥學上可接受的載體或稀釋劑的藥物組合物。所述載體或稀釋劑可為溶液劑、懸浮劑、乳濁劑、膠體或粉末。本發明的GLP-2模擬體或多肽被配制為治療或預防有效量的藥物組合物。術語"有效量"一般指有效治療必需的模擬體或多肽的量，有效治療即尋求治療的癥狀或疾病的部分或完全緩解。用于降低上述癥狀或疾病的發作可能性的預防性治療包含在有效治療的定義中。所述組合物可任選地包含至少一種可用于治療本文所討論病癥的其它化合物、蛋白或組合物。例如，可與谷胺酰胺或其它營養補充物組合使用的本發明模擬體或多肽涉及增加體重、幫助腸恢復或改善營養吸收。此外，還設想了與抗炎劑的組合。本文和權利要求中使用的術語"與...…組合"是指所述藥劑可在混合物中一起給予哺乳動物，或作為單個藥劑同時給予哺乳動物，或作為單個藥劑按照任何順序序貫給予哺乳動物。核蘇，.....載體和細胞系本發明的另一方面是分離的核酸分子，其包含編碼本發明的至少一種GLP-2模擬體或多肽的多核芬酸、與所述多核香酸互補或與所述多核苷酸具有顯著同一性。本發明的其它方面包括含有編碼本發明的至少一種GLP-2才莫擬體或多肽的核酸分子的重組載體以及能夠表達所述核酸分子的細胞系和生物體。核酸、表達載體和細胞系一般可用于生產本發明的才莫擬體。在一個實施方案中，本發明的核酸組合物編碼的多肽具有與SEQIDNO:4、5、6、7、8、9、10、11、42、43、44、45、58、59、60、61、62、63、64、65、74、75和77中的任一個相同或基本同源的氨基酸序列。編碼示于SEQIDNO:5、6、7、8、9、10、11、42、43、44、45、58、59、60、61、62、63、64、65、75和77的多肽序列的代表性核酸序列分別示于SEQIDNO:12、13、14、15、16、17、18、46、47、48、49、66、67、68、69、70、71、72、73、76和78。還提供了上述核酸的等位基因變體。典型地，在用于制備本發明的GLP-2模擬體或多肽的表達載體中使用本發明的核酸。在本發明范圍內的載體提供了真核生物表達必需的元件，包括病毒啟動子驅動的載體，例如CMV啟動子驅動的載體，例如pcDNA3.1、pCEP4以及它們的衍生物、桿狀病毒表達載體、果蠅表達載體和由哺乳動物基因啟動子驅動的表達載體，例如人Ig基因啟動子。其它實例包括原核生物表達載體，例如T7啟動子驅動的載體如pET41、乳糖啟動子驅動的載體和阿拉伯糖基因啟動子驅動的載體。本發明還涉及表達本發明的GLP-2對莫擬體或多肽的細胞系。宿主細胞可為原核細胞或真核細胞。代表性的真核細胞為哺乳動物細胞，例如但不限于COS-l、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、HepG2、653、SP2/0、NS0、293、HeLa細胞、骨髓瘤細胞、淋巴瘤細胞或其任何衍生物。最優選地，宿主細胞為HEK293、NS0、SP2/0或CHO細胞。本發明的細胞系可穩定表達至少一種GLP-2;f莫擬體。所述細胞系可通過本領域眾所周知的穩定或瞬時的轉染方法產生。本發明還提供表達至少一種GLP-2模擬體或多肽的方法，其包括在其中GLP-2才莫擬體或多肽以可檢測的量或可回收的量表達的條件下培養細胞系。本發明還提供產生至少一種GLP-2^t擬體或多肽的方法，包括在體外或原位條件下翻譯編碼GLP-2才莫擬體或多肽的核酸，使得GLP-2才莫擬體或多肽以可檢測量或可回收量表達。本發明還包括通過以上方法生產的GLP-2模擬體或多肽。GLP-2模擬體可通過眾所周知的方法回收和純化，包括但不限于A蛋白純化、硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水作用層析、親和層析、羥磷灰石層析和凝集素層析。反向高效液相層析(RP-HPLC)也可以用于純化。或者，本發明的GLP-2衍生多肽可通過本領域技術人員眾所周知的化學合成技術制備。通過重組或化學方法生產的本發明多肽可通過本領域眾所周知的方法回收和純化。使用方法GLP-2模擬體或多肽尤其可用作研究試劑和治療劑。一方面，本20發明涉及改變GLP-2生物活性的方法，包括向其需要的哺乳動物提供至少一種GLP-2^^莫擬體或多肽。GLP-2才莫擬體或多肽可通過GLP-2R活化細胞信號轉導級聯。具體地說，GLP-2模擬體或多肽可用作GLP-2R的激動劑。術語"激動劑"在最廣義上使用，包括能夠直接或間接地、部分或完整地活化、增加或促進GLP-2R的一種或多種生物活性的分子。本發明還提供減弱至少一種GLP-2相關病癥或疾病的癥狀或治療至少一種GLP-2相關病癥或疾病的方法，包括給予其需要的患者治療有效量的至少一種GLP-2模擬體或多肽藥物組合物。適于使用本發明方法治療的病癥和疾病包括但不限于GI疾病，包括SBS、克羅恩氏病和兒科GI疾病、與癌癥化療相關的粘膜炎、IBD、炎性腸梗阻和上述的其它疾病禾o病癥。GLP-2優先與主要存在于腸神經系統的神經元和含有GLP-2的腸內分泌細胞上的GLP畫2R相互作用(Guan等，Gastroenterology130:150-164(2006))。GLP-2的其中一種主要功能是促進絨毛隱窩中的柱狀細胞增殖，在絨毛隱窩中，GLP-2增強上皮細胞更新和粘膜傷口愈合(Bulut等，Regul.Pept.121:137-43(2004))，增強粘膜屏障功能(Benjamin等，Gut47:112-119(2000))，并抑制細胞經由凋亡死亡(Brubaker和Dmcker,Endocrinology145:2653-2659(2004))。業已表明這些作用是神經依賴性的，因為GLP-2R在隱窩柱狀上皮細胞中不表達(Bjerknes和Cheng,Pro"Natl,Acad.Sci.U.S.A.98:12497-12502(2001))。腸神經元上存在GLP-2R提示，GLP-2可改變動力性以及在腸炎癥中起作用的神經-免疫相互作用。因此，本發明還提供預防炎性腸梗阻、減輕炎性腸梗阻的癥狀或治療炎性腸梗阻的方法，包括給予其需要的患者GLP-2多肽組合物或GLP-2模擬體組合物。本文使用的"炎性腸梗阻"可為胃腸道的任何部分的腸梗阻，例如胃、小腸和/或結腸。另外，"炎性腸梗阻"可由引起腸梗阻的任何因素引起，例如手術，包括腹部手術，例如移植手術或非移植手術的腹部手術；腸手術，例如腸切除；以及整形手術；外傷性損傷，例如跌倒、車禍、個人傷害或由外傷性損傷引起的任何后遺癥，例如肢體骨折、肋骨骨折、脊骨骨折、胸部病變、局部缺血、腹膜后血腫；腹膜內炎癥，例如腹腔感染、急性闌尾炎、膽嚢炎、胰腺炎、輸尿管絞痛、基礎性肺炎；心肌梗塞；代謝紊亂；或任何其組合。如上所述，GLP-2模擬體或多肽藥物組合物包含有效量的至少一種GLP-2模擬體或多肽和藥學上可接受的載體或稀釋劑。針對給定治療的有效量，無論是治療性的還是預防性的，一般都取決于許多不同的因素，包括給藥方法、目標部位和給予的其它藥物。因此，治療劑量需要逐步調整，以使安全性和有效性最佳。本發明的方法任選地還可以包含連同用于治療以上列出疾病的標準療法的共給予或聯合療法。給予的方式可為任何適宜的途徑，以將藥學上有效量的本發明GLP-2模擬體或多肽傳遞給宿主。例如，GLP-2模擬體或多肽可經胃腸外給予傳送，例如皮下、肌內、皮內、靜脈內或鼻內給予，或本領域已知的任何其它方法。參考以下實施例進一步描述本發明。這些實施例僅闡述本發明的各個方面，無意限制本發明。實施例1GLP-2模擬體在哺乳動物細胞中的克隆、表達和純化編碼A2SGLP-2的核酸序列以2步PCR擴增產生。第一輪擴增使用正向引物GATGAACACCATTCTTG-3'(SEQIDNO:37)和反向引物TTATCAAGAATGGTGTTCATCTC-3'(SEQIDNO:38)進行。解鏈溫度、退火溫度和延伸溫度分別設定為96°C、48。C和72。C。進行3輪反應。對于第二輪擴增，正向引物包含NotI限制酶識別位點，反向引物包含BamHI位點。正向引物的序列為5'畫TTTGCGGCCGCCCAAAGTATACAGGCG-3'(SEQIDNO:39),反向引物為5'-AAAGGATCCGTCAGTGATTTTGGTCTGAATCAACCAG畫3'(SEQIDNO:40)。解鏈溫度、退火溫度和延伸溫度分別設定為96°C、48°C和60。C。進行30輪反應。以相同的方法產生編碼A2GGLP-2的核酸序列，只是在第一輪擴增中使用的正向引物為5'-CCAAAGTATACAGGCGCATGGCGATGGTTCTTTCTCTGATGAGATGAACACCATTCTTG-3'(SEQIDNO:41)。使用標準克隆方法，將擴增的PCR產物(A2S和A2GGLP-2)克隆入CMV啟動子驅動的人IgG4ACH1、Ser至Pro、Ala/Ala表達載體的Notl/BamHI位點中。A2S和A2GGLP-2IgG4模擬體在HEK293E細胞中瞬時表達，并使用A蛋白親和層析按照標準方法由條件培養基純化。由A蛋白親和柱洗脫的物質還經過大小排阻柱，用于進一步純化。純化的A2S和A2GGLP-2模擬體通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和偶合靜態光散射分析(SEC-SLS)的大小排阻層析進行分析。在還原和非還原變性條件下純化的模擬體在SDS-PAGE上的遷移在預期的范圍內。通過SEC-SLS分析表明，具有約123KD分子量的蛋白質對應于模擬體的二聚體。因為GLP-2模擬體作為單體在SDS-PAGE凝膠上遷移，所以二聚化是經由非共價作用。cAMP表達測定為了評價GLP-2模擬體的體外活性，開發了cAMP表達測定。為實現此目標，通過轉染HEK293E細胞產生表達突變的人GLP-2R的克隆細胞系。突變的人GLP-2R與野生型人GLP-2R(SEQIDNO:35)的不同之處在于C末端胞內區中的3個氨基酸位置(SEQIDNO:36)。GLP-2肽刺激該細胞系中的cAMP表達，刺激是特異性的，因為對照肽不刺激cAMP表達。比較A2S和A2GIgG4GLP-2模擬體與對應的GLP-2肽(A2S和A2G)在重組細胞系中刺激cAMP表達的能力。簡而言之，將細胞與個體GLP-2才莫擬體或GLP-2肽溫育30分鐘。cAMP表達使用cAMPDirectScreenSystem(目錄號CSD200，AppliedBiosystems,Bedford,MA)定量。A2S和A2G肽的ECso分別為0.5nM和0.8nM;A2S和A2G模擬體的ECso分別為2.2nM和3.8nM。因此，在該測定中GLP-2模擬體的功效比所述肽低約4倍。實施例3GLP-2模擬體變體為研究GLP-2模擬體上連接物長度的作用，產生具有多種連接物長度的不同構建體。核心區的序列示于以下的表l。這些變體在HEK293細胞中瞬時表達，通過SDS-PAGE純化和分析。SEC-SLS分析表明，除了一個峰對應于模擬體的二聚體以外，具有65-70kDa的分子量的峰對應于模擬體的單體。觀察到連接物長度越長，單體群的比例越高。在實施例2描述的cAMP表達測定中測試連接物長度和V2區變體。數據證實，依據ECso檢測的GLP-2模擬體活性與連接物長度正相關，即具有較長連接物的模擬體具有較高活性(表1)。表1.核心氨基酸序列和具有可變連接物長度的GLP-2模擬體的EC50<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>U937細胞裂解物溫育達0、12或24小時。此后，GLP-2模擬體變體使用A蛋白珠純化，并在SDS-PAGE凝膠上解析。如圖1所示，與A2GGLP-2模擬體(SEQIDNO:5)相比，Pro取代變體(SEQIDNO:43或44)在24小時的測試時間段內幾乎沒有降解。總之，Pro取代變體在體外更抗蛋白水解。實施例4GLP-2模擬體刺激小腸中的粘膜重量增加為證實GLP-2模擬體的體內活性，用GLP-2模擬體注射CD1小鼠，評價小腸中的終點。簡而言之，每日皮下注射給予雌性CD1小鼠A2GGLP-2肽(SEQIDNO:3)、A2GGLP-2IgG4模擬體(SEQIDNO:5)或對照模擬體，共計10天。此后，麻醉小鼠，取出小腸，用鹽水沖洗，如下所述處理。具體地說，收集4cm部分(l)緊接幽門的遠端(十二指腸)，(2)Treitz韌帶的前2cm遠端(空腸)，和(3)緊接盲腸的近端(回腸)。由Treitz韌帶的約6cm遠端至盲腸的4cm近端的剩余小腸用于制備粘膜刮屑。由剩余物的近和遠末端去除等距離，直至留下15cm部分，剩余物被縱向切開，淋洗，并使用玻璃顯微鏡載玻片的短端去除粘膜層。檢測完整腸段和粘膜的濕重。由不同小鼠的空腸和回腸之間的15cm腸段獲得的粘膜刮屑的重量示于圖2。對于注射A2GGLP-2模擬體的小鼠，觀察到粘膜濕重劑量依賴性增加。與對照模擬體相比，于0.8和8mg/kg(分別為0.26和2.6nmol)的增加是統計學顯著的(分別為pO.0001和p<0.0004)。在注射2.5mg/kg(13.3nmol)A2GGLP-2肽的小鼠中也觀察到統計學顯著增加(p0.0001)。相比之下，A2GGLP-2模擬體以比A2GGLP-2肽低50倍的劑量(基于體積摩爾)在體內有效。實施例526GLP-2模擬體的藥代動力學為檢測GLP-2模擬體的藥代動力學，CD1小鼠靜脈內或皮下給藥3mg/kg的A2GGLP-2模擬體(SEQIDNO:5)。于不同時間點將血液收集入含蛋白酶抑制劑的檸檬酸鹽緩沖液中，以最小化離體降解的可能性，并通過離心分離血漿。使用時間分辨熒光(TRF)測定檢測活性模擬體。活性模擬體反映出所述肽的完整N末端仍連接至^^擬體的Fc區。基于TRF試驗，在小鼠中計算的A2GGLP-2^t擬體的半衰期為26.5小時。相比之下，在人中報告的GLP-2肽的半衰期為7.2±2分鐘(Hartmann等，J.Clin.Endocrinol.Metab.85:2884-2888(2000》。因此，A2GGLP-2模擬體的半衰期比GLP-2肽的半衰期高200多倍。在類似的試驗中，靜脈內給藥獼猴1mg/kg的A2GGLP-2沖莫擬體。基于TRF數據，在獼猴中計算的A2GGLP-2沖莫擬體的半衰期為4.8天。實施例6GLP-2才莫擬體的藥效動力學基于GLP-2模擬體的延長的藥代動力學，預期GLP-2模擬體具有較長的響應時程。為評價A2GGLP-2模擬體的藥效動力學，每曰一次、每隔一天一次、每周一次或僅在研究開始時一次給藥小鼠。為控制動物處理，在小鼠不接受A2GGLP-2模擬體的日子給它們注射陰性對照模擬體，即沒有GLP-2肽的模擬體免疫球蛋白骨架。A2GGLP-2^:莫擬體和陰性對照的劑量對所有組別都是4mg/kg(1.3nmol/kg)。研究時程為11天，組織如在實施例4中所述處理。與對照模擬體相比，每周一次給藥A2GGLP-2模擬體的小鼠具有顯著增加的粘膜重量。在每天一次或每隔一天一次給予A2GGLP-2模擬體時差異更顯著。對小腸部分的濕重觀察到類似的模式。對除單次給藥試驗之外的所有方案，在十二指腸和空腸中均觀察到超過對照模擬體的顯著重量增加。.實—燕斂.7GLP-2中的突變防止肽二聚化野生型GLP-2肽(SEQIDNO:l)以高濃度二聚化。例如，在PBS(pH7.5)中，GLP-2于0.4mg/mL作為單體存在，但是于2mg/mL為單體(約20%)和可逆地自締合的二聚體(約80。/。)的混合物(未顯示數據)。自締合對開發和制造均一治療劑提出了挑戰。設計保留野生型GLP-2生物活性并于高濃度作為單體存在的肽類似物(SEQIDNO:52、54、55和74)。合成GLP-2(A2G、L17Q)(SEQIDNO:54)和GLP-2(A2G、N16G、L17Q)(SEQIDNO:55)，并純化至>95%純度。在類似物表征中納入肽GLP-2(SEQIDNO:l)、GLP-2(A2G)(SEQIDNO:3)和GLP-1(SEQIDNO:79)作為對照。肽的溶液分子量通過SEC-SLS檢測。簡而言之，0.4-2.0mg/mL的肽的PBS溶液(pH7.5)經Superdex肽柱分級分離(AmershamPharmacm)。洗脫峰通過690nm的靜態光散射監測，溶液分子量于UV280nm使用Astra軟件包(WyattInc.)測定。GLP-1在1mg/ml作為單峰洗脫，分子量在預期的單體大小之內。GLP-2和GLP-2(A2G)顯示出類似的重疊二聚體和單體峰分布。類似物肽GLP-2(A2G、L17Q)和GLP-2(A2G、N16G、L17Q)作為單峰洗脫，分子量與主要的單體肽一致。測試肽的二級結構使用0.2mg/mL肽的PBS溶液測定。簡而言之，一式三份以1nm間隔于25。C在0.1cm光程池中收集CD光譜。二級結構通過使用CD光譜軟件(CDSpectraDeconvolution軟件2.1)擬合CD光譜確定。所有的測試肽都包含對應于存在的ot螺旋的峰。但是，在類似物肽GLP-2(A2G、L17Q)和GLP-2(A2G、N16G、L17Q)中的螺旋含量為約17%,類似于GLP-1的螺旋含量，低于GLP-2和GLP-2(A2G)的螺旋含量(表3)。表3.在GLP肽中螺旋和無規巻曲結構的百分率<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>另外，已知三氟乙醇(TFE)在肽中誘導螺旋形成(Soennichsen等，Biochemistry31:8791(1992))。因此，使用TFE進行螺旋傾向性分析。簡而言之，以含0%、1%、5%、15%、33。/。或50。/。TFE的PBS(pH7.5)將測試肽稀釋至0.2mg/mL。收集CD光譜，在數據平均、扣除緩沖液和曲線平滑后產生CD作圖。螺旋傾向性值由222nm的平均殘基橢圓率(MRE)對TFE。/。作圖獲得。于222nm實現CD光譜50%轉變的TFE濃度用作螺旋傾向性的檢測結果。結果表明，GLP-2和GLP-2(A2G)顯示出較大的螺旋傾向性，轉變為最大螺旋信號需要約16%的TFE。相比之下，GLP-1具有較低的螺旋傾向性，螺旋轉變需要>20%的TFE。顯然，類似物肽GLP-2(A2G、L17Q)和GLP-2(A2G、N16G、L17Q)的螺旋轉變均需要〉20。/。的TFE，與GLP-1的相似性比GLP-2更緊密。因此，L17Q取代降低了GLP-2肽的螺旋形成潛力。實施例8GLP-2中的突變防止模擬體二聚化編碼具有A2G、L17Q(SEQIDNO:75)和A2G、N16G、L17Q(SEQIDNO:77)的GLP-2沖莫擬體類似物的核酸序列使用Stratagene的QuickChangeXL試劑盒產生。這些模擬體變體在HEK293E細胞中瞬時表達，并按照實施例1中所描述的步驟純化。基于SEC-SLS分析，GLP-2(A2G、N16G、L17Q)模擬體表現出與單體一致的分子量，而GLP-2(A2G、L17Q)模擬體表現出反映單體和二聚體混合物的分子量。實施例9GLP-2類似物模擬體的體外活性以cAMP表達測定檢測GLP-2類似物的體外活性。該測定基于AppliedBiosystems的cAMPDirectScreenSysstem，4吏用在HEK293E細胞中表達突變huGLP-2R的細胞系。將0.01nM至1.0|liM濃度范圍的肽在含0.5%BSA的PBS中的溶液加入至懸浮在96孔才反中的約50,000個細胞中。于37。C溫育30分鐘后，按照生產商的方法(AppliedBiosystems發光方案cAMP-ScreenDirectSystem)加入裂解纟爰沖液，之后加入發光試劑(AppliedBiosystems)。使用T叩Count液體閃爍分析儀(PerkinElmer)定量發光，數據使用Softmax軟件(MolecularDevicesCorporation)處理。得自cAMP水平對肽濃度作圖的EC-50值列于以下的表5。表5:得自cAMP對肽濃度作圖的GLP-2肽的EC-50值結構Wt-GLP-2GLP-2(A2G)GLP-2(A2G、雇G、L17Q)GLP-2(A2G、L17Q)cAMP體外ECso值(nM)1.61.93.55.2數據表明，相對于野生型GLP-2,GLP-2(A2G、n16g、l17q#GLP-2(a2g、的活性分別僅低至2倍和3倍。實施例10A2G-GLP-2肽加速上GI轉運為測試A2G-GLP-2對正常小鼠中上胃腸道轉運的作用，將小鼠隨機分為2組(每個測試組14只動物)。連續10天每組每日接受一次A2G-GLP-2肽(50jtig/小鼠)或磷酸緩沖鹽水溶媒的皮下注射(總體積200ml)。在研究當日，使用胭脂紅染料技術檢測上胃腸道轉運。將0.25ml30混合入0.5%(重量/體積)甲基纖維素中的6%(重量/體積)胭脂蟲洋紅粉溶液的試驗餐通過18號彎曲銅管胃內給予喂飼小鼠。在口服給予測試餐后，將小鼠放回到它們的居住籠中。在給予標記餐后20分鐘，通過頸推脫臼使小鼠快速安樂死，由遠端結腸開始直至胃幽門切下完整的胃腸道。將切除的腸器官縱向平行于直線米尺放置，小心避免拉伸腸器官。檢測胭脂紅染料前沿經由小腸移動的直線距離以及小腸的總長度。上胃腸道轉運表示為在20分鐘測試期內脂紅染料前沿移動行程除以整個小腸長度的百分率位移小腸％=[染料前沿經由小腸的移動距離(cm)/完整小腸長度(cm)x100]。如在圖3中所示，A2G-GLP-2治療導致上胃腸道轉運加速。實施例11GLP-2模擬體加速上GI轉運為測試GLP-2模擬體對正常小鼠中上胃腸道轉運的作用，將小鼠隨機分為2組(每組4只動物)。每組在檢測胃腸轉運之前4天接受單次注射的A2GGLP-2模擬體(SEQIDNO:5)(4mg/kg)或IgG4陰性對照。在研究當日，使用FITC-葡聚糖法檢測上胃腸道轉運。該方法既提供胃腸道轉運的檢測結果，又提供測試餐沿著胃腸道的分布模式的顯示。通過18號彎曲飼管胃內給予150mlFITC-葡聚糖溶液(5mg/ml綴合熒光素-異^l氰酸酯的70,000分子量葡聚糖在0.5%甲基纖維素/去離子水中的溶液)喂飼小鼠測試餐。在口服給予FITC-葡聚糖測試餐之后，將小鼠放回到它們的居住籠中。已表明30分鐘的測試期是檢測加速轉運的最佳時程，而45分鐘測試期對檢測延遲轉運最佳。在適宜的測試期后，通過二氧化碳接觸處死小鼠。取出由食管下端括約肌至末端結腸的完整胃腸道。沿著腸系膜緣打開腸段。將胃的組織和內腔內容物、10段相等的小腸、盲腸和3段相等的結腸置于含1mlPBS的單個Eppendorf管中。在臺式渦旋器上劇烈混合組織，固體物質通過離心沉淀。一式兩份在96孔焚光讀板器上讀取澄清上清液的等份試樣，以定量每個腸段的熒光信號大小。這些值用于計算幾何中心(GC)，其被定義為沿著胃腸道的熒光信號的加權平均分布GC-i:(每段的總熒光信號的百分率x段數)/100。依據1-15的分級，較高的值代表較快的轉運速率。如圖4所示，1劑GLP-2模擬體治療導致上胃腸道轉運加速。模擬體誘導的FITC-葡聚糖分布模式的遷移示于上圖。胃中的標記降低，大量標記向更遠的小腸段全面遷移。在下圖中計算用于統計學比較的GC。正常小鼠在30分鐘測試時間段后表現出G06，其未被采用IgG4骨架的治療改變。采用GLP-2模擬體的治療將GC增加至7.5。實施例12GLP-2模擬體減弱與手術后炎性腸梗阻相關的GI動力性受損由于人IgG4在小鼠中的免疫原性，在以下試驗中使用鼠GLP-2模擬體，即在鼠igG2a骨架中的人A2G-GLP2肽(SEQIDNO:80)。為測試GLP-2模擬體對與手術后炎性腸梗阻相關的GI動力性受損的作用，將小鼠隨機分為3組(每組8只動物)，并用2mg/kg鼠A2G-GLP-2模擬體、IgG2a或PBS治療。1小時后，對小鼠進行剖腹手術和小腸操作。簡而言之，通過吸入異氟烷麻醉雄性CD-1小鼠，并做手術準備。腹部備皮，用消毒液處理。然后給動物蓋上手術巾。經中線剖腹術打開腹部，從腹中取出完整小腸放在無菌手術巾上。然后使用兩個濕潤的無菌棉簽沿著由Treitz韌帶至回盲部的小腸長度輕柔地按壓小腸。然后將小腸放回到腹腔，縫合切口。此后，將小鼠放回到它們的居住籠中。第4組的8只動物用作空白對照。在手術后48小時，所有小鼠都接受口服的FITC-葡聚糖測試餐。在口服喂銅后45分鐘測定胃腸道轉運。如在圖5中所示，空白對照表現出正常的45分鐘轉運(GC-8.2)。腹部手術在PBS治療動物中導致胃腸道轉運顯著延遲。用IgG2a治療對手術誘發的轉運延遲沒有作用，而用鼠A2G-GLP-2模擬體治療導致轉運顯著改善。實施例13GLP-2才莫擬體減弱與手術后炎性腸梗阻相關的細胞炎癥為測試GLP-2才莫擬體對細胞炎癥的作用，如在實施例12中所述誘發手術后炎性腸梗阻。對手術后48小時由小鼠的中段小腸收集的組織進行髄過氧物酶組織化學。簡而言之，由在實施例12中描述的離心管收集中段小腸的區段。如下制備肌肉層的整封標本將所述組織塊(tissueflat)釘在襯有Sylgarcf的培養皿中，并將組織拉伸至其長度的2倍和其寬度的1.5倍。通過精細解剖取出粘膜。然后用100%乙醇固定肌層整封標本達1小時，用PBS洗滌3次，在含0.1%過氧化氫和1mg/mlHanker-Yates試劑的PBS中溫育20分鐘。在用PBS第二次洗滌之后，在玻璃載玻片上制作整封標本，蓋片，并用光學顯微鏡目測。計數6-8個鄰接的200X光學視野中含髓過氧化物酶的白細胞，計算并記錄平均細胞計數。使用Hanker-Yates試劑對髓過氧化物酶(MPO)活性染色的代表性腸肌層整封標本示于圖6。黑點代表浸潤小腸肌肉層的MPO陽性白細胞。在由空白小鼠收集的組織中幾乎沒有發現MPO陽性細胞。在進行小腸手術操作之前，在用PBS治療的小鼠中發現浸潤白細胞數顯著增加。用IgG2a治療對浸潤細胞數沒有影響。相比之下，用鼠A2G-GLP-2才莫擬體治療顯著減少了浸潤細胞數。細胞計數匯編于圖7,用于統計學比較。現在已完整描述了本發明，對本領域一般技術人員顯而易見的是，在不偏離隨附權利要求的精神或范圍的情況下，可對本發明實施許多變更和》務改。權利要求1.一種式(II)的模擬體(GLP2RAg-Lk-V2-Hg-CH2-CH3)(t)(II)其中GLP2RAg為哺乳動物GLP-2R激動劑，Lk為多肽或化學鍵，V2為免疫球蛋白可變區C末端的一部分，Hg至少為免疫球蛋白可變鉸鏈區的一部分，CH2為免疫球蛋白重鏈CH2恒定區，CH3為免疫球蛋白重鏈CH3恒定區，t獨立地為1-10的整數。2.權利要求1的模擬體，其中GLP2RAg具有SEQIDNO:2、3、50、51、52、53、54、55、56、57或74的氨基酸序列。3.權利要求1的才莫擬體，其中Hg、CH2和CH3屬于IgGl亞類。4.權利要求3的才莫擬體，其中Hg的Cys220被Ala取代，而CH2的Leu234和Leu235突變為Ala234和Ala235。5.權利要求1的才莫擬體，其中Hg屬于IgG4亞類，CH2和CH3屬于IgGl亞類。6.權利要求1的才莫擬體，其中Hg、CH2和CH3屬于IgG4亞類。7.權利要求6的模擬體，其中Hg的Ser228被Pro取代，而CH2的Phe234和Leu235突變為Ala234和Ala235。8.權利要求1的模擬體，其中所述模擬體結合GLP-2受體。9.一種模擬體，所述模擬體包含具有示于SEQIDNO:4、5、6、7、8、9、10、11、42、43、44、45、58、59、60、61、62、63、64、65、75或77的序列的多肽。10.—種多核苷酸，所述多核苷酸編碼權利要求1-9中任一項的模擬體。11.一種多核苷酸，所述多核苷酸包含具有示于SEQIDNO:12、13、14、15、16、17、18、46、47、48、49、66、67、68、69、70、71、72、73、76或78的序列或互補序列的多核普酸。12.—種多核苷酸，所述多核普酸包含編碼示于SEQIDNO:4、5、6、7、8、9、10、11、42、43、44、45、58、59、60、61、62、63、64、65、75或77的氨基酸序列的多核香酸。13.—種載體，所述載體包含權利要求11或12的多核苷酸。14.一種細胞系，所述細胞系表達權利要求1-9中任一項的模擬體。15.—種細胞系，所述細胞系包含權利要求13的載體。16.權利要求15的細胞系，其中所述細胞系為HEK293、NSO、SP2/0或CHO細胞。17.—種生產多肽的方法，所述方法包括培養權利要求16的細胞系并純化表達的多肽的步驟。18.—種藥物組合物，所述藥物組合物包含有效量的至少一種權利要求1-9中任一項的模擬體和藥學上可接受的載體或稀釋劑。19.一種改變哺乳動物的GLP-2生物活性的方法，所述方法包括給予哺乳動物^:又利要求18的藥物組合物。20.—種減輕至少一種GLP-2相關病癥或障礙的癥狀或治療至少一種GLP-2相關病癥或障礙的方法，所述方法包括給予其需要的患者權利要求18的藥物組合物。21.權利要求20的方法，其中所述GLP-2相關病癥或障礙為胃腸疾病、骨相關疾病或營養相關疾病。22.權利要求21的方法，其中所述胃腸疾病為短腸綜合征、炎性腸病、克羅恩氏疾病、結腸炎、胰腺炎、回腸炎、粘膜炎或腸萎縮癥。23.權利要求21的方法，其中所述胃腸疾病為兒科胃腸疾病。24.權利要求21的方法，其中所述骨相關疾病為骨質疏松癥。25.權利要求21的方法，其中所述營養相關疾病為肥胖癥。26.—種預防炎性腸梗阻、減輕炎性腸梗阻的癥狀或治療炎性腸梗阻的方法，所述方法包括給予其需要的患者權利要求18的藥物組合物。27.—種多肽，所述多肽包含具有示于SEQIDNO:52、54、55或74的序列的多肽。28.—種藥物組合物，所述藥物組合物包含有效量的權利要求27的多肽和藥學上可接受的載體或稀釋劑。29.—種改變哺乳動物的GLP-2生物活性的方法，所述方法包括給予哺乳動物權利要求28的藥物組合物。30.—種減輕至少一種GLP-2相關病癥或障礙的癥狀或治療至少一種GLP-2相關病癥或障礙的方法，所述方法包括給予其需要的患者權利要求28的藥物組合物。31.—種預防炎性腸梗阻、減輕炎性腸梗阻的癥狀或治療炎性腸梗阻的方法，所述方法包括給予其需要的患者權利要求28的藥物組合物。全文摘要公開了哺乳動物GLP-2模擬體、多肽和核酸。還公開了使用所述模擬體和多肽治療GLP-2相關疾病的方法。文檔編號C12N5/06GK101331224SQ200680047664公開日2008年12月24日申請日期2006年10月24日優先權日2005年10月24日發明者A·E·巴克,B·A·穆爾,J·M·帕爾默,K·奧內爾,K·皮查,S·薩古,T·尼斯波爾申請人:森托科爾公司