專利名稱：通過醛糖還原酶基因型確定白內障的風險率的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于確定哺乳動物中發生白內障風險的方法和組合物，所述哺乳動物進一步包括患有非胰島素依賴型糖尿病的病人。本發明的例證是哺乳動物醛糖還原酶基因的啟動子區域中離散的微衛星標記與白內障發生的遺傳誘因相關，尤其是在患有非胰島素依賴型糖尿病的個體，包括患有II型糖尿病的華人中。所述方法包括檢測微衛星標記Z-2和Z-4，它們包含哺乳動物醛糖還原酶基因的等位基因。利用在測個體的核酸樣品，Z4等位基因的缺乏和Z2等位基因的存在顯示白內障發生的風險增加。相反，如果核酸樣品中缺乏Z2等位基因或存在Z4等位基因則說明白內障發生的風險下降。
背景技術：
眼球的晶狀體是位于靠近眼球前方的擬蛋白(proteinaceous)結構，其負責把光和圖像聚焦到眼球的后面及視網膜上。偶爾，由于不明的緣由，某些晶狀體蛋白會隨著時間的推延而凝結。這導致晶狀體混濁度顯著增加以及視力顯著或完全喪失。這些結塊的蛋白統稱為白內障。白內障的癥狀包括視覺朦朧或模糊、視覺發暈或復視覺，以及黑暗和彩色感覺差。在發達國家，白內障是視覺喪失的最常見原因。
手術及其相關風險仍是白內障患者的唯一選擇。在少數情況下出現并發癥。這些并發癥可包括眼內炎(眼內感染)、囊樣斑狀浮腫(視網膜血管滲漏流體，所述流體累積在視網膜中區，導致中區視力下降)、視網膜脫離(玻璃狀液體通過視網膜中的細淚，導致視網膜從眼球的后壁分離)、背部移位的晶狀體物質(晶狀體物質移位到眼球的玻璃狀腔中)以及脈絡膜出血(脈絡膜或包括視網膜下血管在內的纖細組織中的急性出血，以及其可導致視覺顯著喪失)。
由于存在風險，手術一般直到視覺顯著削弱后才進行。白內障手術和延遲治療的內在風險使得白內障患者選擇非手術治療將是顯著有利的，并且如果早期介入可用，則其是最理想的。然而，目前既沒有藥理的手段來治療發生的白內障，也沒有高度特異的方法來檢測早期的白內障，更沒有方法來篩選有這種疾病傾向的人。
動物研究獲得的進展是鼓舞人心的，某些類型的晶狀體乳濁化作用可得到延遲或預防，這給預防人的白內障的目標帶來了可信性(Jacob(1999)同上)。藥物治療白內障的研究正在推進，提出了許多在研的治療方法。特別是要關注與糖尿病相關的繼發性白內障。
動物模型中有證據表明多元醇途徑可能涉及與糖尿病有關的繼發性白內障的發生。醛糖還原酶催化己糖NADPH依賴性還原成其多元醇，將D-葡萄糖轉化成山梨醇以及將半乳糖轉化成半乳糖醇。山梨醇不易從眼球中擴散出來。幸運的是，醛糖還原酶對葡萄糖的親和性低，并且在正常血糖(euglycemic)條件下很少有山梨醇產生。然而，在高血糖(hyperglycemic)條件下，山梨醇累積(Ko等，(1995)Diabetes 44727)。作為多元醇途徑中的第一限速酶，醛糖還原酶已成為調查研究的靶子(Lee等(1995)PNAS 922780；和Lee等(1999)FASEB J.1323)。監控該酶可提供需要治療性介入的診斷指示劑(Cogan等(1984)Ann.Intern.Med.10182)。近來，Ko及其同事已經發現，在患有早發性II型糖尿病的香港華人的病人組中，醛糖還原酶基因5’端的微衛星多態性與增生性視網膜病相關(Ko等，同上)。此種關聯隨后在日本人(Ikegishi等(1999)Life Sci.652061)以及南美人(Olmos等(1999)RevistaMedicadeChile 127399)中得到證實。
最近的研究已經提示，某些等位基因可用于確定一些視覺紊亂的遺傳傾向。例如，Ko等證實，醛糖還原酶基因5’端的二核苷酸重復多態性微衛星標記與早發性糖尿病性視網膜病相關(Ko等，同上)。微衛星DNA序列通常是高度多態性的，因此，可能是研究基因與疾病之間關系的良好標記。這些標記的分布可顯示特定疾病的遺傳傾向，所以當有理由懷疑特定疾病發生的可能性高于平均水平時，例如，當疾病具有家族性關系時，或其他因素使個體易患遺傳病，例如肥胖與糖尿病之間的聯系，就可有效加以利用。
相關文獻醛糖還原酶抑制劑已顯示，在動物模型中可有效用于防止視網膜病，一種位于眼球后部的視網膜疾病，以及白內障，一種位于眼球前部的晶狀體疾病。藥物介入的可能性已由Robison等(1995)InvestOphthalmol Vis Sci 362368進行了研究，他們檢查了一種醛糖還原酶的抑制劑——索比尼爾(sorbinil)用于預防白內障和糖尿病性視網膜病的益處，Devamanoharan等(1995)J Ocul Pharmacol Ther 11527，其中抗高血壓藥物戊脈安用于預防白內障，以及Sato等(1999)Exp Eye Res68601，其中結構各異的醛糖還原酶抑制劑顯示可防止白內障形成。這些研究表明，一旦有白內障的治療方法開發出來，它們就可成功得到使用。然而，所有這些研究都是采用白內障的晚期形式而非早期形式進行的，并且個體是白內障受到誘導的動物模型，而非從總人群中經常規篩選和診斷的個體。
對于醛糖還原酶基因啟動子區域的Z-2等位基因和視網膜病(視網膜的疾病，位于眼球后部的結構，其包含光受體、視網膜色素上皮細胞以及支持組織)之間關系的討論，參見Olmos等(2000)Diabetes ResClin Pract 47169，他將這種標記與快速發展的視網膜病聯系起來，以及Ko等，(同上)闡述了Z-2等位基因與患有非胰島素依賴型糖尿病的病人早發性視網膜病之間的關系。
發明概述本發明涉及通過檢測與糖尿病個體中白內障發生相關的遺傳標記來確定患有非胰島素依賴型糖尿病的哺乳動物中發生白內障風險的方法和組合物。遺傳標記包括醛糖還原酶基因啟動子區域的微衛星多態性，這些多態性已被確定與白內障相關，尤其是在患有II型糖尿病的華人血統的成員中，他們處于糖尿病相關的白內障的特定風險中。
確定個體發生白內障風險的方法包括下列步驟獲得含有基因組核酸的樣品，如尸檢或活檢樣本的組織，或體液如人或非人哺乳動物的血液樣品，以及將該樣品與核酸引物對在一定條件下接觸用于擴增目的DNA序列，所述條件如那些在聚合酶鏈式反應(PCR)中普遍采用的條件。然后，可將特異性擴增的DNA通過檢測和/或鑒定DNA的眾多機理之一加以檢測，包括探針雜交、原位雜交、核酸酶分析、色譜、放射自顯影、熒光自顯影、Southern印跡分析、直接測序、限制性酶片段分析、單基因座DNA圖(single-locus DNA profiling)、多基因座DNA圖(multi-locus DNA profiling)、微陣列分析、片段電泳遷移率或遷移率變動分析。或者，將個體基因組的特定目的基因進行限制性斷裂，然后利用PCR引物對和PCR限制性片段長度多態性分析(RFLP)技術來鑒定目的多態性的存在或缺乏而加以篩選，在此情況下，特定目的基因是Z-2或Z-4等位基因，以用于確定發生白內障的哺乳動物的風險水平的目標。本發明也提供了采用醛糖還原酶的抑制劑來治療經鑒定具有發生白內障的遺傳傾向的哺乳動物的方法。組合物包括與編碼醛糖還原酶基因的核酸雜交的核酸探針，用于擴增Z-2和/或Z-4等位基因的探針、引物，以及含有探針的微陣列。
本發明發現了用于鑒定患有非胰島素依賴型糖尿病的哺乳動物個體發生白內障的風險水平，該信息可用來開發給哺乳動物定制的治療方案，以及用于治療和/或預防糖尿病性并發癥，如經鑒定具有發生白內障風險增加的個體中的白內障。
附圖簡述
圖1示出人醛糖還原酶基因的啟動子區域，其中黑體部分是(AC)n微衛星重復序列，下劃線部分是一對正向引物和反向引物序列的位置。
圖2A示出圖1的下劃線區域，并且鑒定成正向引物，該引物可以用來擴增人醛糖還原酶基因的啟動子區域的微衛星重復序列區域。
圖2B示出圖1的下劃線區域，并且鑒定成反向引物(在圖2B以5’到3’的方向顯示)，該引物可用來擴增人醛糖還原酶基因的啟動子區域的微衛星重復序列區域。
圖2C示出人醛糖還原酶基因啟動子，即微衛星重復序列區域。AC微衛星重復序列以黑體出現。
具體實施方案描述本發明提供組合物和方法，其中醛糖還原酶基因的微衛星標記用作患有非胰島素依賴型糖尿病的哺乳動物，尤其是華人血統的人中白內障發生風險的指示劑。本發明的組合物包含(1)用于擴增醛糖還原酶基因啟動子區域的微衛星標記的多核苷酸引物，各個引物具有與哺乳動物醛糖還原酶基因的不同等位基因唯一相關的序列；(2)核酸探針，其含有與編碼醛糖還原酶基因的微衛星標記的核酸雜交的核苷酸序列；(3)寡核苷酸探針，其含有核苷酸序列及其互補序列；和(4)核苷酸探針的微陣列，其含有與編碼醛糖還原酶基因的微衛星標記的核酸雜交的核苷酸序列。本發明的方法包括(1)從哺乳動物中獲取核酸樣品；(2)使核酸樣品和引物組結合以用來擴增目的基因組DNA的區域，和/或(3)通過特異DNA序列檢測所用的眾多方法之一，使核酸樣品與探針結合以用來鑒定與哺乳動物醛糖還原酶基因的啟動子區域相關的特定等位基因的是否存在。可用方法的例子包括包括原位雜交、核酸酶分析、限制性酶片段分析、色譜、Southern印跡分析、直接測序、單基因座DNA圖(single-locus DNA profiling)、多基因座DNA圖(multi-locusDNA profiling)、微陣列分析、片段電泳遷移率或遷移率變動分析。探針可附著于固相支持物上，而該固相支持物采用微陣列的形式。
短語“華人人群的成員”和“華人血統的人”旨在包括華人血統的個體。華人人群的成員可由HLA單元型更特異性地加以鑒定。例如，HLA I型和II型在香港華人人群中的頻率已由Chang和Hawkins(HumImmunol(1997)56125)研究。已進行了許多研究來確定HLA I型和II型等位基因，它們在華人人群的成員中被頻繁地或者甚至被唯一地發現，以及確定具有高相關性的等位基因。Shaw等和Shen等已研究了臺灣華人人群的HLA多態性、等位基因頻率及其關系(Tissue Antigens(1997)50610；Tissue Antigens(1999)5351；J Formos Med Assoc(1999)9811)。中國大陸的華人個體中發現的等位基因頻率及其關系的報道參見Trejaut等(Eur J Immunogenet(1996)23437)、Shieh等(Transfusion(1996)36818)、Zhao等(Eur Jlmmunogenet(1993)20293)、Wang等(Tissue Antigens(1993)41223；Hum Immunol(1992)33129)、Lee等(Eur J.Immunogenet(1999)26275)和Gao等(Hum Immunol(1991)32269；Tissue Antigens(1991)3824；Immunogenetics(1991)34401)。另外，華人個體可由本領域技術人員眾所周知的“DNA指紋識別”技術來客觀地限定，其中將特異于華人血統個體的微衛星、短同向重復序列(STR)和可變數同向重復序列(VNTR)基因座加以鑒定。這種種族的基因型研究的許多例子已有報道(Meng等(1999)J Forensic Sci 441273；Yoshimoto等(1999)Int J Legal.Med 11315；Wu等(1999)JForensic Sci 441039；Lee等(1999)Eur J Immunogenet 26275；Evett等(1996)Am J Hum Genet 58398；Shieh等(1996)Transfusion 36818；Gill和Evett(1995)Genetica 9669；Balazs(1993)EXS 67193；Lan等(1992)Arch Kriminol 189169；Fernadez-Vina等(1992)Hum Immunol 33163；和Hwu等(1992)J Formos Med Assoc 91839)。上述所有這些文獻在此引作參考。因此，風險評估可包括對Z-2和Z-4等位基因進行評估，有或沒有與華人血統相關標記的評估。
本發明的優點包括篩選方法將使早期檢測白內障成為可能，所以允許早期開始治療方法，因為白內障治療可能在預防白內障病原學中是更有效的，而及早治療給處于風險的個體提供了更好診斷的可能性。白內障手術具有內在的風險，因此一般是直到視覺受到顯著削弱時才進行。處于風險的患者可得到更有力的篩選以檢測任何指示白內障發生的早期變化。對白內障患者選擇非手術治療和早期介入將是最理想的。本發明篩選方法與白內障的早期檢測和治療相結合，將使所述檢測和提出的治療在預防或早期介入白內障病原學中更有效。
本發明的優點也包括篩選方法利用了表示白內障發生風險增加或降低的遺傳標記。遺傳標記的篩選方法是眾所周知的，并可設定成非侵入性、快速和低成本的。這些方法當給患有非胰島素依賴型糖尿病的哺乳動物，包括患有II型糖尿病的人施用時，發現特別有價值。鑒定哺乳動物特殊多態性存在與否的優點在于，有了這種信息衛生保健提供者，包括醫師和獸醫，能夠給人和非人的單個患者提供更特異和合適的治療方法，以及能夠指導有關治療和生活方式的調節以改善或延遲白內障的發生，或者當發生白內障的概率降低時，減少對不合適醫學介入的擔憂和可能。
本發明的優點另包括指示白內障的遺傳標記的典型性組合可用來篩選白內障發生風險可能增加的個體人群。這些個體包括患有II型糖尿病的病人，因此，在白內障形成或進一步發展之前，他們可采取預防性措施或給予合適的治療。家族成員也可對患病個體的特殊多態性加以篩選，從而快速鑒定白內障發生風險增加的家族成員。本發明的優點還延伸到非人哺乳動物。狗和其他寵物易受到非胰島素依賴型糖尿病和白內障的影響。例如，診斷患有非胰島素依賴型糖尿病的動物的主人可對白內障的傾向加以篩選，以及主人咨詢有關動物最適合的治療方案。
為了篩選實驗，從任何有核細胞源或體液中獲取基因組DNA樣品。臨床實踐中有用的細胞源的例子包括血細胞、口腔細胞、子宮頸陰道細胞、尿液中的上皮細胞、胎兒細胞或任何通過活檢采得的組織中存在的細胞。體液包括血液、尿液、腦脊液、羊膜水以及感染或炎癥部位的組織流出物。利用本領域眾多標準方法中的任一種，將DNA從細胞源或體液中提取出來。應該理解，用于提取DNA的特定方法將依賴于來源的性質。對于從組織中分離總DNA的進一步討論，參見Rapley和Walker(同上)，第2章。
利用任意各種各樣的技術，可操作篩選方法。在試圖檢測與白內障風險增加相關的遺傳標記之前，可將哺乳動物樣品內的核酸進行特異性擴增。舉一個例子，醛糖還原酶啟動子區域的微衛星重復區域含有特異序列，該序列提供了白內障的遺傳誘因的指示。這些序列可由多核苷酸引物擴增。PCR引物的長度應至少為11個堿基對，優選15-18個堿基對，并且可長達25-30個堿基對。它們可設計成與DNA的靶區域，包括位于目的基因兩側的區域中的序列退火，或與基因序列本身退火；在任一情形下，延伸引物來擴增靶區域。本發明的示例是用于檢測哺乳動物醛糖還原酶基因啟動子區域的Z-2和Z-4微衛星等位基因存在與否的引物對。引物可設計成僅在Z-2或Z-4等位基因存在時其延伸才如所需地導致擴增的序列。實現此擴增的方法是設計在3’端具有至少一個與Z-2序列錯配但與Z-4序列匹配或反之亦然的核苷酸的引物。特別的目的引物是核酸引物SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。
眾多鑒定Z-2和Z-4等位基因的方法中任一種可用來評價擴增的序列，用于檢測哺乳動物醛糖還原酶基因的Z-2和Z-4等位基因的存在與否。舉一個例子，擴增的序列可以與一種或多種核酸探針接觸，所述探針包含與編碼哺乳動物醛糖還原酶基因的Z-2和Z-4等位基因的核苷酸區域雜交的序列。探針可包含DNA或RNA，包括寡核苷酸，基因探針和cDNA。探針可源自醛糖還原酶基因的啟動子區域。它們至少長10個堿基對，但可長達3350個堿基對，這是人醛糖還原酶基因的啟動子區域的長度。根據較短探針對堿基對錯配辨別較好以及較長探針對雙鏈體穩定性較好，對所選的探針長度進行優化(參見USPN6,156,601和USPN 6,197,506，在此引作參考)。所用探針的長度應使有至少一個堿基對突變的突變基因和野生型基因之間能夠辨別。優選的寡核苷酸探針的例子包括SEQ ID NO3及其互補序列。探針的制備方法包括寡核苷酸探針的合成(Sambrook等Molecular Cloning，ALaboratory Manual(第2版)，Cold Spring Harbor，1989，11.3-11.6)、cDNA探針的合成(Sambrook等，同上，10.38-10.50)和RNA探針，其由體外轉錄合成(Sambrook等，同上，10.27-10.38)和由質粒載體合成(Sambrook等，同上，10.29)。探針也可重新合成(Narang等(1980)Methods Enzymol.65610和Itakura等(1984)Ann.Rev.Biochem.53323)。放射性標記和使核酸探針與固相支持物上的靶序列雜交的方法在Sambrook等(同上)11.3-11.57和Keller等((1989)DNA Probes，Stockton，New York)中詳細討論。基因探針一般長于500個堿基，包含靶基因的大部，其可根據Rapley和Walker(Chapter 6 of Molecular BiomethodsHandbook(1998)Human Press，Totowa，New Jersey)的方法來進行合成。非放射性探針的制備可基于Rapley和Walker，第6章(同上)的方法，以及如在非放射性原位雜交手冊(Non-radioactive In Situ HybridisationManual)(1995)，Boerhingher Mannheim GmbH，Mannheim，Germany))所述。上述所有這些文獻在此引作參考。
其他用于鑒定Z-2和Z-4等位基因或其他與發生白內障風險相關的等位基因存在與否的有用技術包括單鏈構象多態性分析(SSCP)、梯度變性凝膠電泳(DGGE)、熒光原位雜交(FISH)、二維凝膠電泳、雜雙鏈體分析、雙脫氧指紋識別、酶錯配切割(EMC)等。已知等位基因如Z-2和Z-4的檢測是在足夠嚴格的雜交條件下，利用核酸探針和本發明實施方案中所述的方法進行。
對于SSCP，設計了引物，使跨越目的基因的非復制區段、長度約250-300個堿基對的DNA產物得到擴增。對于各個擴增產物，采用一個凝膠系統和兩個跑膠條件。將各個擴增產物加樣到含有10％甘油的10％聚丙烯酰胺凝膠上。分開的各個擴增引物的等分試樣室溫下以8W電泳16小時，并在4℃下以30W電泳5.4小時。這些條件的早先顯示是用來鑒定CFTR基因中98％的已知突變(Ravnik-Glavac等(1994)HumMol Gefaet 3801，在此引作參考)。
可將與特異性遺傳標記雜交的核酸探針安置在固相支持物上的不同核酸鏈的多個離散區域中。這種類型的陣列，也就是已知的微陣列，一般含有長度至少為10個核苷酸堿基的核苷酸序列。這種陣列含有與醛糖還原酶基因的Z-2和Z-4等位基因雜交或與編碼當前未知的基因座的DNA雜交的核苷酸探針，所述基因座可能與發生白內障的風險相關。安置在固相支持物上的探針一般會含有寡核苷酸，并且可直接在固相支持物上生成或在固相支持物之外合成然后附著于支持物上。或者，附著于固相支持物上的探針可含有直接從醛糖還原酶基因分離或從DNA文庫分離的核苷酸的同源序列。固相支持物上的探針的陣列可用作基因測序微陣列。
采用各種各樣的技術來鑒定新的或已知的多態性的存在與否。首先，利用本領域標準方法可對醛糖還原酶的啟動子區域直接測序。利用PCR-RFLP程序檢測多態性，其中寡核苷酸對用來引發擴增反應，并把被限制性內切酶切割或未切割的擴增產物的大小與對照產物進行比較。
測序微陣列采用已知的重疊序列的標記DNA探針。通過在一端缺失一個核苷酸而在另一端添加一個核苷酸(因此是重疊的)，使DNA的短延伸作為區分于相鄰探針的探針結合到固相支持物。然后，通過在高度嚴格條件下與重疊部分雜交，對核酸樣品的DNA片段的序列進行測定，這使得僅正確互補的序列結合。因此，陣列上雜交的位置可以鑒定含有DNA樣品的互補序列。以此方式，特異性多態性可以高通量的方式加以檢測。此方法將發現在篩選大量的核酸樣品中有特別的用途。若干核酸樣品也可在微陣列上同時進行測序(參見USPN6,197,506，在此引作參考)。
微陣列一般含有多個不同的核酸序列，通常為至少10個核苷酸、更通常至少20個核苷酸、常常至少50個核苷酸，但可多達100個核苷酸或更多。本發明所用的微陣列是本領域公知的(參見USPN5,202,231、5,741,644、5,837,832和6,183,970，在此引作參考)。另外，其他固相基底可用于共價連接突變的目的核酸序列的代表性組合，包括珠子和載玻片。通過導入與寡核苷酸反應的官能團，固相支持物可由玻璃或氧化硅或其他可適于共價連接寡核苷酸序列的材料制成。
各種各樣的方法可用來使核酸結合到固相基底上。通過利用化學活性固相底物，可給核酸提供化學活性基團，該基團會與化學活性固相基底表面反應。例如，通過利用硅酸酯、鹵化物或其他表面上的活性硅種類，核酸可被修飾以與硅部分反應。讓核酸共價鍵合到表面可形成硅酯。除了硅官能團，可使用有機加成聚合物，例如苯乙烯、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯、乙烯基醚和酯等，其中有可與核酸上存在的官能團反應的官能團。例如，根據常規途徑，可提供氨基、活化鹵化物、羧基、巰基、環氧化物等。鍵可以是酰胺、脒、胺、酯、硫醚、二硫醚等。形成這些共價鍵的方法可在USPN 5,565,324和USPN6,156,501找到，在此引作參考。
在實踐中，DNA微陣列可用來檢測完全雜交和未完全雜交的核酸。這些微陣列包含大量的固定化核酸探針，所述探針結合核酸樣品的標記DNA，該樣品本身一般含有大量的DNA片段。所以，這些組合物是序列的復合混合物。樣品中高濃度的共有序列增加了其雜交程度以及與任何其他序列結合的這種序列的組分。微陣列表面上局部高濃度的探針也可誘捕錯配結合的伙伴DNA序列。這些作用通過平均或低于平均豐度的序列，可減少完全匹配序列結合的速率和程度。因此，DNA微陣列是不完美的器件，但當大量樣品需要快速處理的情形出現時則很有用。通過實驗對雜交和漂洗步驟確定最佳的嚴格條件，在找到條件來限制與接近所需水平的序列相匹配的序列結合時，就可取得合理的成功水平。
對于雜交探針的檢測，包括那些與固相支持物結合的探針，光可檢測的裝置是優選的，盡管可采用其他檢測方法，如放射性、原子光譜等。對于光可檢測裝置，可利用熒光、磷光、吸附、化學發光等。最方便的是熒光，它可采取許多形式。可使用單個熒光劑或熒光對，尤其是在希望具有多個大斯托克司頻移的發射波長的地方。可用的例證性熒光劑包括熒光素、羅丹明、德克薩斯紅、花菁染料、藻紅蛋白、噻唑橙和噻唑藍等。當使用染料對時，可使一種染料在一個分子上，而其他染料在另一與第一分子結合的分子上。例如，可使一種染料在第一或結合的成分上而使其他染料在第二或配位的成分上。重要因素是當兩個成分結合時兩種染料對有效能量轉移是足夠近的(參見USPN5,992,617，在此引作參考)。
單核苷酸多態性(SNP)，優選但不必出現在醛糖還原酶基因的啟動子區域中，與白內障風險增加相關，也可用來評估白內障發生的風險。通過使已知基因中的多態性相關，這種SNP可得到鑒定，所述基因在有白內障或非胰島素依賴型糖尿病陽性病史的家族成員中與白內障的發生共分離。如那些出現在非翻譯和翻譯區域如微衛星啟動子區域的SNP，通過基因組—寬掃描以及家譜相關連鎖分析可加以鑒定。
因為有連帶目的突變的鑒定，通過對基因組或互補DNA的所需區域進行核酸測序，可實現與白內障風險相關的等位基因中連帶SNP的鑒定。微陣列技術能最有效地對SNP進行篩選，其中核酸序列附著于固相支持物如微陣列上，與雜交條件接觸，所述條件可區分只有一個核苷酸不同的兩個核酸序列(參見例如，Wang等(1998)Science 2801077；和Hacia等(1998)Nature Genet 18155)。或者，質譜分光光度計可用來鑒定具有SNP的PCR產物中的小的質量差異(參見Kirpekar等(1998)核酸研究(Nucleic Acids Res)262554；在此引作參考)。
其他分析SNP的方法是“動態等位基因特異雜交”(DASH)。該技術在多孔的格式中使用標記的寡核苷酸，當寡核苷酸以雙鏈形式存在時，其會發熒光，但當其是單鏈形式時則不發熒光。加入待測單鏈DNA，使得鏈雜交。鏈變性的溫度將允許鑒定SNP處的堿基。DASH技術具有技術簡單、不需昂貴設備的優點。其他可用于篩選與哺乳動物發生白內障的遺傳誘因相關的SNP的技術包括核酸外切酶抗性、微測序、ddNTP的液相或固相延伸以及寡核苷酸連接測定(如USPN 5,952,174中所述)。所有上述文獻在此引作參考。
在通過上述任何技術檢測連帶突變或SNP的存在之后，包含突變的特異核酸變化由直接DNA序列分析或限制性分析或兩者組合來進行鑒定。以此方式，醛糖還原酶基因中先前未鑒定的SNP可加以鑒定。
本發明可用來評價發生白內障總的風險和/或用于給診斷對象設計個性化的治療方案。預防篩選方法可用于任何被視為白內障發生風險較高的個體，即那些可能具有白內障家族史個體，那些患有糖尿病的個體，或那些具有糖尿病相關表型特征(即肥胖)的個體。Z-2或Z-4等位基因的檢測與篩選對象的表型參數相關，并可理解為陽性或陰性家族病史或非胰島素依賴型糖尿病病史所考慮的因素。當患者未顯示發生疾病的癥狀，或顯示疾病的初期癥狀時，獲得基因型評估可使得醫師或獸醫能夠開始治療或提出防止明顯癥狀的發作或進展的變化。對于人來說，治療可包括生活方式的變化，如限制暴曬于陽光、氧化性應激、吸煙和飲酒，小心關注糖尿病發作的治療，或通過飲食和鍛煉來預防。治療可在疾病發展的早期開始或在癥狀明顯之前開始。
用于治療有發生白內障風險的哺乳動物的方法的例子包括檢測遺傳標記的存在，其中包括醛糖還原酶基因相關的Z-2微衛星標記的檢測，其后哺乳動物可用醛糖還原酶基因的抑制劑治療。這種治療是依據作為多元醇途徑中第一限速酶的醛糖還原酶的活性。醛糖還原酶催化己糖NADPH-依賴性還原成多元醇，將D-葡萄糖轉化為山梨醇以及將半乳糖轉化為半乳糖醇。酶對葡萄糖的親和性是低的，因此在正常條件下不會有太多的山梨醇產生。然而，在高血糖癥存在下，山梨醇累積，這是因為其不易擴散到眼球以外(Ko等，同上)，從而導致白內障。因此，醛糖還原酶可用作藥理介入的靶子，并且該酶的抑制劑已顯示能防止哺乳動物形成白內障(Robison等(1995)Invest OpAtalmolVis Sci 122368；Devamanoharan等(1995)J Ocul Pharmacol Sher 452；以及Sato等(1999)Exp Eye Res 1999 68601)。這些文獻在此引作參考。
核酸與互補鏈的雜交依賴于眾多化學和物理因素，包括(i)溫度；(ii)鹽濃度；(iii)雜交序列的相似性或“同源性”；以及(iv)核酸濃度。雜交和漂洗條件的嚴格性(即，主要依賴的物理條件和鹽濃度及溫度)可用來確定結合標記的核酸物種的檢測程度。該檢測可在高度嚴格條件下進行，由此限制對序列的檢測，所述序列幾乎與標記序列相同，或通過降低嚴格性，可用來檢測具有較低同源性的序列。雜交后漂洗條件的高嚴格性可用來使異源雙鏈體去穩定，所述異源雙鏈體可以雜交但含有錯配堿基(即，低于一定所需的同源性的程度)。在要求雜交序列與探針是完全同源性的情況下，可采用很高程度的雜交和漂洗嚴格性。高度嚴格性條件在本領域中是眾所周知的(Ausubel等(1989)CurrentProtocols in Molecular Biology，第I卷，Green Publishing Associates，Inc.，and John Wiley & Sons，Inc.，New York，N.Y.，第2.10.3頁，在此引作參考)，并且包括高度嚴格性雜交和漂洗程序的例子在1％十二烷基硫酸鈉(SDS)和1mM EDTA的5×檸檬酸鈉鹽緩沖液(SSC)中，和濾膜結合DNA于65℃下雜交，接著用0.1×SSC/0.1％SDS在68℃下漂洗。
較低嚴格性漂洗可用來鑒定與探針具有較低同源性的序列。該序列包括相關等位基因。為了檢測不完全雜交而采用較低嚴格性處理是本領域眾所周知的(參見，Sambrook等，同上；和Ausubel等，同上，第2.10.3頁，兩者皆以其全文在此引作參考)。適中嚴格性漂洗條件可通過在0.1％SDS的0.2×SSC中于42℃下漂洗來實現，而低嚴格性漂洗條件包括由0.1％SDS的0.2×SSC于室溫下漂洗(Ausubel等，同上，第13.12.1-13.12.5頁，在此引作參考)。
對于任何給定的基于雜交的檢測機理，需要提供理想結果的漂洗條件(即，根據所需的雜交閾限獲得正確的檢測水平)對各組目的序列必須通過實驗來確定。
這些方法可用來篩選下列對象的基因組DNA(i)一般的哺乳動物；(ii)患有非胰島素依賴型糖尿病的哺乳動物；(iii)人；(iv)患有II型糖尿病的人，(v)已被診斷患有年幼發作成熟性糖尿病的華人(MODY)，以確定其疾病的病原學，(vi)具有陽性II型糖尿病家族史的華人個體，以確定發生糖尿病癥狀的可能性，以及(vii)患有II型糖尿病的華人人群的成員。與白內障相關的多態性在具有陽性II型糖尿病史的華人家族中得到最有效的鑒定(即，具有發生MODY的成員的家族)。然而，鑒定的連帶多態性對鑒定任何人特別是華人人群的成員中風險增加是有用的。
下列實施例以說明本發明方式而非限制方式提供。
實施例對象和診斷香港威爾士王子醫院糖尿病中心連續征召了567位患者，并按世界衛生組織的標準對這些患者加以診斷(World Health OrganizationTechnical Report Series(1985)727)。為了增加II型糖尿病的均一性，排除那些在35歲前已確診糖尿病以及那些在樣品采集時已確診糖尿病3年或更少且已進行胰島素治療的患者。瞳孔放大后，經直接檢眼鏡檢查以及結合同樣眼球中史奈侖氏視力表(Snellen′s chart)≤20/70上的最佳視力靈敏度發現晶狀體混濁，則表明有白內障。Fundoscopy檢查由眼科專家或經培訓的糖尿病專家進行。
臨床、生化測定以及人體測量所有患者在臨床檢查前禁食至少8小時。保持坐姿至少5分鐘后，測量血壓。當患者身穿薄衣、光腳站立時進行身體測量。腰圍是臍與髂嵴之間的最小周長，而臀圍是環繞臀部的最大周長。利用葡萄糖氧化酶方法以及全自動離子交換層析方法分別測定血漿葡萄糖和HbA1c(正常范圍5.1-6.4％)。總膽固醇和甘油三酯的血漿水平以酶法測定。HDL-膽固醇的測定在硫酸葡聚糖-MgCl2分級沉淀后進行，而LDL-膽固醇則利用Friedewald等式計算(Friedewald等(1972)Clin.Chem.18499)。
基因表型利用引物5′-GAATCTTAACATGCTCTGAACC-3′(SEQ ID NO1)和5′-GCCCAGCCCTATACCTAGT-3′(SEQ ID NO2)在Ko及其同事(Ko等，同上)所述的PCR條件下對醛糖還原酶基因的5’端微衛星進行基因型測定。把微衛星的等位基因在聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離并對照DNA分子量標準確定大小。
統計分析分別采用斯氏t檢驗和曼—惠特尼等級和(Mann-Whitney RankSum)檢驗進行評價，將連續變量表達為適當的平均值±SD或中值(范圍)。進行卡方檢驗(Chisquare test)以分析比例。以白內障作為相依因素(有＝1，無＝0)，年齡、性別(男＝1，女＝0)、糖尿病病程長短、空腹血糖、HbA1c、心臟收縮和舒張壓、體重指數(BMI)、腰臀圍比(WHR)、脂質和微衛星等位基因Z以及Z4作為獨立因素，進行多元邏輯式回歸分析。p＜0.05視為統計學上顯著。
在567位患有II型糖尿病的華人患者中，157位(約占28％)有視覺損傷的白內障臨床癥狀。與沒有白內障的患者比較，那些白內障患者診斷時年紀更大，并且有較長的糖尿病持續時間(全部在p＜0.01)。白內障患者還有較高的心臟收縮壓、較高水平的空腹血糖(兩者均在p＜0.01)以及HbA1c(p＜0.05)(所有上述指標都調節為顯著性)(參見下表1)。
表1567位患有白內障或沒有白內障的II型糖尿病患者的香港華人的臨床和生化特征
如適當，把數據表示成平均值±SD或中值(范圍)。
代謝參數的比較隨年齡進行調整。除了年齡外，BMI和WHR的比較隨性別進行調整，而HbA1c和空腹血糖的比較則隨糖尿病病程長短進行調整。
*，p＜0.05；**，p＜0.01。
在患者中共檢測到14個微衛星的等位基因。等位基因Z及攜帶Z的基因型(Z，Z加上Z，非-Z)在白內障患者中過多出現(兩者均在p＜0.01)。相反，等位基因Z-4及其基因型(Z-4，Z-4加上Z-4，非Z-4)更頻繁地出現在沒有白內障的患者中(兩者均在p＜0.05)(表2)。
表2567位患有或未患有白內障的II型糖尿病華人中的微衛星的主要等位基因和基因型分布
*p＜0.05；**p＜0.01利用多元邏輯式回歸分析，發現白內障的發生與年齡正相關，但與微衛星等位基因Z-4的存在負相關(表3)。在有等位基因Z和沒有等位基因Z的患者之間的平均年齡中沒有顯著差異(58±12對56±12歲)或Z-4(59±12對56±12歲)。
表3利用多元邏輯式回歸分析對華人II型糖尿病患者發生白內障的獨立風險因素的鑒定
R2＝0.23，p＜0.01II型糖尿病性白內障在高加索人群中并不罕見。在UKPDS研究中，在心臟收縮壓數值范圍之上，不同亞群中新診斷II型糖尿病患者的白內障發生率為4.7-5.2/1000/年(Adler等(2000)Brit Med.J.321412)。Janghorbani及其同事隨訪II型糖尿病門診患者平均5年，并觀察到有或沒有胰島素治療的患者的白內障發生率分別為1.7和17.8/1000個體/年(Janghorbani等，同上)。在香港華人患者的基于臨床的一批人中，有28％患有白內障(表1)，這提示眼病在華人II型糖尿病人群中也是常見的。白內障患者似乎年齡較大，患有更嚴重的糖血控制和較高的心臟收縮壓(表1)。然而，年齡是唯一識別的獨立風險因素(表3)，這與其他人群中所觀察的結果一致，在很大程度上，白內障是衰老相關的疾病(Janghorbani等，同上；和McCarty等(1999)Am.J.OpAthalmol.128446)。一直有證據表明氧化性應激可能有助于發生白內障(Lee等(1994)同上，和Lee等(1999)同上)，以及衰老增加氧化性應激(Varmaetal(1995)Critical Rev.Food Nutri.Sci.35111)。因此，II型糖尿病性白內障的發生率與年齡之間的關系可反映出氧化性應激的效果(Shah等(1998)J Clin.Endocrinol.Metabol.832886)。
除了年齡以外，等位基因Z和Z-4呈現的高和低分別(表2和3)暗含華人II型糖尿病人群中白內障的發生可能受到醛糖還原酶基因的基因型的影響。這種遺傳發現與多元醇途徑參與糖尿病性白內障的發病機理的生理證據一致(Lee等(1995)同上，Lee等(1999)同上，以及Cogan等(1995)同上)，并且提示醛糖還原酶發揮了重要作用。醛糖還原酶催化葡萄糖轉化成山梨醇。山梨醇不易跨越細胞膜，并在胞內累積，盡管它能被山梨醇脫氫酶以NAD+作為輔助因子生理性氧化成果糖。高血糖癥促進葡萄糖通過多元醇途徑的流入。這可促成多元醇的累積，并通過修飾NAPDH和NAD+的有用性導致慢性氧化性和滲透性應激，最終使得組織損傷(Lee等(1995)同上，Lee等(1999)同上)。以此為背景，假設等位基因Z可與醛糖還原酶的過度活躍相關，而這夸大了白內障的發生。然而，等位基因Z-4可能與酶的活性不足相關，這是保護性的。有初步證據表明微衛星的多態性可能與醛糖還原酶基因的不同表達水平相關(Shah等，同上，和Ikegishi等(1999)Life Sci.652061)。但是，需要更多的研究來闡明特異等位基因和醛糖還原酶的基因表達及生物活性之間的關系。而且，我們認為所觀察到的微衛星與糖尿病性白內障之間的關系可反映出當前未知的基因座的效應，所述基因座處于同患者發生白內障中二核苷酸重復多態性的連鎖失衡。
總結上述數據，在患有II型糖尿病的華人患者中檢測到共14個微衛星的等位基因。等位基因Z和攜帶Z的基因型(Z，Z加上Z，非-Z)在白內障患者中是高呈現的。相反，等位基因Z-4及其基因型(Z-4，Z-4加上Z-4，非Z-4)在沒有白內障的患者中更頻繁。
白內障的發生率發現與年齡是正相關的，但與微衛星等位基因Z-4的存在是負相關的。在有等位基因Z或Z-4的患者與沒有等位基因Z或Z-4的患者之間平均年齡沒有顯著差異。
總之，結果顯示白內障發生在II型糖尿病的華人患者中是常見的。除了年齡以外，醛糖還原酶基因似乎是這種眼病的重要決定因素。
序列表<110>香港中文大學(THE CHINESE UNIVERSITY OF HONG KONG)<120>通過醛糖還原酶基因型確定白內障的風險率(DETERMINATION OF RISK FACTORS FOR CATARACT BYALDOSE REDUCTASE GENOTYPE)<130>SPI070273-47<150>US 60/280,529<151>2001-03-30<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>19<212>DNA<400>1gcccagccct atacctagt19<210>2<211>22<212>DNA<400>2cttagaattg tacgagactt gg22<210>3<211>138<212>DNA<400>3gcccagccct atacctagtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg60tgtgttttcc ttttaaatta tttccttagg aaaaattccc atgatgggag attactggtt120cagagcatgt taagattc138
權利要求
1.包含SEQ ID NO2的引物和/或包含與醛糖還原酶基因的Z-4等位基因雜交的探針在制備用于確定哺乳動物發生白內障的風險的試劑盒中的應用，其中所述Z-4等位基因缺乏(Z-4-/Z-4-基因型)表示所述哺乳動物發生白內障的風險增加，而所述Z-4等位基因存在(Z-4+/Z-4+基因型或Z-4+/Z-4-基因型)則表示所述哺乳動物發生白內障的風險降低。
2.根據權利要求1所述的應用，其中所述哺乳動物患有非胰島素依賴型糖尿病。
3.根據權利要求1所述的應用，其中所述哺乳動物是人。
4.根據權利要求3所述的應用，其中所述人是華人血統。
5.根據權利要求1所述的應用，其中所述探針結合到固相支持物上。
6.根據權利要求1所述的應用，其中所述探針是放射性標記的。
7.根據權利要求1所述的應用，其中所述探針是非放射性標記的，并且包含地高辛、酶、熒光、切口平移、光生物素、PCR或末端標記。
8.醛糖還原酶的抑制劑在制備用于治療需要給藥的哺乳動物的藥物中的應用，其中作為醛糖還原酶基因的Z-4等位基因缺乏的結果，所述哺乳動物發生白內障的風險增加。
全文摘要
本發明涉及用于確定哺乳動物中發生白內障風險的方法，更具體而言，涉及用于確定包括人在內的患有非胰島素依賴型糖尿病的哺乳動物中發生白內障風險的方法。本發明方法的操作是確定基因組DNA中遺傳標記的存在或缺乏。Z－2等位基因是醛糖還原酶基因的微衛星標記，其存在表示發生白內障的風險增加。Z－4等位基因是醛糖還原酶基因的微衛星標記，其存在表示發生白內障的風險降低。所述方法包含與編碼哺乳動物醛糖還原酶基因的微衛星區的核酸雜交的核酸探針。探針也可固定于固相支持物上以形成微陣列。此外，本發明涉及的方法用于治療有發生白內障遺傳傾向的哺乳動物；在檢測醛糖還原酶基因的Z－2微衛星標記的篩選方法之后，哺乳動物用醛糖還原酶的抑制劑治療。
文檔編號C12Q1/26GK101029338SQ200710008350
公開日2007年9月5日 申請日期2002年3月29日 優先權日2001年3月30日
發明者郭志良, 伍楚賢, 李少欽, 郭克倫, 陳重娥 申請人:香港中文大學