專利名稱：氨基酸診斷/測定試劑盒及氨基酸濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種氨基酸診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定氨 基酸濃度的方法，屬于醫學/食品/工業/農業/環境檢驗測定技術領域。
背景技術：
氨基酸含量的測定在醫學/食品/工業/農業/環境中都是比較重要的測 定項目。現有的測定方法有色譜法、電化學法、儀器分析法(氨基酸分析 儀)、分光光度計等方法，這些方法或是操作方法較為繁雜、特異性差、 或儀器設備成本較高等缺點。
氨基酸不是單純的一種物質，用氨基酸分析儀可直接測定出17種氨基 酸(儀器價格昂貴，不能普遍使用)，對于醫學/食品/工業/農業/環境中來 說，多數情況下，都是很多種氨基酸同時存在，所以需要測定總的氨基酸 含量，它們不能以氨基酸百分率來表示，只能以氨基酸中所含的氮(氨基 酸氮)的百分率表示。 '
大量食肉或饑餓時尿中氨基酸氮增加，孕婦及新生兒尿液氨基酸氮也 增加。氨基酸代謝異常，造成某些氨基酸在體內積累過多，使尿中氨基酸 氮增高；急性肝萎縮、肝功能衰竭、R e y e綜合征、或某些因素造成蛋 白質分解加速的疾病，遺傳性疾病所導致的代謝異常均可使尿中氨基酸氮 增加。
酶法測定血、尿、體液、食品、土壤、工業產品中氨基酸氮含量具有特異性高、方法簡便、成本低的特點。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯法(Couple Reaction)技術，監測還
原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測 定氨基酸濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的氨基酸診 斷/測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動 生化分析儀上進行氨基酸濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可 以得到切實的推廣應用。
本發明氨基酸濃度測定方法原理如下
氨基酸+水+氧氨基酸氧化酶氧代酸+氨離子+
過氧化氫
氨離子+ 2-酮戊二酸酯+還原型輔酶谷氨酸脫氫酶
L-谷氨酸+水+輔酶
這種方法應用氨基酸氧化酶(amino acid oxidase; EC 1.4.3.2; EC 1.4.3.3)偶聯谷氨酸脫氫酶(Glutamate dehydrogenase ; EC 1.4.1.2; EC 1.4丄3)酶促反應連續監測法/速率比色法。氨基酸氧化酶酶解氨基酸反 應產生氨離子，再通過偶聯谷氨酸脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在 340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nrn處沒有吸收峰)，從而得以 測定還原型輔酶在340nrn處吸光度下降的程度/速度，通過測量340nm處 吸光度下降的程度/速度，可以測算氨基酸的濃度大小。
實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發明氨基酸診斷/測定試
劑盒較為理想
緩沖液 100mmol/L 穩定劑 500 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
酮戊二酸酯 20 mmol/L
氨基酸氧化酶 10000 U/L
谷氨酸脫氫酶 12000 U/L
本發明的氨基酸診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、酮戊二酸酯、氨基酸氧化酶、谷氨
試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、酮戊二酸酯。 試劑2
緩沖液、穩定劑、氨基酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶。 還原型輔酶、酮戊二酸酯、氨基酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶在試劑1或
試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后
使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑試劑1
緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、酮戊二酸酯。
試劑2
緩沖液、穩定劑、谷氨酸脫氫酶。 試劑3
緩沖液、穩定劑、氨基酸氧化酶。
還原型輔酶、酮戊二酸酯、氨基酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶在試劑1、 試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加 水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定氨基酸濃度的方法，其還原 型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一種。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。 實施例一
本實施例的氨基酸診斷/測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩定劑 500 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
酮戊二酸酯 20 mmol/L
氨基酸氧化酶 10000 U/L
谷氨酸脫氫酶 12000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復溶后使用。在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始吸 光度1.8士0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨基酸樣品 與試劑的體積比例為1/25,反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大 約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分 析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出氨基酸 的濃度大小。 實施例二本實施例的氨基酸診斷/測定試劑為雙試劑，包括試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L穩定劑 還原型輔酶酮戊二酸酯50 mmol/L 0.25 mmol/L 20 mmol/L試劑2三(羧甲基)氮基甲烷一鹽酸緩沖液 穩定劑100 mmol/L500 mmol/L10000 U/L12000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始吸光度1.8土0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨基酸樣品 與試劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為負反應(下降反應)， 延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分 析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出氨基酸 的濃度大小。 實施例三本實施例的氨基酸診斷/測定試劑為三試劑，包括試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液穩定劑還原型輔酶酮戊二酸酯10Ommol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 20 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩定劑100 mmol/L 500 mmol/L 12000 U/L試劑3三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩定劑氨基酸氧化酶100mmol/L500 mmol/L10000U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用,測定氨基酸濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時 間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm， 被測氨基酸樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應 方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘 左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分 析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出氨基酸 的濃度大小。申請人經過實驗驗證，采用以上發明內容中記載的其他各種還原型色 原體組合均能達到本發明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類 同，不另一一例舉。總之，實驗證明，采用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分析 儀器得出所需的測定結果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應用。
權利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯法技術的氨基酸濃度測定方法，其方法原理如下氨基酸+水+氧氨基酸氧化酶氧代酸+氨離子+ 過氧化氫氨離子+2-酮戊二酸酯+還原型輔酶谷氨酸脫氫酶L-谷氨酸+水+輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，測算出氨基酸的濃度大小測定結果。
2. -種氨基酸診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液 穩定劑 還原型輔酶 酮戊二酸酯.20-500 mmol/L.1-4000 mmol/L.0.1-0.35 mmol/L.50 mmol/L.1000——80000 U/L.1000-.-80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液體試劑，直接使用。
3.根據權利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、酮戊二酸酯、氨基酸氧化酶、谷氨 酸脫氫酶組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、酮戊二酸酯、氨基酸氧化酶、谷氨 酸脫氫酶組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、 酮戊二酸酯組成；試劑2，由緩沖液、穩定劑、氨基酸氧化酶、谷氨 酸脫氫酶組成。還原型輔酶、酮戊二酸酯、氨基酸氧化酶、谷氨酸脫 氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、酮戊二酸酯、氨基酸氧化酶、谷氨 酸脫氫酶組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、 酮戊二酸酯組成；試劑2，由緩沖液、穩定劑、谷氨酸脫氫酶組成； 試劑3，由緩沖液、穩定劑、氨基酸氧化酶組成。還原型輔酶、酮戊 二酸酯、氨基酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶在試劑1、試劑2或試劑3中 的位置可以不限。
6. 根據權利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括 穩定劑1—4000 mmol/L或0.1。/。-100。/。體積比。所述穩定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發明涉及一種利用酶比色法及酶聯法技術的氨基酸診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定氨基酸濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫學/食品/工業/農業/環境檢驗測定技術領域。本發明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、酮戊二酸酯、氨基酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的程度/速度，從而測算出氨基酸的濃度大小。
文檔編號C12Q1/00GK101324586SQ200710023360
公開日2008年12月17日 申請日期2007年6月13日 優先權日2007年6月13日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司