專利名稱：谷氨酸診斷/測定試劑盒及谷氨酸濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種谷氨酸診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定谷氨 酸濃度的方法，屬于醫學/食品檢驗測定技術領域。
技術背景中華人民共和國國家標準GB5009-2003味精衛生標準分析方法有1. 旋光計法2.甲醛滴定法3.凱氏定氮法。味精系指以糧食及制品為原料經發 酵提純的谷氨酸鈉。酶法分析是國際上公認的谷氨酸鹽的分析方法，已被多個國際權威組織 或機構采納如IFU (國際果汁生產者協會)，AIJN (歐盟果蔬汁及飲料生 產者聯盟)，及MEBAK,OICC，VDLUFA等組織廣為推崇，并確定為標準 檢測方法。已被寫入澳大利亞，荷蘭，德國，瑞士等多個國家的食品法。 國內也有數家果汁、酒類加工企業使用酶法試劑盒作為檢測標準。生物體內存在分解骨質的破骨細胞和形成骨骼的成骨細胞，正常情況下 兩種細胞的作用保持著良好的平衡。如果平衡被打破、破骨細胞過于活躍， 就會導致骨質疏松。破骨細胞中含有谷氨酸，而一種名為"谷氨酸轉運體" 的蛋白可以將谷氨酸排出破骨細胞，被"釋放"的谷氨酸會和細胞表面的受 體結合，激活細胞內的酶，抑制破骨細胞分解骨質的作用。 發明內容本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)聯法(Couple Reaction)技術，監測還原 型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定谷 氨酸濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的谷氨酸診斷/測 定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分 析儀上進行谷氨酸濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到 切實的推廣應用。本發明谷氨酸濃度測定方法原理如下L-谷氨酸+氧+水谷氨酸氧化酶氨離子+ 2-酮戊二酸酯' +過氧化氫氨離子+丙酮酸+還原型輔酶丙氨酸脫氫酶L-丙氨酸+水+輔酶這種方法應用谷氨酸氧化酶(glutamate oxidase; EC 1.4.3.7; EC 1.4.3.11) 偶聯丙氨酸脫氫酶(alanine dehydrogenase; EC1.4丄1)酶促反應連續監測 法/終點比色法。谷氨酸氧化酶酶解谷氨酸反應產生氨離子，再通過(偶) 聯合氨酸脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化 成為輔酶(在340nrn處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm 處吸光度下降的程度/速度，通過測量340nm處吸光度下降的程度/速度， 可以測算谷氨酸的濃度大小。實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮， 無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發明谷氨酸診斷/測定試劑 盒較為理想緩沖液 100mmol/L穩定劑 500 mmol/L還原型輔酶 0.25 mmol/L丙酮酸 20 mmol/L谷氨酸氧化酶 10000 U/L丙氨酸脫氫酶 12000 U/L本發明的谷氨酸診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括 . 緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、丙酮酸、谷氨酸氧化酶、丙氨酸脫 氫酶。試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體 試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、丙酮酸。 試劑2緩沖液、穩定劑、谷氨酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶。 還原型輔酶、丙酮酸、谷氨酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶在試劑1或試劑2 中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、丙酮酸。 試劑2緩沖液、穩定劑、丙氨酸脫氫酶。試劑3緩沖液、穩定劑、谷氨酸氧化酶。還原型輔酶、丙酮酸、谷氨酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶在試劑l、試劑2 或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解 后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定谷氨酸濃度的方法，其還原型 輔酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實施方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。 實施例一本實施例的谷氨酸診斷/測定試劑為單試劑，包括三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩定劑 500 mmol/L還原型輔酶 0.25 mmol/L丙酮酸 20 mmol/L谷氨酸氧化酶 10000 U/L丙氨酸脫氫酶 12000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用 前，加入純凈水，復溶后使用。在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始吸光 度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測谷氨酸樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約0 分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析 儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出谷氨酸的濃 度大小。 實施例二本實施例的谷氨酸診斷/測定試劑為雙試劑，包括 試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩定劑 50 mmol/L還原型輔酶丙酮酸0.25 mmol/L20 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩定劑谷氨酸氧化酶 丙氨酸脫氫酶100mmol/L 500 mmol/L10000U/L12000U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37-C，反應時間10分鐘，起始吸光 度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm,被測谷氨酸樣品與 試劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為負反應(下降反應)，延 遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出谷氨酸的濃度大小。實施例三本實施例的谷氨酸診斷/測定試劑為三試劑，包括 試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L穩定劑還原型輔酶丙酮酸50 mmol/L 0.25 mmol/L 20 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩定劑丙氨酸脫氫酶 試劑3三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩定劑谷氨酸氧化酶試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體:100mmol/L500 mmol/L12000U/L100 mmol/L 500麵ol/L 10000U/L:試劑，可以直接使用,測定谷氨酸濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37°C，反應時 間IO分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測谷氨酸樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析 儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出谷氨酸的濃 度大小。申請人經過實驗驗證，采用以上發明內容中記載的其他各種還原型色 原體組合均能達到本發明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同， 不另一一例舉。總之，實驗證明，采用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀 器得出所需的測定結果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應用。
權利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯法技術的谷氨酸濃度測定方法，其方法原理如下L-谷氨酸+氧+水谷氨酸氧化酶氨離子+2-酮戊二酸酯+過氧化氫氨離子+丙酮酸+還原型輔酶丙氨酸脫氫酶L-丙氨酸+ 水+輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，測算出谷氨酸的濃度大小測定結果。
2. —種谷氨酸診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液 20-500 mmol/L穩定劑 1——4000 mmol/L還原型輔酶 0.1——0.35 mmol/L丙酮酸 1——50mmol/L谷氨酸氧化酶 1000——80000 U/L丙氨酸脫氫酶 1000——80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可 以配制成液體試劑，直接使用。
3.根據權利要求2所述谷氨酸診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、丙酮酸、谷氨酸氧化酶、丙氨酸脫氫 酶組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述谷氨酸診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、丙酮酸、谷氨酸氧化酶、丙氨酸脫氫 酶組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、丙酮酸組 成；試劑2，由緩沖液、穩定劑、谷氨酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶組成。 還原型輔酶、丙酮酸、谷氨酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶在試劑1或試劑2 中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述谷氨酸診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、丙酮酸、谷氨酸氧化酶、丙氨酸脫氫 酶組成多劑試劑；試劑l,由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、丙酮酸組 成；試劑2，由緩沖液、穩定劑、丙氨酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖 液、穩定劑、谷氨酸氧化酶組成。還原型輔酶、丙酮酸、谷氨酸氧化酶、 丙氨酸脫氫酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據權利要求2所述谷氨酸診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括穩 定劑1~^000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙 二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發明涉及一種利用酶比色法及酶聯法技術的谷氨酸診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定谷氨酸濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫學/食品檢驗測定技術領域。本發明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、丙酮酸、谷氨酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的程度/速度，從而測算出谷氨酸的濃度大小。
文檔編號C12Q1/00GK101324568SQ20071002339
公開日2008年12月17日 申請日期2007年6月13日 優先權日2007年6月13日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司