專利名稱：蔗糖測定試劑盒及蔗糖濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種蔗糖測定試劑盒，同時本發明還涉及測定蔗糖濃度的 方法，屬于食品檢驗測定技術領域。
技術背景當前，蜂蜜摻假的現象嚴重，據調查，在基層收購的蜂蜜中，出現的摻假的樣品中，蔗糖的含量多在10-28%之間，有的甚至高達50%以上。另外， 在中、低檔茶葉加工時摻糖，以增加重量謀取不法利益的現象也比較普遍。 無糖食品査出含有蔗糖的問題，也時有所聞，對糖尿病患者造成危害。申請專利號200510099310.4的一種甘蔗汁中蔗糖含量的檢測方法，公 開一種蔗糖的測定方法，其方法包括蔗糖的水解，還原糖與鐵氰化鉀的反 應，亞鐵氰化鉀的電位滴定等步驟。由于用常規的滴定法測定蔗糖含量過程繁瑣，準確性差，也有利用高效 液相色譜儀對樣品進行檢測。中華人民共和國國家標準GB 5009.8-85公布了食品中蔗糖的測定方 法，其原理為樣品經除去蛋白質后，其中蔗糖經鹽酸水解轉化為還原糖， 再按還原糖測定。水解前后還原糖的差值為蔗糖含量。本國家標準由全國 衛生標準技術委員會食品衛生標準分委員會提出，由衛生部食品衛生監督 檢驗所歸口。本國家標準由衛生部食品衛生監督檢驗所負責起草。 發明內容本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯法(Couple Reaction)技術，監測還原 型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定蔗 糖濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的蔗糖測定試劑盒， 采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分^f儀上進行 蔗糖濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應 用。本發明蔗糖濃度測定方法原理如下 .蔗糖+磷酸根蔗糖磷酸化酶D-果糖+01-0-葡萄糖-1-磷酸 D-果糖+還原型輔酶甘露醇脫氫酶甘露醇+輔酶這種方法應用蔗糖磷酸化酶(Disaccharidephosphorylases; EC 2.4.1.7) 偶聯甘露醇脫氫酶(Mannitol dehydrogenase; EC 1.1.1.138; EC 1.1.1.67) 酶促反應連續監測法/終點比色法。蔗糖磷酸化酶酶解蔗糖反應產生D-果 糖，再通過偶聯甘露醇脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有 吸收峰)氧化成為輔酶(在340nrn處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型 輔酶在340nrn處吸光度下降的程度/速度，通過測量340nm處吸光度下降 的程度/速度，可以測算蔗糖的濃度大小。實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮， 無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發明蔗糖測定試劑盒較為 理想磷酸緩沖液 100mmol/L 穩定劑 500 mmol/L還原型輔酶 0.25 mmol/L蔗糖磷酸化酶 10000 U/L甘露醇脫氫酶 12000 U/L磷酸根底物可以使用磷酸緩沖液取代，如果使用其他緩沖液，則需要加 入磷酸根底物。本發明的蔗糖測定試劑盒可以是單劑，包括磷酸緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、蔗糖磷酸化酶、甘露醇脫氫酶。 試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體 試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑l磷酸緩沖液、穩定劑、還原型輔酶。 試劑2磷酸緩沖液、穩定劑、蔗糖磷酸化酶、甘露醇脫氫酶。 還原型輔酶、蔗糖磷酸化酶、甘露醇脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置 可以不限。試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配 制成液體試劑，直接使用。還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1磷酸緩沖液、穩定劑、還原型輔酶。 試劑2磷酸緩沖液、穩定劑、甘露醇脫氫酶。試劑3磷酸緩沖液、穩定劑、蔗糖磷酸化酶。 還原型輔酶、蔗糖磷酸化酶、甘露醇脫氫酶在試劑l、試劑2或試劑3 中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定蔗糖濃度的方法，其還原型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實施方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。 實施例一本實施例的蔗糖測定試劑為單試劑，包括: 磷酸緩沖液 穩定劑 還原型輔酶 蔗糖磷酸化酶 甘露醇脫氫酶謂mmol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L10000 U/L12000U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用 前，加入純凈水，復溶后使用。在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始吸光 度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測蔗糖樣品與試 劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約0 分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出蔗糖的濃度大小。實施例二本實施例的蔗糖測定試劑為雙試劑，包括 試劑1磷酸緩沖液穩定劑還原型輔f廳mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L試劑2磷酸緩沖液 穩定劑蔗糖磷酸化酶 甘露醇脫氫酶100 mmol/L500 mmol/L10000U/L 12000U/L試劑全部溶解配好后，.分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測蔗糖樣品與試劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出蔗糖的濃度大小。實施例三本實施例的蔗糖測定試劑為三試劑，包括: 試劑1磷酸緩沖液 穩定劑 還原型輔酶 試劑2磷酸緩沖液 穩定劑甘露醇脫氫酶100mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L100mmol/L 500 mmol/L 12000U/L試劑3磷酸緩沖液 穩定劑蔗糖磷酸化酶畫mmol/L 500 mmol/L 10000U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定蔗糖濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37°C，反應時間 10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm， 被測蔗糖樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方向 為負反應(下降反應)，延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析 儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出蔗糖的濃度 大小。申請人經過實驗驗證，采用以上發明內容中記載的其他各種還原型色 原體組合均能達到本發明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同， 不另一一例舉。總之，實驗證明，采用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀 器得出所需的測定結果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應用。
權利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯法技術的蔗糖濃度測定方法，其方法原理如下蔗糖+磷酸根 蔗糖磷酸化酶 D-果糖+α-D-葡萄糖-1-磷酸D-果糖+還原型輔酶 甘露醇脫氫酶 甘露醇+輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，測算出蔗糖的濃度大小測定結果。
2. —種蔗糖測定試劑盒，主要成分包括: 磷酸緩沖液 穩定劑 還原型輔酶 蔗糖磷酸化酶 甘露醇脫氫酶20-500 mmol/L-4000 mmol/L0.1-0.35mmol/L1000——80000 U/L1000——80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。磷酸根底物可以使用磷酸緩沖液取 代，如果使用其他緩沖液，則需要加入磷酸根底物。
3. 根據權利要求2所述蔗糖測定試劑盒，其特征在于 由磷酸緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、蔗糖磷酸化酶、甘露醇脫氫酶組 成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述蔗糖測定試劑盒，其特征在于由磷酸緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、蔗糖磷酸化酶、甘露醇脫氫酶組成雙劑試劑；試劑l，由磷酸緩沖液、穩定劑、還原型輔酶組成；試劑 2，由磷酸緩沖液、穩定劑、蔗糖磷酸化酶、甘露醇脫氫酶組成。還原 型輔酶、蔗糖磷酸化酶、甘露醇脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以 不限。
5. 根據權利要求2所述蔗糖測定試劑盒，其特征在于由磷酸緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、蔗糖磷酸化酶、甘露醇脫氫酶組 成多劑試劑；試劑l，由磷酸緩沖液、穩定劑、還原型輔酶組成；試劑 2，由磷酸緩沖液、穩定劑、甘露醇脫氫酶組成；試劑3，由磷酸緩沖 液、穩定劑、蔗糖磷酸化酶組成。還原型輔酶、蔗糖磷酸化酶、甘露醇 脫氫酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據權利要求2所述蔗糖測定試劑盒，其特征在于還包括穩定劑 14000 mmol/L或0.1。/o-100。/。體積比。所述穩定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發明涉及一種利用酶比色法及酶聯法技術的蔗糖測定試劑盒，同時本發明還涉及測定蔗糖濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于食品檢驗測定技術領域。本發明的試劑盒主要成分包括磷酸緩沖液、還原型輔酶、蔗糖磷酸化酶、甘露醇脫氫酶及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的程度/速度，從而測算出蔗糖的濃度大小。
文檔編號C12Q1/26GK101329265SQ20071002473
公開日2008年12月24日 申請日期2007年6月21日 優先權日2007年6月21日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司