制備鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質的方法

專利名稱：制備鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質的方法
技術領域：
本發明屬于生物技術中色素蛋白質材料領域，具體涉及一種制備鏈霉親和素標記的別 藻藍蛋白類熒光蛋白質的方法。 技術背景藻膽蛋白(phycobiliprotein)是藍藻和紅藻光合作用捕光復合物的功能組分。根據 其吸收光譜和熒光光譜特征，藻膽蛋白可以分為藻紅蛋白(phycoerythrin，簡稱CPE)、 藻紅藍蛋白(phycoerythrocyanin，簡稱PEC)、藻藍蛋白(phycocyanin，簡稱CPC)和 別藻藍蛋白(allophycocyanin，簡稱APC)。藻紅蛋白、藻紅藍蛋白、藻藍蛋白和變藻藍 蛋白含alpha ( a )和beta ( P )亞基，每個亞基中藻膽色素(phycobilin)通過硫醚鍵 與藻膽蛋白脫輔基蛋白(apo-phycobiliprotein)半胱氨酸殘基的巰基共價結合，其種類 及其與脫輔基蛋白的相互作用決定藻膽蛋白的光譜性質。藻膽色素與脫輔基蛋白共價結合 形成特定的構象，使得藻紅蛋白主要吸收約560nm的可見光，發射約580nm的熒光；藻紅 藍蛋白吸收約570nm的可見光，發射約630nm的熒光；藻藍蛋白吸收約620nm的可見光， 發射約640nm的熒光；變藻藍蛋白吸收約650 660nm的可見光，發射約660 670nm的熒 光。藻紅蛋白結合的輔基色素為藻紅膽素(phycoerythrobilin，簡稱PEB);藻紅藍蛋白 的alpha亞基結合的輔基色素為藻紫膽素(phycoviolobilin，簡稱PVB);藻紅藍蛋白的 beta亞基結合的輔基色素為藻藍膽素(phycocyanobilin，簡稱PCB);藻藍蛋白和變藻藍 蛋白結合的輔基色素都為藻藍膽素PCB。藻膽蛋白具有提高人體免疫力，促進動物血細胞再生等功能，能抑制癌細胞生長，對癌細胞有很強的殺傷力，是一種無毒無副作用的理想光敏劑，可減輕腫瘤化療的副作用。 藻膽蛋白作為一種天然色素，也可作為高級天然色素應用于食品和化妝品中。藻膽蛋白由 于還具有強烈的熒光性，在分子生物學上可用于制備熒光探針，適用于免疫學、細胞學、 生理學和分子生物學等方面的研究。鏈霉親和素可以跟生物素特異結合，通過鏈霉親和素-生物素系統，可以實現信號放 大作用，提高檢測靈敏度。目前鏈霉親和素-生物素系統已經廣泛應用于生物學檢測和醫 療檢測等領域。目前主要是通過化學交聯實現鏈霉親和素對目標的標記。藻藍膽素生物合成基因由力o7和；^^組成，可以通過大腸桿菌基因工程菌來生產藻 藍月旦素(F. T. Landgraf, C. Forreiter, et al. Recombinant holophytochrome in Echerichia coli[J]. FEBS Letters, 2001， 508:459-462)。與前人的方法不同，在Z/7a6ae/7asp. PCC7120 中a^W77基因和5>/7ec/ oc_F"& sp. PCC 6803中sZrW必基因分別編碼beta裂合酶，
在其它藍藻中也存在同源的beta裂合酶。這些beta裂合酶能催化藻藍膽素與別藻藍蛋白 亞基脫輔基蛋白及其同源蛋白質共價結合，從而生成具有優良熒光性質的別藻藍蛋白類熒 光蛋白質。通過基因工程技術，把鏈霉親和素基因和別藻藍蛋白亞基脫輔基蛋白基因拼接 后克隆于表達載體，可以在大腸桿菌內表達得到鏈霉親和素和別藻藍蛋白亞基脫輔基蛋白 的融合蛋白，直接實現鏈鏈霉親和素和別藻藍蛋白亞基脫輔基蛋白的連接，而不需要通過 化學交聯等方法來實現鏈霉親和素標記。藻膽蛋白類熒光蛋白質可以應用于食品、化妝品、醫藥和生物工程領域。別藻藍蛋白 類熒光蛋白質具有優良的熒光性質，通過直接實現鏈鏈霉親和素和別藻藍蛋白亞基脫輔基 蛋白的連接，可用于生物學檢測以及醫療檢測領域。本發明為別藻藍蛋白類色素蛋白質功 能材料應用于醫藥和生物工程領域，特別是檢測領域奠定了基礎。發明內容本發明的目的在于提供一種制備鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質的方法， 它是應用beta裂合酶催化藻藍膽素與鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類脫輔基蛋白共價結 合，從而制備鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質；將含有beta裂合酶基因、鏈 霉親和素和別藻藍蛋白類脫輔基蛋白拼接的基因、藻藍膽素生物合成酶基因的表達質粒依 次轉入宿主菌，得到相應的工程菌，通過這種方法得到的基因工程菌生產鏈霉親和素標記 的別藻藍蛋白類熒光蛋白質。本發明的目的是這樣實現的 一種制備鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質的 方法，包括下述步驟(1) 將beta裂合酶基因或其同源基因克隆于表達載體中，得到beta裂合酶表達質粒；(2) 將鏈霉親和素基因和別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因或其同源基因克隆于第二個 表達載體中，得到鏈霉親和素標記的脫輔基蛋白表達質粒；(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因(ZwJ和；xy^)或其同源基因克隆于第三個表達載 體中，得到藻藍膽素合成質粒；(4) 將beta裂合酶表達質粒、鏈霉親和素標記的脫輔基蛋白表達質粒和藻藍膽素生 物合成酶質粒依次轉入配套的宿主菌；當這些表達質粒都轉入宿主菌后，得到相應的工程 菌，將此工程菌發酵后，按常規蛋白質提純技術，提純得到相應的鏈霉親和素標記的別藻 藍蛋白類熒光蛋白質。本發明的述的制備鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質的方法中所述的宿主 菌為大腸桿菌；所述的beta裂合酶基因是指與力朋6朋朋sp. PCC7120中alr^W7基因或 5y"ec力ocj^"s sp. PCC 6803中s^^似^基因同源的基因；所述的別藻藍蛋白類脫輔基 蛋白基因是指與力朋6ae朋sp. PCC7120或分"ec力oc/"j's sp. PCC 6803中別藻藍蛋白基因同源的基因。本發明與現有技術相比，具有以下優點1、 不使用藻類為原料而是利用大腸桿菌生產別藻藍蛋白類熒光蛋白質，大腸桿菌繁 殖快，可以大大縮短周期；2、 與藻類相比，大腸桿菌細胞壁容易破碎，純化過程中可節省能源；3、 通過大腸桿菌生產，目標蛋白含量高，有His-tag標記，且體系中幾乎沒有性質 類似的蛋白，提取方便；4、 產物中鏈霉親和素與熒光藻膽蛋白類色素蛋白質直接結合，不需額外進行處理， 有利于發展熒光藻膽蛋白類色素蛋白質在檢測領域的應用。


圖1為本發明制備鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質ApcA的吸收與熒光光 譜；其中實線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜。圖2為本發明制備鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質ApcA2的吸收與熒光光 譜；其中實線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜。圖3為本發明制備鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質ApcB的吸收與熒光光 譜；其中實線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜。圖4為本發明制備鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質ApcD的吸收與熒光光譜；其中實線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜。圖5為本發明制備鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質ApcF的吸收與熒光光 譜；其中實線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜。
具體實施方式
下面將結合附圖和實施例對本發明作進一步的詳述 實施例1(1) 從GeneBank中可以査到，藻種J/7aA3e朋sp. PCC7120和5y/ ec/wc/"is sp. PCC 6803的全序列已經測定完成。力/ a6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號為BA000019; 5y"ec/ ocysz^s sp. PCC 6803在GeneBank中編號為BA000022;可從全序列中找到所需 基因；通過基因工程方法，將」朋tee朋sp. PCC7120中的a7r^77基因克隆于Novagen公 司的pCDFDuet-1中，所得質粒叫pCDFDuet-WrW77，在大腸桿菌中能表達beta裂合酶。根據GeneBank中查到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相 應質粒中同樣的酶切位點上。(2) 將Z朋力ae朋sp. PCC7120中的別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因spc力和鏈霉親和素
基因(簡稱幼)拼接后克隆于Novagen公司的表達載體pET30中，所得質粒叫 pET30-幼-邵M，鏈霉親和素基因和別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中 能表達得到鏈霉親和素和別藻藍蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標記的脫 輔基蛋白別藻藍蛋白A。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因(力o/和pc州)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得質粒叫pACYCDuet-力o7-^/A在大腸桿菌中能同時表達H01和PcyA。即脫輔基蛋白基因邵d在pET30中是在fcoRV和i7wl兩個酶切位點之間，鏈霉親 和素基因sa在^cotI和i9^/n兩個酶切位點之間；裂合酶基因sZrt 《77在pCDFDuet中， 處于第二個多克隆位點，酶切位點是A^fe I和屈o I ; PCB合成酶基因是2個(力o/和pcW)， 它們在同一個載體pACYCDuet-1中，力o7處于第一個多克隆位點，在Afco I禾n之間，在第二個多克隆位點，在A^e I和i7w I之間。基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(4) 將pCDFDuet-alrt W7、 pET30-sa~apc/I和pACYCDuet-力a -p《W轉入大腸桿菌， 當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養 基中，37'C振蕩培養至0D,為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表達約12小 時，生產鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質藻藍膽素-別藻藍蛋白A;離心收集 菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到 相應的鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質藻藍膽素-別藻藍蛋白A。其吸收與熒 光光譜見圖l所示，其中實線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜。將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式如下從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3)單菌落，接種于5mLLB培養基，37 t:振蕩培養過夜；取100pL飽和培養物，無菌轉接至5mLLB培養基，37。C振蕩培養至0D6。。 =0. 3 0. 4時，將菌液轉移至5mL無菌離心管中，冰上放置10分鐘；離心1分鐘(10000g， 4°C)棄去上清，收集沉淀菌體；用lmL預冷的0. lmol/L CaCl2無菌溶液重懸菌體,離心30 秒(10000g, 4。C)去上清，菌體沉淀用100nL預冷的0. lmol/L CaCl2重懸，放置于冰上，
加入一定量的構建好的質粒，混勻后冰浴放置30分鐘，42'C熱休克90秒，冰浴5分鐘后 加入300nL LB培養基，37'C低速振蕩培養45分鐘，無菌涂布在含有相應抗生素的LB培 養基平板上，倒置于37'C培養箱至形成可見的單克隆菌斑。提取3個左右菌落，分別接種到5ml含相應抗生素的LB培養基中，振蕩培養至飽和； 分別從中取100pL轉接至5ml含相應抗生素的LB培養基中；37'C振蕩培養至OD6。。=0. 5-0. 7 時，冰浴約30分鐘，加入IPTG誘導表達；避光、2(TC、 150轉/分，表達約12小時。離 心收集細胞，細胞加入緩沖液重懸；通過光譜儀測其產物熒光量，選取熒光產量高的菌株 進行大量表達。實施例2(1) 從GeneBank中可以查到，藻種/J/ a6ae朋sp. PCC7120和5y"ec力oc;^tj^sp. PCC 6803的全序列已經測定完成；/l朋6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號為BA000019; 5y/ ec力ocy"is sp. PCC 6803在GeneBank中編號為BA000022;可從全序列中找到所需 基因；通過基因工程方法，將七a6ae朋sp. PCC7120中的aZrt W7基因克隆于Novagen公 司的pCDFDuet-1中，所得質粒叫pCDFDuet-Wr^77，在大腸桿菌中能表達beta裂合酶。根據GeneBank中査到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相 應質粒中同樣的酶切位點上。(2) 將yl朋6ae朋sp. PCC7120中的別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因apcA和鏈霉親和素 基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達載體pET30中，所得質粒叫 pET30-sa"邵cA，鏈霉親和素基因和別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中 能表達得到鏈霉親和素和別藻藍蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標記的脫 輔基蛋白別藻藍蛋白A2。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。 (3)將藻藍膽素生物合成酶基因(力o7和pc州)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得質粒叫pACYCDuet-力o -pc/A在大腸桿菌中能同時表達H01和PcyA。即脫輔基蛋白基因邵c^在pET30中是在fcoRV和J力o I兩個酶切位點之間，鏈霉親 和素基因幼在J/ " I和)fein兩個酶切位點之間；裂合酶基因3介W77在pCDFDuet中， 處于第二個多克隆位點，酶切位點是AWe I和J力o I ; PCB合成酶基因是2個(力o7和pc州)， 它們在同一個載體pACYCDuet-1中，力o7處于第一個多克隆位點，在I和At I之間， ; cj^在第二個多克隆位點，在A^e I和i7 o I之間。基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，
把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(4)將pCDFDuet-aZrt^7;7、 pET30-sa"邵cA禾卩pACYCDuet-Z o7-pc州轉入大腸桿菌， 當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養 基中，37'C振蕩培養至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-13-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l腿ol/L， 20。C至37。C振蕩表達約12小 時，生產鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質藻藍膽素-別藻藍蛋白A2;離心收集 菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過N:T親和層析，可提純得到 相應的鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質藻藍膽素-別藻藍蛋白A2。其吸收與熒 光光譜見圖2所示，其中實線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜。將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。實施例3(1) 從GeneBank中可以査到，藻種如aZ^e朋sp. PCC7120和6y/ ec/ ocys"s sp. PCC 6803的全序列己經測定完成；^朋6sm3 sp. PCC7120在GeneBank中編號為BA000019; 5y/7ec/ ocys^'s sp. PCC 6803在GeneBank中編號為BA000022;可從全序列中找到所需 基因；通過基因工程方法，將J朋Z^e/ a sp. PCC7120中的s&M77基因克隆于Novagen公 司的pCDFDuet-1中，所得質粒叫pCDFDuet-aZrt W7，在大腸桿菌中能表達beta裂合酶。根據GeneBank中査到的基因序列，設計了引物，禾U用相應的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相 應質粒中同樣的酶切位點上。(2) 將^7a&e/7asp.PCC7120中的別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因鄰 c萬和鏈霉親和素 基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達載體pET30中，所得質粒叫pET30-sa -apcA鏈霉親和素基因和別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中能表達得 到鏈霉親和素和別藻藍蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標記的脫輔基蛋白 別藻藍蛋白B。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因(力W和/7C^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得質粒叫pACYCDuet-Z o7-; c州，在大腸桿菌中能同時表達H01和PcyA。即脫輔基蛋白基因邵c^在pET30中是在ScoRV和兩個酶切位點之間，鏈霉親 和素基因sa在I和《^n兩個酶切位點之間；裂合酶基因aZrt^/7在pCDFDuet中， 處于第二個多克隆位點，酶切位點是Afafe I和J力o I ; PCB合成酶基因是2個(力o7和pc_M)， 它們在同一個載體pACYCDuet-l中，力o7處于第一個多克隆位點，在AfcoI和/^n之間， pc州在第二個多克隆位點，在AWe I和J力o I之間。基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致h 1混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(4)將pCDFDuet-alrt^77、 pET30-wapc^和pACYCDuet-力o7-轉入大腸桿菌， 當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌，將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養 基中，37。C振蕩培養至0D,為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(is叩rophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lramol/L， 20。C至37。C振蕩表達約12小 時，生產鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質藻藍膽素-別藻藍蛋白B;離心收集 菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到 相應的鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質藻藍膽素-別藻藍蛋白B。其吸收與熒 光光譜見圖3所示，其中實線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜。將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。實施例4(1) 從GeneBank中可以査到，藻種^ a6ae朋sp. PCC7120和5y"ec/ ocys"s sp. PCC 6803的全序列已經測定完成；/(/7a6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號為BA000019， 5>/ ec/ ocj^"'s sp. PCC 6803在GeneBank中編號為BA000022，可從全序列中找到所需 基因；通過基因工程方法，將^7a6ae朋sp. PCC7120中的WrM77基因克隆于Novagen公 司的pCDFDuet-l中，所得質粒叫pCDFDuet-a7rM77，在大腸桿菌中能表達beta裂合酶。根據GeneBank中査到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相 應質粒中同樣的酶切位點上。(2) 將^7a/^e朋sp. PCC7120中的別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因apc/ 和鏈霉親和素 基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達載體pET30中，所得質粒叫 pET30-stapcZ ，鏈霉親和素基因和別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中 能表達得到鏈霉親和素和別藻藍蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標記的脫 輔基蛋白別藻藍蛋白D。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因(力o7和pcW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得質粒叫pACYCDuet-力o7-pcyA在大腸桿菌中能同時表達H01和PcyA。即脫輔基蛋白基因邵c/ 在pET30中是在fcoRV和J7w I兩個酶切位點之間，鏈霉親 和素基因幼在和i9WII兩個酶切位點之間；裂合酶基因alrt^77在pCDFDuet中， 處于第二個多克隆位點，酶切位點是/fefe I和i7w I ; PCB合成酶基因是2個(力o7和/7C/力)， 它們在同一個載體pACYCDuet-1中，力o7處于第一個多克隆位點，在yVco I和尸"I之間， pc/力在第二個多克隆位點，在yWe I和J/ o I之間。基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(4) 將pCDFDuet-a7r。W7、 pET30-幼-邵c"和pACYCDuet-力o7-; c/力轉入大腸桿菌， 當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養 基中，37。C振蕩培養至0D6。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(is叩r叩hyl thio-(5-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表達約12小 時，生產鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質藻藍膽素-別藻藍蛋白D;離心收集 菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Nr親和層析，可提純得到 相應的鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質藻藍膽素-別藻藍蛋白D。其吸收與熒 光光譜見圖4示，其中實線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜。將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。 實施例5(1)從GeneBank中可以査到，藻種^ a力a朋a sp. PCC7120和5y"ec/ oc;^tis sp. PCC 6803的全序列已經測定完成。勘a6織a sp. PCC7120在GeneBank中編號為BA000019， 5y/ ec/ ocj^"s sp. PCC 6803在GeneBank中編號為BA000022，可從全序列中找到所需 基因；通過基因工程方法，將力朋6ae朋sp. PCC7120中的Wr^《77基因克隆于Novagen公 司的pCDFDuet-1中，所得質粒叫pCDFDuet-Wr^W7，在大腸桿菌中能表達beta裂合酶。 根據GeneBank中查到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴增得到所需片段。通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相 應質粒中同樣的酶切位點上。(2) 將^7s^朋asp.PCC7120中的別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因apcF和鏈霉親和素 基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達載體pET30中，所得質粒叫 pET30-sta/ cF，鏈霉親和素基因和別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中 能表達得到鏈霉親和素和別藻藍蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標記的脫 輔基蛋白別藻藍蛋白F。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893,通過全基因合成得到。(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因(力o7和pcW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得質粒叫pACYCDuet-力o7-p《W，在大腸桿菌中能同時表達HOi和PcyA。即脫輔基蛋白基因邵c尸在pET30中是在fcoRV和兩個酶切位點之間，鏈霉親 和素基因幼在I和^^1I兩個酶切位點之間；裂合酶基因Wr^W7在pCDFDuet中， 處于第二個多克隆位點，酶切位點是A^e I和i7 o I ; PCB合成酶基因是2個(力o7和pc/力)， 它們在同一個載體pACYCDuet-1中，力o7處于第一個多克隆位點，在Afco I和尸"I之間， pc/J在第二個多克隆位點，在M/e I和J力o I之間。基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板，經過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收，所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(4) 將pCDFDuet-aZrW7;7、 pET30-sa-邵c尸和pACYCDuet-/ o7-pc^轉入大腸桿菌， 當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養 基中，37"C振蕩培養至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表達約12小 時，生產鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質藻藍膽素-別藻藍蛋白F，離心收集 菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni"親和層析，可提純得到 相應的鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質藻藍膽素-別藻藍蛋白F。其吸收與熒 光光譜見圖5，其中實線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜。將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。 實施例6(1)從GeneBank中可以查到，藻種/1/Ja6ae朋sp. PCC7120和5)77ec/ ocy"j's sp. PCC 6803的全序列已經測定完成，力朋6雄a sp.PCC7120在GeneBank中編號為BA000019, 5y; ec力ocj^"s sp. PCC 6803在GeneBank中編號為BA000022，可從全序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將5y/ ec力oc;^"s sp. PCC 6803中的W/^似9基因克隆于 Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質粒叫pCDFDuet- W/^似9，在大腸桿菌中能表達 beta裂合酶。根據GeneBank中查到的基因序列，設計了引物，禾U用相應的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴增得到所需片段；通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相 應質粒中同樣的酶切位點上。(2) 將^73&e朋sp.PCC7120中的別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因邵d和鏈霉親和素 基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達載體pET30中，所得質粒叫 pET30-stap"，鏈霉親和素基因和別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中 能表達得到鏈霉親和素和別藻藍蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標記的脫 輔基蛋白別藻藍蛋白A。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893,通過全基因合成得到。(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因(力W和pc^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得質粒叫pACYCDuet-/w7-; c/A在大腸桿菌中能同時表達H01和PcyA。即脫輔基蛋白基因邵d在pET30中是在fcoRV和i7 o I兩個酶切位點之間，鏈霉親 和素基因ss在和S《7II兩個酶切位點之間；裂合酶基因Wri^必在pCDFDuet中， 處于第二個多克隆位點，酶切位點是A^e I和J力o I ; PCB合成酶基因是2個(力o7和pcjo4)， 它們在同一個載體pACYCDuet-1中，力o7處于第一個多克隆位點，在Afco I和尸W I之間， pcy力在第二個多克隆位點，在We I和J力o I之間。基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板，經過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(4) 將pCDFDuet- W/^,、 pET30，-邵d和pACYCDuet-力。7-; 一轉入大腸桿菌， 當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于PH 7. 0的LB培養 基中，37。C振蕩培養至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表達約12小 時，生產鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質藻藍膽素-別藻藍蛋白A;離心收集 菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過N:T親和層析，可提純得到 相應的鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質藻藍膽素-別藻藍蛋白A。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。 實施例7:(1) 從GeneBank中可以査到，藻種勘atee朋sp. PCC7120和5y"ec/ oc/s"s sp. PCC 6803的全序列已經測定完成,J"a6ae朋sp.PCC7120在GeneBank中編號為:BA000019， 6y/7ec力oc/Wis sp. PCC 6803在GeneBank中編號為BA000022，可從全序列中找到所需 基因；通過基因工程方法，將5y/7ec7 oc/Wis sp. PCC 6803中的slri"似^基因克隆于 Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質粒叫pCDFDuet- sZri"似^，在大腸桿菌中能表達 beta裂合酶。根據GeneBank中查到的基因序列，設計了引物，禾U用相應的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴增得到所需片段；通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相 應質粒中同樣的酶切位點上。(2) 將Z"a力ae/7asp.PCC7120中的別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因鄰 c^和鏈霉親和素 基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達載體pET30中，所得質粒叫 pET30-s『apcA，鏈霉親和素基因和別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中 能表達得到鏈霉親和素和別藻藍蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標記的脫 輔基蛋白別藻藍蛋白A2。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因(7 o7和pcW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得質粒叫pACYCDuet-力o7-pc//I，在大腸桿菌中能同時表達H01和PcyA。即脫輔基蛋白基因邵cA在pET30中是在ScoRV和X/wI兩個酶切位點之間，鏈霉親 和素基因sa在1和^71I兩個酶切位點之間；裂合酶基因Wr^^9在pCDFDuet中， 處于第二個多克隆位點，酶切位點是yVofe I和J/w I ; PCB合成酶基因是2個(力W和pcy/D， 它們在同一個載體pACYCDuet-1中，力o/處于第一個多克隆位點，在Abo I和尸W I之間， pc州在第二個多克隆位點，在A^e I和J力o I之間。基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板，經過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(4) 將pCDFDuet- Wr^似久pET30-sa-apc力和pACYCDuet-力o7-pc/力轉入大腸桿菌， 當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養
基中，37。C振蕩培養至0D柳為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmraol/L， 20。C至37。C振蕩表達約12小 時，生產鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質藻藍膽素-別藻藍蛋白A2;離心收集 菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到 相應的鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質藻藍膽素-別藻藍蛋白A2。將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。實施例8(1)從GeneBank中可以查到；藻種^7a6ae朋sp. PCC7120和5y"ec力ocysZ^'s sp. PCC 6803的全序列已經測定完成；j朋力3e朋sp. PCC7120在GeneBank中編號為..BA000019， 5"/7 ec力oc/s"s sp. PCC 6803在GeneBank中編號為BA000022，可從全序列中找到所需 基因；通過基因工程方法，將5)77ec/ oc/"/s sp. PCC 6803中的sZr^似^基因克隆于 Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質粒叫pCDFDuet- Wri^4仏在大腸桿菌中能表達 beta裂合酶。根據GeneBank中查到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴增得到所需片段；通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相 應質粒中同樣的酶切位點上。(2)將力朋力朋朋sp.PCC7120中的別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因apM和鏈霉親和素 基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達載體pET30中，所得質粒叫 pET30-st邵cA鏈霉親和素基因和別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中 能表達得到鏈霉親和素和別藻藍蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標記的脫 輔基蛋白別藻藍蛋白B。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。 (3)將藻藍膽素生物合成酶基因(力o/和pc;^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得質粒叫pACYCDuet-力o7-;;c/A在大腸桿菌中能同時表達H01和PcyA。即脫輔基蛋白基因砂c萬在pET30中是在fcoRV和J力ol兩個酶切位點之間，鏈霉親 和素基因sa在A>/71和i9^II兩個酶切位點之間；裂合酶基因sZri^^在pCDFDuet中， 處于第二個多克隆位點，酶切位點是Mfe I和化o I ; PCB合成酶基因是2個(力o/和；xr力)， 它們在同一個載體pACYCDuet-1中，力o7處于第一個多克隆位點，在Afco I和尸W I之間， pc_M在第二個多克隆位點，在Abfe I和J力o I之間。基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(4)將pCDFDuet- ^Zr^ 必、pET30-幼-邵c5和pACYCDuet-力o7-轉入大腸桿菌， 當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養 基中，37'C振蕩培養至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside,簡稱IPTG)至終濃度為l咖ol/L， 20。C至37。C振蕩表達約12小 時，生產鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質藻藍膽素-別藻藍蛋白B;離心收集 菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過N:T親和層析，可提純得到 相應的鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質藻藍膽素-別藻藍蛋白B。將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。實施例9(1)從GeneBank中可以查到，藻種^/7a/we/ a sp. PCC7120和5y"ec/ oc;^z^s sp. PCC 6803的全序列已經測定完成；加atee朋sp.PCC7120在GeneBank中編號為BA000019， 5y"ec/ ocj^tis sp. PCC 6803在GeneBank中編號為BA000022，可從全序列中找到所需 基因；通過基因工程方法，將5)77ec力oc/WA sp. PCC 6803中的W/^似9基因克隆于 Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質粒叫pCDFDuet- W/^似義在大腸桿菌中能表達 beta裂合酶。根據GeneBank中査到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴增得到所需片段；通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相 應質粒中同樣的酶切位點上。(2)將A7^ae朋sp.PCC7120中的別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因邵c/ 和鏈霉親和素 基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達載體pET30中，所得質粒叫 pET30-s^apcA鏈霉親和素基因和別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中 能表達得到鏈霉親和素和別藻藍蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標記的脫 輔基蛋白別藻藍蛋白D。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。 (3)將藻藍膽素生物合成酶基因(力W和克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得質粒叫pACYCDuet-/w7-/ cW，在大腸桿菌中能同時表達H01和PcyA。即脫輔基蛋白基因邵c"在pET30中是在feoRV和兩個酶切位點之間，鏈霉親 和素基因m在A>/71和5《JII兩個酶切位點之間；裂合酶基因s7/^^^在pCDFDuet中， 處于第二個多克隆位點，酶切位點是AWe I和J力o I ; PCB合成酶基因是2個(力o7和pcy力)，
它們在同一個載體pACYCDuet-l中，力o 處于第一個多克隆位點，在I和/^t I之間， pc州在第二個多克隆位點，在I和化o I之間。基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(4)將pCDFDuet- sZr^似義pET30-sa-a; c"和pACYCDuet-/ o7-/ cj^轉入大腸桿菌， 當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養 基中，37'C振蕩培養至OD,為0.5至0.8，加入異丙基硫代-卩-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為1誦1/L， 20。C至37。C振蕩表達約12小 時，生產鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質藻藍膽素-別藻藍蛋白D;離心收集 菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni"親和層析，可提純得到 相應的鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質藻藍膽素-別藻藍蛋白D。將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。實施例10(1)從GeneBank中可以査到，藻種勘a&e朋sp. PCC7120和5y/jec/ oc/"j's sp. PCC 6803的全序列已經測定完成；」朋6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號為BA000019， 5yy7ec力ocy"^ sp. PCC 6803在GeneBank中編號為BA000022，可從全序列中找到所需 基因；通過基因工程方法，將5yy ec力ocy"is sp. PCC 6803中的WriW49基因克隆于 Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質粒叫pCDFDuet- s7ri^似9，在大腸桿菌中能表達 beta裂合酶。根據GeneBank中查到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相 應質粒中同樣的酶切位點上。(2)將/)/7a6a朋a sp. PCC7120中的別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因a/ c,和鏈霉親和素 基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達載體pET30中，所得質粒叫 pET30-sa"a/ c尸，鏈霉親和素基因和別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中 能表達得到鏈霉親和素和別藻藍蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標記的脫 輔基蛋白別藻藍蛋白F。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。1
(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因(力W和；xy^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得質粒叫pACYCDuet-力o7-pcj^，在大腸桿菌中能同時表達H01和PcyA。即脫輔基蛋白基因邵c尸在pET30中是在fcoRV和兩個酶切位點之間，鏈霉親 和素基因sa在1和^^1I兩個酶切位點之間；裂合酶基因s7/^^^在pCDFDuet中， 處于第二個多克隆位點，酶切位點是Mfe I和Z力o I ; PCB合成酶基因是2個(力o/和pc/Zl)， 它們在同一個載體pACYCDuet-l中，力o7處于第一個多克隆位點，在Abo I和尸"I之間，在第二個多克隆位點，在yVofe I和X力o I之間。基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(4) 將pCDFDuet- slriY 必、pET30-sa-a; c,和pACYCDuet-力o7了cj^轉入大腸桿菌， 當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養 基中，37"振蕩培養至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(is叩r叩hyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表達約12小 時，生產鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質藻藍膽素-別藻藍蛋白F;離心收集 菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過N:T親和層析，可提純得到 相應的鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質藻藍膽素-別藻藍蛋白F。將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。 實施例11(1)從GeneBank中可以查到，藻種Anabaena sp. PCC7120和Synoohocystis sp. PCC 6803的全序列已經測定完成；力朋Anabaena p.PCC7120在GeneBank中編號為BA000019，Synoohocystis sp. PCC 6803在GeneBank中編號為BA000022，可從全序列中找到所需 基因；通過基因工程方法，將Anabaena sp.PCC7120中的WrM77基因克隆于Novagen公 司的pCDFDuet-1中，所得質粒叫pCDFDuet-a7rW77，在大腸桿菌中能表達beta裂合酶。根據GeneBank中査到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相 應質粒中同樣的酶切位點上。(2)將Synechocystis sp.PCC 6803中的別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因邵d和鏈霉 親和素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達載體pET30中，所得質粒叫
pET30-sa"apc4，鏈霉親和素基因和別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中 能表達得到鏈霉親和素和別藻藍蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標記的脫 輔基蛋白別藻藍蛋白A。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因(力o/和pcW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得質粒叫pACYCDuet-力o7-pc/A在大腸桿菌中能同時表達H01和PcyA。即脫輔基蛋白基因s; c力在pET30中是在fcoRV和Z力o I兩個酶切位點之間，鏈霉親 和素基因sa在勤/ I和5WII兩個酶切位點之間；裂合酶基因alrW77在pCDFDuet中， 處于第二個多克隆位點，酶切位點是M/e I和I ; PCB合成酶基因是2個(/ o7和pcj^)， 它們在同一個載體pACYCDuet-l中，力o7處于第一個多克隆位點，在〃co I和尸"I之間， / c州在第二個多克隆位點，在y^e I和J力o I之間。基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(4) 將pCDFDuet-aZrt^77、 pET30-sa和pACYCDuet-力o7-; 《W轉入大腸桿菌， 當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養 基中，37'C振蕩培養至006。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(is叩r叩hyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表達約12小 時，生產鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質藻藍膽素-別藻藍蛋白A;離心收集 菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到 相應的鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質藻藍膽素-別藻藍蛋白A。將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。 實施例12(1)從GeneBank中可以査到，藻種力/ atee朋sp. PCC7120和5y"ec/ oc;^tis sp. PCC 6803的全序列已經測定完成;」朋6細a sp.PCC7120在GeneBank中編號為:BA000019， 5)vjec力oc;^"s sp. PCC 6803在GeneBank中編號為BA000022，可從全序列中找到所需 基因；通過基因工程方法，將^ aZ ae朋sp. PCC7120中的aZr郎77基因克隆于Novagen公 司的pCDFDuet-l中，所得質粒叫pCDFDuet-a&W/7，在大腸桿菌中能表達beta裂合酶。 根據GeneBank中査到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相 應質粒中同樣的酶切位點上。(2)將5)77ec力ocj^z^s sp. PCC 6803中的別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因a/ c^和鏈霉 親和素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達載體pET30中，所得質粒叫 pET30-s^a/7cA鏈霉親和素基因和別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中 能表達得到鏈霉親和素和別藻藍蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標記的脫 輔基蛋白別藻藍蛋白B。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因(力o7和pc州)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得質粒叫pACYCDuet-/ o7-/ c;^，在大腸桿菌中能同時表達H01和PcyA。即脫輔基蛋白基因邵M在pET30中是在fcoRV和o I兩個酶切位點之間，鏈霉親 和素基因幼在yf; /7 1和i5^II兩個酶切位點之間；裂合酶基因a7/^^77在pCDFDuet中， 處于第二個多克隆位點，酶切位點是7W/e I和J力o I ; PCB合成酶基因是2個(力W和pc;^)， 它們在同一個載體pACYCDuet-l中，力o7處于第一個多克隆位點，在AfcoI和/^I之間， pc州在第二個多克隆位點，在Afcfe I和I力o I之間。基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(4) 將pCDFDuet-a^rt^ 7、 pET30-sa-邵c5和pACYCDuet-/ o7-pc州轉入大腸桿菌， 當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養 基中，37。C振蕩培養至0D,為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmraol/L， 20。C至37。C振蕩表達約12小 時，生產鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質藻藍膽素-別藻藍蛋白B;離心收集 菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過N:T親和層析，可提純得到 相應的鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質藻藍膽素-別藻藍蛋白B。將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。 實施例13(1)從GeneBank中可以査到，藻種力朋6ae朋sp. PCC7120和5y/ ec力ocj^z^'s sp. PCC 6803的全序列已經測定完成；力/ ^ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號為BA000019,
分/ ec力oc/"is sp. PCC 6803在GeneBank中編號為BA000022，可從全序列中找到所需 基因；通過基因工程方法，將力/ a力ae朋sp. PCC7120中的a7WW7基因克隆于Novagen公 司的pCDFDuet-1中，所得質粒叫pCDFDuet-s7t^W7，在大腸桿菌中能表達beta裂合酶。根據GeneBank中查到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相 應質粒中同樣的酶切位點上。(2)將5)77ec/wcj^"s sp.PCC 6803中的別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因apc/ 和鏈霉 親和素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達載體pET30中，所得質粒叫 pET30-s『3/7cA鏈霉親和素基因和別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中 能表達得到鏈霉親和素和別藻藍蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標記的脫 輔基蛋白別藻藍蛋白D。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因(力W和pc/力)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得質粒叫pACYCDuet-力o/-/7c州，在大腸桿菌中能同時表達H01和PcyA。即脫輔基蛋白基因spcZ 在pET30中是在feoRV和J力o I兩個酶切位點之間，鏈霉親 和素基因幼在1和^WII兩個酶切位點之間；裂合酶基因Wj^W7在pCDFDuet中， 處于第二個多克隆位點，酶切位點是yVA I和/力o I ; PCB合成酶基因是2個(力W和；xt力)， 它們在同一個載體pACYCDuet-1中，力o7處于第一個多克隆位點，在Afco I和尸"I之間， pc/力在第二個多克隆位點，在yWe I和i7 o I之間。基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(4) 將pCDFDuet-a^rt W7、 pET30-幼-apc/ 和pACYCDuet-力o7-pcy^轉入大腸桿菌， 當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養 基中，37'C振蕩培養至006。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表達約12小 時，生產鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質藻藍膽素-別藻藍蛋白D;離心收集 菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過附2+親和層析，可提純得到 相應的鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質藻藍膽素-別藻藍蛋白D。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。 實施例14(1)從GeneBank中可以査到，藻種^ a6ae朋sp. PCC7120和5>/ ec/ oc_K"is sp. PCC 6803的全序列已經測定完成；力朋6ae朋sp.PCC7120在GeneBank中編號為BA000019， 5>/7ec/wcy"is sp. PCC 6803在GeneBank中編號為BA000022，可從全序列中找到所需 基因；通過基因工程方法，將^ atee朋sp. PCC7120中的aZrt W7基因克隆于Novagen公 司的pCDFDuet-l中，所得質粒叫pCDFDuet-a介W77，在大腸桿菌中能表達beta裂合酶。根據GeneBank中查到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總面A作為模 板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相 應質粒中同樣的酶切位點上。(2)將5>77ec/ octis sp.PCC 6803中的別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因邵cf和鏈霉 親和素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達載體pET30中，所得質粒叫 pET30-s『spc,，鏈霉親和素基因和別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中 能表達得到鏈霉親和素和別藻藍蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標記的脫 輔基蛋白別藻藍蛋白F。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因(Zw7和；xu^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得質粒叫pACYCDuet-力o7-; c.W，在大腸桿菌中能同時表達H01和PcyA。即脫輔基蛋白基因邵c尸在pET30中是在AcoRV和J/wI兩個酶切位點之間，鏈霉親 和素基因sa在f/w I和5^1I兩個酶切位點之間；裂合酶基因a介W77在pCDFDuet中， 處于第二個多克隆位點，酶切位點是A^e I和J力o I ; PCB合成酶基因是2個(力o7和pc_^)， 它們在同一個載體pACYCDuet-l中，力W處于第一個多克隆位點，在Afco I和尸"I之間， pc州在第二個多克隆位點，在We I和i7 o I之間。基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(4) 將pCDFDuet-aZr。W7、 pET30-^-邵c,和pACYCDuet-/ o卜pc//1轉入大腸桿菌， 當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養 基中，37r振蕩培養至0仏。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-卩-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為1腸1/L， 20。C至37。C振蕩表達約12小 時，生產鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質藻藍膽素-別藻藍蛋白F;離心收集 菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到 相應的鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質藻藍膽素-別藻藍蛋白F。將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。實施例15(1)從GeneBank中可以查到，藻種勘a6朋朋sp. PCC7120和6y/7ec/ ocj^tis sp. PCC 6803的全序列已經測定完成；勘a力ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號為BA000019， 5y/ ec/ ocys"s sp. PCC 6803在GeneBank中編號為BA000022,可從全序列中找到所需 基因；通過基因工程方法，將5y"ec/wcy"A sp. PCC 6803中的slr^似9基因克隆于 Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質粒叫pCDFDuet- sZri"似義在大腸桿菌中能表達 beta裂合酶。根據GeneBank中查到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相 應質粒中同樣的酶切位點上。(2)將6y/7ec/wcy^is sp.PCC 6803中的別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因鄰w力和鏈霉 親和素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達載體pET30中，所得質粒叫 pET30-st邵cA鏈霉親和素基因和別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中 能表達得到鏈霉親和素和別藻藍蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標記的脫 輔基蛋白別藻藍蛋白A。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893,通過全基因合成得到。 (3)將藻藍膽素生物合成酶基因(力o7和pcW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得質粒叫pACYCDuet-力o7-; cyA在大腸桿菌中能同時表達恥l和PcyA。即脫輔基蛋白基因邵"在pET30中是在AcoRV和J力o I兩個酶切位點之間，鏈霉親 和素基因ss在1和^^JII兩個酶切位點之間；裂合酶基因Wt^^9在pCDFDuet中， 處于第二個多克隆位點，酶切位點是Afafe I和Z力o I ; PCB合成酶基因是2個(力o/和pc州)， 它們在同一個載體pACYCDuet-1中，力o 處于第一個多克隆位點，在Afco I和尸st I之間， pc/力在第二個多克隆位點，在I和J力o I之間。基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(4)將pCDFDuet- pET30-sa-apc力和pACYCDuet-力o7-p《W轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養 基中，37。C振蕩培養至0D朋。為0. 5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l畫ol/L， 20。C至37。C振蕩表達約12小 時，生產鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質藻藍膽素-別藻藍蛋白A;離心收集 菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到 相應的鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質藻藍膽素-別藻藍蛋白A。將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。實施例16(1)從GeneBank中可以査到，藻種j朋6ae朋sp. PCC7120和5y/7ec力oc^"'ssp. PCC 6803的全序列已經測定完成；勘a6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號為BA000019， 5y/ ec/ ocys"'s sp. PCC 6803在GeneBank中編號為BA000022,可從全序列中找到所需 基因；通過基因工程方法，將5y/ ec/wc/5"s sp. PCC 6803中的W/^似^基因克隆于 Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質粒叫pCDFDuet- Wr^似義在大腸桿菌中能表達 beta裂合酶。根據GeneBank中査到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相 應質粒中同樣的酶切位點上。(2)將5>/7ec/ oc/"A sp.PCC 6803中的別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因apc^和鏈霉 親和素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達載體pET30中，所得質粒叫 pET30-st鄰M，鏈霉親和素基因和別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中 能表達得到鏈霉親和素和別藻藍蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標記的脫 輔基蛋白別藻藍蛋白B。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。 (3)將藻藍膽素生物合成酶基因(力o/和pc^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得質粒叫pACYCDuet-力o7-/7C/A在大腸桿菌中能同時表達H01和PcyA。即脫輔基蛋白基因邵^9在pET30中是在fcoRV和兩個酶切位點之間，鏈霉親 和素基因幼在1和兩個酶切位點之間；裂合酶基因W/^似^在pCDFDuet中， 處于第二個多克隆位點，酶切位點是M/e I和J力o I ; PCB合成酶基因是2個(力W和pcj^)， 他們在同一個載體pACYCDuet-1中，力o7處于第一個多克隆位點，在/Vco I和尸"I之間，
在第二個多克隆位點，在;Vofe I和J力o I之間。基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總副A作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(4)將pCDFDuet- Wr^似從pET30-wa/ c萬和pACYCDuet-力o卜pcj^轉入大腸桿菌， 當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養 基中，37。C振蕩培養至0D,為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表達約12小 時，生產鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質藻藍膽素-別藻藍蛋白B:離心收集菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Nr親和層析，可提純得到相應的鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質藻藍膽素-別藻藍蛋白B。 將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。 實施例17(1)從GeneBank中可以査到，藻種勘a6ae朋sp. PCC7120和5>/7ec/ oc;^^5 sp. PCC 6803的全序列已經測定完成；」/7a/ ae朋sp.PCC7120在GeneBank中編號為BA000019， 5)77ec力oc;^tk sp. PCC 6803在GeneBank中編號為BA000022，可從全序列中找到所需 基因；通過基因工程方法，將5y/7ec/ oc/"A sp. PCC 6803中的sZr^^9基因克隆于 Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質粒叫pCDFDuet- Wr^似乂在大腸桿菌中能表達 beta裂合酶。根據GeneBank中査到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相 應質粒中同樣的酶切位點上。(2)將5y/7ec力oc/"A sp.PCC 6803中的別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因a; cZ 和鏈霉 親和素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達載體pET30中，所得質粒叫 pET30-s^apcZ ,鏈霉親和素基因和別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中 能表達得到鏈霉親和素和別藻藍蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標記的脫 輔基蛋白別藻藍蛋白D。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。 (3)將藻藍膽素生物合成酶基因(力o7和pc州)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l
中，所得質粒叫pACYCDuet-/ o7-在大腸桿菌中能同時表達HOI和PcyA。即脫輔基蛋白基因邵c"在pET30中是在化oRV和Wol兩個酶切位點之間，鏈霉親 和素基因sa在和《WII兩個酶切位點之間；裂合酶基因sZ^似9在pCDFDuet中， 處于第二個多克隆位點，酶切位點是〃& I和J力o I ; PCB合成酶基因是2個(力o7和pcW), 他們在同一個載體pACYCDuet-1中，力o 處于第一個多克隆位點，在Afco I和尸W I之間， Z cW在第二個多克隆位點，在/We I和I力o I之間。基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(4)將pCDFDuet- s7r^似9、 pET30-幼-apci 和pACYCDuet-/ o卜/)0^轉入大腸桿菌， 當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養 基中，37'C振蕩培養至0D印。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(is叩rophyl thiof D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為1圓1/L， 20。C至37。C振蕩表達約12小 時，生產鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質藻藍膽素-別藻藍蛋白D;離心收集 菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到 相應的鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質藻藍膽素-別藻藍蛋白D。將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。實施例18(1)從GeneBank中可以査到，藻種力/ a/ ae/7a sp. PCC7120和5yy ec/ ocy"is sp. PCC 6803的全序列已經測定完成；力朋力ae朋印.PCC7120在GeneBank中編號為BA000019， 5>/ ec/ oc_K"is sp. PCC 6803在GeneBank中編號為BA000022，可從全序列中找到所需 基因；通過基因工程方法，將5y"ec力oc7ssp. PCC 6803中的^ri^必基因克隆于 Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質粒叫pCDFDuet- Wi^似9，在大腸桿菌中能表達 beta裂合酶。根據GeneBank中査到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相 應質粒中同樣的酶切位點上。(2)將5)77ec力ocj^^s sp.PCC 6803中的別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因spc尸和鏈霉 親和素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達載體pET30中，所得質粒叫
pET30-sapcF，鏈霉親和素基因和別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中 能表達得到鏈霉親和素和別藻藍蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標記的脫 輔基蛋白別藻藍蛋白F。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因(Z o7和pc/力)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得質粒叫pACYCDuet-力W-/ 《W，在大腸桿菌中能同時表達H01和PcyA。即脫輔基蛋白基因鄰c尸在pET30中是在化oRV和J/w I兩個酶切位點之間，鏈霉親 和素基因sa在A>/71和^^n兩個酶切位點之間；裂合酶基因sZr^^^在pCDFDuet中， 處于第二個多克隆位點，酶切位點是AWe I和屈o I ;PCB合成酶基因是2個(力W和pc州)， 他們在同一個載體pACYCDuet-l中，Zw7處于第一個多克隆位點，在vVco I和尸W I之間， pcy力在第二個多克隆位點，在Afafe I和J力o I之間。基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(4) 將pCDFDuet- Wr^ 必、pET30-sa-邵oP和pACYCDuet-力o卜pcW轉入大腸桿菌， 當這些質粒都轉入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養 基中，37。C振蕩培養至0D咖為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l咖ol/L， 20。C至37。C振蕩表達約12小 時，生產鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質藻藍膽素-別藻藍蛋白F;離心收集 菌體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過附2+親和層析，可提純得到 相應的鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質藻藍膽素-別藻藍蛋白F。將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例相同。 上述制備方法適用于采用各種藍藻中的beta裂合酶、別藻藍蛋白類脫輔基蛋白、藻藍膽素生物合成酶基因或其同源基因以及鏈霉親和素基因來制備鏈霉親和素標記的別藻 藍蛋白類熒光蛋白質，但涉及到微生物菌種公開的問題，本發明只選用了GenBank中己公 開全序列的藍藻力朋/ 朋朋sp. PCC7120和6y朋c力oc/"is sp. PCC 6803為例對本發明方 法加以說明，本領域的技術人員可以根據上述公開的內容采用其它原料實施本發明。
權利要求
1. 一種制備鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質的方法，其特征在于它包括以下步驟(1)將beta裂合酶基因或其同源基因克隆于表達載體中，得到beta裂合酶表達質粒；(2)將鏈霉親和素基因和別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因或其同源基因克隆于第二個表達載體中，得到鏈霉親和素標記的脫輔基蛋白表達質粒；(3)將藻藍膽素生物合成酶基因(hol和pcyA)或其同源基因克隆于第三個表達載體中，得到藻藍膽素合成質粒；(4)將beta裂合酶表達質粒、鏈霉親和素標記的脫輔基蛋白表達質粒和藻藍膽素生物合成酶質粒依次轉入配套的宿主菌；當這些表達質粒都轉入宿主菌后，得到相應的工程菌，將此工程菌發酵后，按常規蛋白質提純技術，提純得到相應的鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的宿主菌為大腸桿菌。
3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述的beta裂合酶基因是指與X/^tewa sp. PCC7120中a7^^77基因或6y/ ec/ oc7"is sp. PCC 6803中sZri^必基因同源的基 因。
4. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因 是指與^7a6ae朋sp. PCC7120或5)77ec/wc/"is sp. PCC 6803中別藻藍蛋白基因同源的 基因。
全文摘要
本發明公開了一種制備鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質的方法，通過應用藻膽蛋白beta裂合酶催化藻藍膽素與鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類脫輔基蛋白共價結合，制備鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質；本發明的方法應用生物過程生產鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質，是一種環境友好的生產方法；鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白類熒光蛋白質能應用于生物學和醫藥功能材料領域，特別是應用為生物學和醫學檢測領域的熒光探針。
文檔編號C12N1/21GK101397555SQ20071003055
公開日2009年4月1日 申請日期2007年9月27日 優先權日2007年9月27日
發明者佟順剛, 坤 夏 申請人:廣州天寶頌原生物科技開發有限公司