專利名稱：滇桂艾納香藥材的快速繁殖方法
技術領域：
本發明涉及一種通過組織培養技術的植物再生方法，尤其是一種專用于滇桂艾納香快速繁殖及栽培的方法。
背景技術：
滇桂艾納香經專家鑒定為菊科艾納香屬植物Bloumea megacephala(Randeria)Chang et Tseng，又名華艾納香、管芽，是廣西桂西制藥有限公司主打產品滇桂艾納香顆粒的主要原料，全草入藥，產品具有活血化瘀、止血調經的作用，用于治療瘀血阻滯，月經過多，經期過長，產后惡露不絕等婦科血癥治療總有效率達96％以上，產品年銷售收入超6000萬元，是一種經濟價值極高的植物。
滇桂艾納香藥材對生長環境要求苛刻，適于在冬季≥-2℃，夏季≤35℃，溫暖，雨水充沛的亞熱帶區域生長，喜陰喜濕，忌過強光照，栽培相當困難，迄今為止民間未有栽培歷史。自1994年滇桂艾納香顆粒藥劑批量生產以來，滇桂艾納香藥材原料來源于野生的藥材資源，年需求量達2000噸以上。經過多年的采掘，野生藥材資源已逐步減少，而且藥材的質量不穩定，不能滿足已擴大的生產需求，需要進行大面積的人工栽培作為藥材原料的來源。目前，野生滇桂艾納香主要通過種子繁殖，由于該藥材的種子胚組織發育不良，兼受季節、生長環境等因素的影響，種子的繁殖率低，發芽率低于5％，不能滿足大面積人工栽培的需要；此外，由于是有性雜交繁殖，因而使后代產生遺傳變異，造成質量不穩定，不利于藥品生產過程的質量控制。通過種子繁殖法進行育種，繁殖速度慢，成活率低，難以滿足大規模種植的要求，因此急需繁殖率高，速度快的的繁殖方法進行種苗生產。
經檢索，迄今為止，國內未見有關于滇桂艾納香相關育種及栽培研究的報道，國外也無相關的研究記錄。
發明內容
本發明的目的是提供一種滇桂艾納香組培苗繁殖的有效方法，增殖培養形成的種苗可直接用于大田種植，生產滇桂艾納香藥材，速度快，效果好，成活率高。
在本發明中，我們采用了植物組織細胞繁殖法和扦插繁殖法進行人工繁殖，屬于無性繁殖，得到的藥材遺傳相對穩定，再配合統一、規范的栽培技術，生產出的藥材質量穩定，符合藥品生產企業的要求。經研究，該藥材通過扦插的方式繁殖，經處理后，發芽率可達到70～80％，移栽成活率可達90％；采用植物細胞組織培養的方法，可在短時間內使滇桂艾納香組培苗增殖迅速，其繁殖系數能達到4.0～6.0，移栽成活率也可達90％以上。通過以上兩種方法進行育苗，不但可以獲得大量的種苗，而且種苗移栽后，生長迅速，成活率高。
本發明所提供的滇桂艾納香藥材的繁殖方法有2種，分別為植物組織細胞培養繁殖法和扦插繁殖法。
將從野外采集的滇桂艾納香外植體，其中包括滇桂艾納香的莖尖、嫩莖、老莖、葉片、花苞、種子，將各部位洗凈滅菌，通過植物細胞組織培養快速繁殖法和扦插繁殖法使滇桂艾納香迅速增殖，培育種苗，所獲得的種苗直接用于大田生產。
1、植物組織細胞培養繁殖法植物細胞組織培養快速繁殖法是將從野外采集的滇桂艾納香外植體，其中包括滇桂艾納香的莖尖、嫩莖、老莖、葉片、花苞、種子各部位洗凈滅菌，洗凈滅菌，切取適當規格的外植體接種于添加了植物激素和糖類的培養基上，進行愈傷組織的誘導、試管苗的誘導、試管苗的快速增殖培養、試管苗的壯苗培養、試管苗的生根培養，最后進行煉苗移栽，獲得試管種苗。
植物細胞組織培養快速繁殖法所用的培養基為MS培養基，植物激素為BA、NAA、Met、KT、2，4-D其中的一種或多種激素聯合使用，糖類為蔗糖，瓊脂含量為3～7g/L，pH值4～7，各階段培養條件為溫度25～28℃，光照1000～1200Lux，光照時間為10～12h/d。
具體操作步驟如下(1)愈傷組織的誘導從野外取來的外植體經過消毒滅菌后，接種于MS+BA1.0～2.0mg/L+NAA0.1～0.5mg/L+蔗糖2～3％(質量百分比，以下同)，暗培養15～25天后誘導出愈傷組織；(2)愈傷組織的分化將誘導出的愈傷組織轉入分化培養基MS+KT1.0～3.0mg/L+BA1.0～2.0mg/L+NAA0.1～0.5mg/L+蔗糖2～3％，20～30天后愈傷組織開始分化出小芽；(3)試管苗的繼代增殖將試管苗轉入MS+BA0.5～2.0mg/L+NAA0.1～1.0mg/L+Met0.5～2.0mg/L+蔗糖2～3％增殖培養基上，接種后25～30天從幼芽基部逐漸萌發叢生芽，繼代增殖；(4)試管苗的壯苗將增殖培養的試管苗剪分后接到MS+BA0.5～4.0mg/L+NAA0.5～4.0mg/L+Met0.5～2.0mg/L+蔗糖2～3％壯苗培養基上，接種后25～30天獲得健壯的試管苗；(5)試管苗的生根將壯苗培養后的無菌苗接種于MS+NAA0.1～0.5mg/L+蔗糖2～3％生根培養基上，接種后25～30天，從苗的基部長出根，成為完整植株。
(6)上述各培養基中瓊脂含量為5g/L，pH值5.8，各階段培養條件為除了愈傷組織的誘導為暗培養，其余各階段培養為光培養，培養溫度為25～28℃，光照1000～1200Lux，光照時間為10～12h/d。
2、扦插繁殖法扦插繁殖方法是將從野外采集的滇桂艾納香壯枝，截取適當的長度(15～40cm)，進行誘導生根的浸泡處理，然后進行扦插，獲得無性繁殖的種苗。
扦插繁殖方法所用的植物激素為NAA，IAA，IBA其中的一種或多種激素聯合使用。
具體操作步驟如下(1)壯枝的選取將從野外采回的滇桂艾納香枝條，選取直徑為0.25～0.5cm的枝條，截成15～30cm小段。
(2)扦插前的處理將截取的枝條洗凈，在由NAA，IAA，IBA配置成的溶液中浸泡4～8小時，溶液中NAA，IAA，IBA濃度各為0.5～2.5mg/L。
(3)扦插育苗將處理好的枝條插于沙池中，遮陽保濕培養，2周左右在枝條的葉柄基部位置長出嫩芽，繼續培養4周左右長出新根，移栽成活率達90％以上。
本發明具有如下優點1.本發明主要利用滇桂艾納香的莖尖、莖段、葉片、花苞作為外植體進行組織培養，比較全面系統地探索出一套對滇桂艾納香快速繁殖的最佳培養體系。
2.繁殖速度快，繁殖系數達到4.0～6.0。
3.周期短，一個周期大約2～3個月。
4.移栽成活率高，組培苗地移栽成活率都達到了90％以上。
5.操作方法簡單，只需要簡單的設施，成本低。利用本發明，其移栽的試管苗可直接用于大田生產。全年皆可進行操作。
6.通過以上植物組織培養技術獲得的種苗，遺傳特性穩定，不會發生變異，適用于商業化生產。
7.本發明所提供的快速繁殖方法及栽培技術適用于各種類型滇桂艾納香品種。
具體實施例方式
實施例1①愈傷組織的誘導將滅菌處理后的外植體不同部位接入誘導培養基中，外植體剪取的莖尖約長2cm、嫩莖約長3.5cm、老莖約長3.5cm、葉片大小為1.0×0.6cm2、花苞長度約為1.0cm。外植體接種數量視不同外植體部位而定，一般莖尖為3個/瓶，嫩莖為4段/瓶，老莖為4段/瓶，葉片為10塊/瓶，花苞為10個/瓶。誘導培養基的配方為MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖2.0％+瓊脂粉0.5％，(其中MS培養基為通用的基本培養基，本發明選用植物激素市場亦有售，2.4-D、NAA為中國醫藥(集團)上海化學試劑公司生產，6-BA、KT、IBA為Sanland international Inc.生產，IAA為上海生工生物工程有限公司，Met為北京振泰創業科技發展中心生產)培養條件為暗培養，15天后外植體誘導出愈傷組織，愈傷組織的誘導率最高可達93％。
②愈傷組織的分化當愈傷組織長到1.0×0.5cm2大小時，剪取愈傷組織接種于分化培養基，分化培養基為MS+KT1.0mg/L+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖2.0％+瓊脂粉0.5％，培養條件為，溫度為25～28℃，pH值5.8，光照1000～1200Lux，光照時間為10～12h/d，25天后愈傷組織分化出小芽。
③試管苗的繼代增殖當滇桂艾納香的試管苗長到1.5cm時，剪取芽體轉入MS+BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+Met0.5mg/L+蔗糖2.0％+瓊脂粉0.5％的增殖培養基上，培養條件同前，接種后30天從幼芽基部逐漸萌發叢生芽，平均每個幼芽可分化7～8株左右，再將幼芽剪下轉入相同的培養基重復培養，大量繁殖。
④試管苗的壯苗將增殖培養的試管苗剪后接到MS+BA4.0mg/L+NAA4.0mg/L+Met2.0mg/L+蔗糖3.0％+瓊脂粉0.5％壯苗培養基上，培養條件同前，接種后25天獲得健壯的試管苗；⑤試管苗的生根將壯苗培養后的無菌苗接種于MS+NAA0.5mg/L+蔗糖3.0％+瓊脂粉0.5％生根培養基上，培養條件同前，接種后25天，從苗的基部長出淺綠色或白色的不定根，長且多，生根率達到100％。
⑥煉苗移栽將生長勢較旺盛的組培苗從培養室取出，放置于煉苗室中，室內溫度保持在25℃左右，相對濕度保持在75％左右，避免陽光直射，在室溫下放置5～7天后，將培養瓶蓋打開進行2～3天煉苗，然后取出小苗，洗凈粘在根部的培養基，移栽到裝有滅菌基質的營養缽中，澆足水，時時保持基質的濕度，放置于遮陽篷下培養，溫度保持在26℃左右。每周澆一次營養液，15天左右長出新根，成活率達到90％以上。
實施例2①無菌苗的誘導將經過滅菌處理的滇桂艾納香莖段接種到誘導培養基上，誘導培養基配方為MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖2.5％+瓊脂粉0.5％，培養條件為，溫度為25～28℃，pH值5.8，光照1000～1200Lux，光照時間為10～12h/d，30天后從莖段的腋芽處分化出小芽。
②試管苗的繼代增殖當滇桂艾納香的試管苗長到1.5cm時，剪取芽體轉入MS+BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+Met1.0mg/L+蔗糖2.5％+瓊脂粉0.5％的增殖培養基上，培養條件同前，接種后20天從幼芽基部逐漸萌發叢生芽，平均每個幼芽可分化7～8株左右，再將幼芽剪下轉入相同的培養基重復培養，大量繁殖。
③試管苗的壯苗將增殖培養的試管苗剪后接到MS+BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L+Met1.5mg/L+蔗糖2.5％+瓊脂粉0.5％壯苗培養基上，培養條件同前，接種后20天獲得健壯的試管苗；④試管苗的生根將壯苗培養后的無菌苗接種于MS+NAA0.2mg/L+蔗糖2.5％生根培養基上，培養條件同前，接種后20天，從苗的基部長出淺綠色或白色的不定根，長且多，生根率達到100％。
⑤煉苗移栽將生長勢較旺盛的組培苗從培養室取出，放置于煉苗室中，室內溫度保持在25℃左右，相對濕度保持在75％左右，避免陽光直射，在室溫下放置5～7天后，將培養瓶蓋打開進行2～3天煉苗，然后取出小苗，洗凈粘在根部的培養基，移栽到裝有滅菌基質的營養缽中，澆足水，時時保持基質的濕度，放置于遮陽篷下培養，溫度保持在26℃左右。每周澆一次營養液，15天左右長出新根，成活率達到90％以上。
實施例3①壯枝的選取將從野外采回的滇桂艾納香枝條，選取直徑為0.25～0.5cm的枝條，截成15～40cm小段。
②扦插前的處理將截取的枝條洗凈，在由NAA，IAA，IBA配置成的溶液中浸泡5小時，溶液中NAA，IAA，IBA濃度各為0.5～2.5mg/L。
③扦插育苗將處理好的枝條插于沙池中，遮陽保濕培養，2周左右在枝條的葉柄基部位置長出嫩芽，繼續培養4周左右長出新根，移栽成活率達90％以上。
權利要求
1.一種滇桂艾納香藥材的快速繁殖方法，其特征在于將從野外采集的滇桂艾納香外植體，其中包括滇桂艾納香的莖尖、嫩莖、老莖、葉片、花苞、種子，將各部位洗凈滅菌，通過植物細胞組織培養快速繁殖法和扦插繁殖法使滇桂艾納香迅速增殖，培育種苗，所獲得的種苗直接用于大田生產。
2.根據權利要求1所述的滇桂艾納香藥材的快速繁殖方法，其特征在于所述的植物細胞組織培養快速繁殖法是將從野外采集的滇桂艾納香外植體，其中包括滇桂艾納香的莖尖、嫩莖、老莖、葉片、花苞、種子各部位洗凈滅菌，洗凈滅菌，切取外植體接種于添加了植物激素和糖類的培養基上，進行愈傷組織的誘導、試管苗的誘導、試管苗的快速增殖培養、試管苗的壯苗培養、試管苗的生根培養，最后進行煉苗移栽，獲得試管種苗。
3.根據權利要求2所述的滇桂艾納香藥材的快速繁殖方法，其特征在于植物細胞組織培養快速繁殖法所用的培養基為MS培養基，植物激素為BA、NAA、Met、KT、2，4-D其中的一種或多種激素聯合使用，糖類為蔗糖，瓊脂含量為3～7g/L，pH值4～7，各階段培養條件為溫度25～28℃，光照1000～1200Lux，光照時間為10～12h/d。
4.根據權利要求1所述的滇桂艾納香藥材的快速繁殖方法，其特征在于所述的扦插繁殖方法是將從野外采集的滇桂艾納香壯枝，截取15～40cm的小段，進行誘導生根的浸泡處理，然后進行扦插，獲得無性繁殖的種苗。
5.根據權利要求3所述的滇桂艾納香藥材的快速繁殖方法，其特征在于扦插繁殖方法所用的植物激素為NAA，IAA，IBA其中的一種或多種激素聯合使用。
全文摘要
本發明提供了一種滇桂艾納香藥材的快速繁殖方法，將從野外采集的滇桂艾納香外植體，其中包括滇桂艾納香的莖尖、嫩莖、老莖、葉片、花苞、種子，將各部位洗凈滅菌，通過植物細胞組織培養快速繁殖法和扦插繁殖法使滇桂艾納香迅速增殖，培育種苗，所獲得的種苗直接用于大田生產。本方法繁殖速度快，周期短，一個周期大約2～3個月。移栽成活率高，組培苗地移栽成活率都達到了90％以上。操作方法簡單，只需要簡單的設施，成本低，全年皆可進行操作。通過以上植物組織培養技術獲得的種苗，遺傳特性穩定，不會發生變異，適用于商業化生產。
文檔編號C12N5/04GK101040602SQ20071003489
公開日2007年9月26日 申請日期2007年4月25日 優先權日2007年4月25日
發明者包國慶, 韋鵬霄, 岑秀芬, 陳卓, 張明珍 申請人:廣西桂西制藥有限公司