專利名稱：生產二羥基丙酮的基因工程菌,其構建方法及其用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及生產二羥基丙酮的基因工程菌，其構建方法及其用途。
背景技術：
1，3-二羥基丙酮(1，3-Dihydroxyacetone，簡稱DHA)是最簡單的酮糖，呈白色晶體，易溶于水，以及乙醇、丙酮等有機溶劑。DHA是一種重要的化工原料、醫藥中間體和食品添加劑，在國外已得到廣泛的實際應用。1，3-二羥基丙酮衍生物是有機合成化學中一類非常重要的中間體，其用途極其廣泛可用于羥醛縮合反應制取各種手性化合物；經生物或化學法還原可得到具有光學活性的仲醇；直接用于光化學反應中的Diels-Alder加成反應制備糖類化合物或經進一步反應用于該類加成反應；與2，2-二烷氧基環丙烷衍生物作用制備內酯；用于制備一些橋環化合物進而開環得到眾多有用的環狀化合物。此外，以1，3-二羥基丙酮衍生物為中間體合成的一些化合物表現出一定的抗病毒活性。
微生物轉化甘油生產二羥基丙酮的機理是利用微生物代謝產生的甘油脫氫酶作用，使甘油分子結構中2位C上的羥基進行脫氫反應，生成1，-二羥基丙酮。反應過程中需要附酶NAD+的參與，NAD+生成NADH。國外用微生物法轉化甘油為二羥基丙酮已有很多專利和文獻報道，用于生產二羥基丙酮的微生物主要是醋桿菌屬(Acetobacter)(US4076589)和葡萄糖桿菌屬(Gluconobacter)(US5770411)，尤其是氧化葡萄糖桿菌(Gluconobacter oxydans)和弱氧化醋酸桿菌(Acebobacter Suboxydans)的報道居多，此外還有芽孢桿菌屬(Bacillus)、單孢絲菌屬(Micromonospora)、沙雷氏菌屬(Serratia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)(US4576913)等。國內報道的微生物法生產二羥基丙酮所用的菌種為弱氧化醋酸桿菌、葡萄糖酸桿菌和氧化葡萄糖桿菌。
生物轉化法生產DHA與過去化學合成法相比具有專一性強、反應條件溫和、底物利用率高、轉化率高、生產工藝簡單和副產物少等優點。
但現有的微生物轉化甘油生產二羥基丙酮中所使用的微生物均為野生菌，尚無利用基因工程菌轉化甘油生產二羥基丙酮的報道。
發明內容
本發明的目的是提供一種新的可將甘油轉化為二羥基丙酮的基因工程菌株，其構建方法及其用途。
本發明的思路是通過酶催化耦合催化附酶再生法提高微生物細胞生物轉化甘油生產二羥基丙酮的轉化效率。酶耦合催化附酶再生方法是利用NADH脫氫酶基因ndh表達產物NADH脫氫酶使甘油生成二羥基丙酮過程中所產生的附酶NADH(還原型附酶I)脫氫生成NAD+(氧化型附酶I)，從而繼續為甘油生成二羥基丙酮過程提供附酶NAD+。
本發明所用到的原料是一種廣泛應用于工業生產的化學品甘油(丙三醇)，甘油2位羥基經過微生物細胞甘油脫氫酶作用，生成酮基，得到二羥基丙酮。生物轉化甘油生成二羥基丙酮的反應示意圖參見圖1。
本發明一方面提供了一種生產二羥基丙酮的基因工程菌株，為用重組基因工程質粒pET-gdh和pET-ndh轉化的大腸桿菌。
pET-gdh即為含有編碼甘油脫氫酶基因的pET重組基因工程質粒，該質粒轉化表達載體后，表達蛋白具有甘油脫氫酶活性。
pET-ndh即為含有編碼NADH脫氫酶基因的pET重組基因工程質粒，該質粒轉化表達載體后，表達蛋白具有NADH脫氫酶活性。
優選的上述大腸桿菌選自BL21、JM109、DH5a、TOP10、HB101或BLR之一。BL21、JM109、DH5a、TOP10、HB101或BLR將兩個質粒分別或共同轉入后，獲得基因工程菌BL21/gdh+ndh或JM109/gdh+ndh、DH5a/gdh+ndh、TOP10/gdh+ndh、HB101/gdh+ndh、BLR/gdh+ndh。
優選的，重組基因工程質粒pET-gdh含SEQ ID NO1的核苷酸序列atgccgcatttggcactactcatctctaaaggagcaattatggaccgcattattcaatcaccgggtaaatacatccagggcgctgatgtgattaatcgtctgggcgaatacctgaagccgctggcagaacgctggttagtggtgggtgacaaatttgttttaggttttgctcaatccactgtcgagaaaagctttaaagatgctggactggtagtagaaattgcgccgtttggcggtgaatgttcgcaaaatgagatcgaccgtctgcgtggcatcgcggagactgcgcagtgtggcgcaattctcggtatcggtggcggaaaaaccctcgatactgccaaagcactggcacatttcatgggtgttccggtagcgatcgcaccgactatcgcctctaccgatgcaccgtgcagcgcattgtctgttatctacaccgatgagggtgagtttgaccgctatctgctgttgccaaataacccgaatatggtcattgtcgacaccaaaatcgtcgctggcgcacctgcacgtctgttagcggcgggtatcggcgatgcgctggcaacctggtttgaagcgcgtgcctgctctcgtagcggcgcg
accaccatggcgggcggcaagtgcacccaggctgcgctggcactggctgaactgtgctacaacaccctgctggaagaaggcgaaaaagcgatgcttgctgccgaacagcatgtagtgactccggcgctggagcgcgtgattgaagcgaacacctatttgagcggtgttggttttgaaagtggtggtctggctgcggcgcacgcagtgcataacggcctgaccgctatcccggacgcgcatcactattatcacggtgaaaaagtggcattcggtacgctgacgcagctggttctggaaaacgcgccggtggaggaaatcgaaaccgtagctgcgcttagccatgcggtaggtttgccaataactctcgctcaactggatattaaagaagatgtcccggcgaaaatgcgaattgtggcagaagcggcatgtgcagaaggtgaaaccatccacaacatgcctggcggcgcgacgccagatcaggtttacgccgctctgctggtagccgaccagtacggtcagcgtttcctgcaagagtgggaataa該序列來源于克雷伯氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)，編碼甘油脫氫酶。本發明的pET-gdh包括但不僅限于克雷伯氏肺炎桿菌的甘油脫氫酶編碼基因，根據本發明的教導，結合現有技術，本技術領域的人員可獲得來源于其它菌種(如大腸桿菌(Escherichia coli)、志賀菌(Shigella)、沙門氏菌(Salmonella)、醋桿菌(Acetobacter)、葡萄糖桿菌(Gluconobacter))甘油脫氫酶編碼基因的重組基因工程質粒pET-gdh，用以表達具有甘油脫氫酶活性的蛋白。
優選的，重組基因工程質粒pET-ndh含有SEQ ID NO2的核苷酸序列ttgactacgccattgaaaaagattgtgattgtcggcggcggtgctggtgggctggaaatggcaacacagctggggcataagctgggacgcaagaaaaaagccaaaattacgctggtcgatcgtaaccacagccacctgtggaaaccgctgctgcacgaagtggcgactggctcgcttgatgaaggcgtcgatgcgttgagctatctggcccatgcgcgcaatcatggtttccagttccagctgggttccgtcattgatattgatcgtgaagcgaaaacaatcactattgcagaactgcgcgacgagaaaggtgaactgctggttccggaacgtaaaatcgcctatgacaccctggtaatggcgctgggtagcacctctaacgatttcaatacgccaggtgtcaaagagaactgcattttcctcgataacccgcaccaggcgcgtcgcttccaccaggagatgctgaatttgttcctgaaatactccgccaacctgggcgcgaatggcaaagtgaacattgcgattgtcggcggcggcgcgacgggtgtagaactctccgctgaattgcacaacgcggtcaagcaactgcacagctacggttacaaaggcctgaccaacgaagccctgaacgtaacgctggtagaagcgggagaacgtattttgcctgcgttaccgccacgtatctctgctgcggcccacaacgagctaacgaaacttggcgttcgcgtgctgacgcaaaccatggtcaccagtgctgatgaaggcggcctgcacactaaagatggcgaatatattgaggctgatctgatggtatgggcagccgggatcaaagcgccagacttcctgaaagatatcggtggtcttgaaactaaccgtatcaaccagctggtggtggaaccgacgctgcaaaccacccgcgatccagacatttacgctattggcgactgcgcgtcatgcccgcgtccggaagggggctttgttccgccgcgtgctcaggctgcacaccagatggcgacttgcgcaatgaacaacattctggcgcagatgaacggtaagccgctgaaaaattatcagtataaagatcatggttcgctggtatcgctgtcgaacttctccaccgtcggt
agcctgatgggtaacctgacgcgcggctcaatgatgattgaaggacgaattgcgcgctttgtatatatctcgctataccgaatgcatcagattgcgctgcatggttactttaaaaccggattaatgatgctggtggggagtattaaccgcgttatccgtccgcgtttgaagttgcattaa該序列來源于克雷伯氏肺炎桿菌，編碼NADH脫氫酶。本發明的pET-ndh包括但不僅限于克雷伯氏肺炎桿菌的NADH脫氫酶編碼基因，根據本發明的教導，結合現有技術，本技術領域的人員可獲得來源于其它菌種(如大腸桿菌、志賀菌、沙門氏菌、醋桿菌)、葡萄糖桿菌)NADH脫氫酶編碼基因的重組基因工程質粒pET-gdh，用以表達具有NADH脫氫酶活性的蛋白。
本發明另一方面，提供了上述基因工程菌的構建方法，包括下列步驟a)以克雷伯氏肺炎桿菌、大腸桿菌、志賀菌、沙門氏菌、醋桿菌或葡萄糖桿菌基因組DNA為模板，PCR擴增獲得編碼甘油脫氫酶基因gdh，利用pET系列表達載體構建重組基因工程質粒pET-gdh；b)以克雷伯氏肺炎桿菌、大腸桿菌、志賀菌、沙門氏菌、醋桿菌或葡萄糖桿菌基因組DNA為模板，PCR擴增，獲得編碼NADH脫氫酶基因ndh，利用pET系列表達載體構建重組基因工程質粒pET-ndh；c)將pET-gdh和pET-ndh分別或共同轉入大腸桿菌。
較佳的，上述大腸桿菌選自BL21、JM109、DH5a、TOP10、HB101或BLR之一。
較佳的，上述PCR擴增所用的模板為克雷伯氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)基因組DNA。
優選的，上述PCR擴增編碼甘油脫氫酶基因gdh時所用的引物為Pgdh-1(sense primer)5’-CCGGAATTCATGCCGCATTTGGCACTACTC-3’(SEQ ID NO3)Pgdh-2(antisense primer)5’-CCGCTCGAGTTATTCCCACTCTTGCAGG-3’(SEQ IDNO4)；PCR擴增編碼NADH脫氫酶基因ndh時所用的引物為Pndh-1(sense primer)5’-CCGGAATTCATGACTACGCCATTGAAAAAGATTG-3’(SEQ IDNO5)Pndh-2(antisense primer)5’-CCCAAGCTTTTAATGCAACTTCAAACGCGGAC-3’(SEQ IDNO6)優選的，重組基因工程質粒pET-gdh含有SEQ ID NO1的核苷酸序列，重組基因工程質粒pET-ndh含有SEQ ID NO2的核苷酸序列。
本發明第三方面，公開了將上述基因工程菌用于生產二羥基丙酮。
本發明第四方面，公開了利用上述基因工程菌生產二羥基丙酮的方法，步驟如下a)其出發菌為上述基因工程菌；b)種子培養在搖瓶中進行，搖床轉速為100～300轉/分鐘，溫度為27～40℃，培養時間為9～30小時；c)發酵培養可在發酵罐中進行，發酵罐接種量為5％～20％(體積比)，培養基含甘油，攪拌槳轉速為100～400轉/分鐘，溫度為27～40℃，發酵方式可以是間歇發酵、批式流加發酵或連續發酵，間歇或批式流加發酵的時間為10～200小時；d)分離純化二羥基丙酮。
優選的，上述發酵培養過程中向發酵罐中通空氣，通氣量為0.2～4vvm。發酵方式為連續發酵時先進行間歇發酵，待發酵液中菌體達到一定密度時(如650nm下光密度為0.2～0.7)，一次或多次添加IPTG至終濃度為0.1～2.5mmol·L-1，同時流加發酵培養基(含甘油濃度為40％～99％(w/v))進行恒化培養，pH控制在4.5～7.5范圍內。
進一步優選的，步驟c)后還可以包括細胞催化步驟1)將發酵所得大腸桿菌離心分離；2)所得細胞重懸于Tris/HCl緩沖液中，優選20～80mM、pH4.0～8.0Tris/HCl緩沖液，加入CTAB(溴化十六烷基三甲銨，Cetyltrimethylammoniumbromide)至終濃度為0.01～1％(w/v)或SDS(十二烷基硫酸鈉，Sodium dodecyl sulphate)至0.1～3％(w/v)或丙酮至0.1～5％(w/v)或甲苯至0.1～5％(w/v)或氯仿至0.1～5％(w/v)，處理30～120分鐘；3)離心收集細胞，將收集到的細胞用pH4.0～8.0的磷酸鈉或磷酸鉀緩沖液洗滌1～2次，重懸于磷酸鈉或磷酸鉀緩沖液中，一次或多次加入甘油至終濃度為10～70％(w/v)，將該懸浮液置于轉速為50～300轉/分鐘，溫度為27～40℃條件下2～8小時；4)離心分離細胞，上清即為生物轉化得到的二羥基丙酮溶液，重復步驟2)-4)，循環2～15次。
本發明的方法獲得的二羥基丙酮的濃度可達到10～85g/L。
本發明中的重量體積比均為以克(g)為單位的重量除以以100毫升(100mL)為單位的體積獲得的百分比，例如1％即為100ml溶液中含1g。
上述種子培養或發酵培養過程中所用的培養基，必須具備微生物生長所需的營養成分，如葡萄糖或甘油等碳源，尿素、銨鹽、酵母浸膏或酵母粉等氮源以及磷酸鹽(磷源)和硫酸鹽(硫源)等。另外還需要鈉、鉀、鎂、鈣等陽離子以及鋅、鐵、錳、銅、鈷、硼和鉬等微量元素，每種微量元素的含量大約在0.01mg/L～50mg/L的范圍內。培養基須滅菌(如121℃下滅菌15～20分鐘)方能使用。
本發明與國內外二羥基丙酮的研究現狀相比創新之處在于，提供了一種全新的基因工程菌用于生產二羥基丙酮，利用NADH脫氫酶基因ndh表達產物NADH脫氫酶使甘油生成二羥基丙酮過程中所產生的附酶NADH(還原型附酶I)脫氫生成NAD+(氧化型附酶I)，從而繼續為甘油生成二羥基丙酮過程提供附酶，提高了二羥基丙酮的轉化率，并且細胞經過處理后可重復利用，簡化了生產工藝，提高了生產效率。本發明開辟了利用基因工程菌生產二羥基丙酮的先例，使得普通大腸桿菌具備了生物轉化甘油生產二羥基丙酮的功能，這為今后構建生產二羥基丙酮的基因工程菌提供了新的思路，也為進一步獲得更為優化的工程菌奠定了基礎。
圖1.甘油生成二羥基丙酮的反應示意圖具體實施方式
下面結合實施例進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明，而非限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法及未說明配方的試劑均為按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆試驗手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件或者制造商建議的條件進行或配置。BL21、JM109、DH5a、TOP10、HB101、BLR及pET28、pET32載體均購自Novagen公司，引物均由大連寶生物(Takara)公司合成。
實施例1工程菌構建(1)基因gdh的克隆和表達載體的構建根據甘油脫氫酶基因序列設計擴增gdh基因的PCR引物如下Pgdh-1(sense primer)5’-CCGGAATTCATGCCGCATTTGGCACTACTC-3’(SEQ ID NO3)Pgdh-2(antisense primer)5’-CCGCTCGAGTTATTCCCACTCTTGCAGG-3’(SEQ ID NO4)為了便于與表達載體的連接，引物Pgdh-1上引入EcoR I酶切位點；引物Pgdh-2上引入Xho I酶切位點。以克雷伯氏菌總DNA為模板完成以下PCR程序95℃ 5min；95℃ 50s，56℃ 30s，72℃ 110s完成25個循環；最后72℃延伸10min。PCR產物經1％的瓊脂糖電泳檢測，回收1.14kb的片斷，將回收片段經EcoR I、Xho I酶切，與同樣經EcoR I、Xho I酶切的pET28載體連接，得到重組質粒pET-gdh，酶切鑒定符合預期，克隆入的甘油脫氫酶基因序列為SEQ ID NO1。
(2)基因ndh的克隆和表達載體的構建根據NADH脫氫酶基因序列設計擴增ndh基因的PCR引物如下Pndh-1(sense primer)5’-CCGGAATTCATGACTACGCCATTGAAAAAGATTG-3’(SEQ IDNO5)Pndh-2(antisense primer)5’-CCCAAGCTTTTAATGCAACTTCAAACGCGGAC-3’(SEQ IDNO6)為了便于與表達載體的連接，引物Pndh-1上引入EcoR I酶切位點；引物Pndh-2上引入HindIII酶切位點。以克雷伯氏菌總DNA為模板完成以下PCR程序95℃ 5min；95℃ 50s，58℃ 30s，72℃ 110s完成25個循環；最后72℃延伸10min。PCR產物經1％的瓊脂糖電泳檢測，回收1.3kb的片斷，將回收片段經EcoR I、HindIII酶切，與同樣經EcoR I、HindIII酶切的pET32載體連接，得到重組質粒pET-ndh，酶切鑒定符合預期，克隆入的NADH脫氫酶基因序列為SEQ ID NO2。
(3)轉化將兩質粒常規方法分別轉化大腸桿菌BL21，獲得BL21/gdh及BL21/ndh。
將兩質粒按常規方法共同轉化大腸桿菌BL21，獲得二羥基丙酮生產工程菌BL21/gdh+ndh。
將兩質粒按常規方法共同轉化大腸桿菌JM109，獲得二羥基丙酮生產工程菌JM109/gdh+ndh。
實施例2工程菌表達產物鑒定1)將實施例1獲得的BL21/gdh接種入LB培養基，37℃培養至對數生長期，加入IPTG至終濃度1mmol·L-1，繼續培養5小時。離心收集菌體，超聲破菌，離心收集上清，用His-Tag親和柱純化得到了純化的甘油脫氫酶，SDS-PAGE電泳，在42kDa處得到清晰條帶，對應甘油脫氫酶，與預期相符。
2)將實施例1獲得的BL21/ndh接種入LB培養基，37℃培養至對數生長期，加入IPTG至終濃度1mmol·L-1，繼續培養5小時。離心收集菌體，超聲破菌，離心收集上清，用His-Tag親和柱純化得到了純化的NADH脫氫酶混合物，SDS-PAGE電泳，在48kDa處得到清晰條帶，對應NADH脫氫酶，與預期相符。
3)將實施例1獲得的BL21/gdh+ndh接種入LB培養基，37℃培養至對數生長期，加入IPTG至終濃度1mmol·L-1，繼續培養5小時。離心收集菌體，超聲破菌，離心收集上清，用His-Tag親和柱純化得到了純化的甘油脫氫酶和NADH脫氫酶混合物，SDS-PAGE電泳，在42kDa處和48kDa處得到清晰條帶，分別對應甘油脫氫酶和NADH脫氫酶，與預期相符。
4)將實施例1獲得的JM109/gdh+ndh接種入LB培養基，37℃培養至對數生長期，加入IPTG至終濃度1mmol·L-1，繼續培養5小時。離心收集菌體，超聲破菌，離心收集上清，用His-Tag親和柱純化得到了純化的甘油脫氫酶和NADH脫氫酶混合物，SDS-PAGE電泳，在42kDa處和48kDa處得到清晰條帶，分別對應甘油脫氫酶和NADH脫氫酶，與預期相符。
5)分別將步驟3)、4)獲得的純化的混合蛋白加入反應液催化反應，反應液中含有30mmol/L(NH4)2SO4溶液0.2mL、0.5mol/L甘油溶液0.8ml、20mmol/L NAD+溶液0.2ml、0.1mol/L碳酸鉀緩沖溶液0.8ml，其中甘油作為底物，37℃，100rpm下反應15min，產物經HPLC方法鑒定為二羥基丙酮，表明BL21/gdh+ndh及JM109/gdh+ndh表達的甘油脫氫酶和NADH脫氫酶混合物可以催化甘油生成二羥基丙酮。
實施例3利用BL21/gdh+ndh生產二羥基丙酮(1)菌種實施例1獲得的BL21/gdh+ndh。
(2)培養基種子培養基以g/l計，蛋白胨10，酵母膏5，氯化鈉10，氨芐青霉素0.2，卡那霉素0.05；發酵培養基以g/l計，甘油60g，KCl 0.75g，NaH2PO11.38g，(NH4)2SO45.35g，Na2SO10.28g，MgSO16H2O 0.26g，檸檬酸0.42g，酵母粉2g，微量元素各0.3mL；微量元素濃度ZnCl234.2g/L，FeCl36H2O 2.7g/L，MnCl24H2O 10g/L，CuCl22H2O 0.85g/L，CoCl22H2O 23.8g/L，H3BO30.31g/L，Na2MoO40.25g/L種子與發酵培養基均需在滅菌前調節pH為7.0。
(3)種子培養在500mL的三角瓶中進行，裝液量為200mL，搖床轉速為250轉/分鐘，溫度為37℃，培養時間為14小時。
(4)發酵培養在全自動發酵罐中進行，工作體積為5L，實際裝液量為3L，接種量為10％，攪拌轉速為300轉/分鐘，溫度為37℃。發酵過程中向發酵罐中通空氣，通氣量為2vvm。發酵方式是批式發酵，待發酵液中菌體達到一定密度時(650nm下光密度為0.4)，分兩次添加IPTG至終濃度為1mmol·L-1，用2mol/L氫氧化鈉調節pH控制在6.5～7.5范圍內，繼續培養8小時。
(5)常規方法分離純化獲得二羥基丙酮，發酵液中二羥基丙酮的濃度可達到30g/L，轉化率為50％。
實施例4利用JM109/gdh+ndh生產二羥基丙酮(1)菌種實施例1獲得的JM109/gdh+ndh。
(2)培養基種子培養基以g/l計，蛋白胨10，酵母膏5，氯化鈉10，氨芐青霉素0.2，卡那霉素0.05；發酵培養基以g/l計，甘油30g，KCl 0.75g，NaH2PO41.38g，(NH4)2SO45.35g，Na2SO10.28g，MgSO16H2O 0.26g，檸檬酸0.42g，酵母粉2g，微量元素各0.3mL；微量元素濃度ZnCl234.2g/L，FeCl36H2O 2.7g/L，MnCl24H2O 10g/L，CuCl22H2O 0.85g/L，CoCl22H2O 23.8g/L，H3BO30.31g/L，Na2MoO40.25g/L種子與發酵培養基均需在滅菌前調節pH為7.0。
(3)種子培養在500mL的三角瓶中進行，裝液量為200mL，搖床轉速為250轉/分鐘，溫度為37℃，培養時間為14小時。
(4)發酵培養在全自動發酵罐中進行，工作體積為5L，實際裝液量為3L，接種量為10％，攪拌轉速為300轉/分鐘，溫度為37℃。發酵過程中向發酵罐中通空氣，通氣量為2vvm。發酵方式是批式流加發酵，流加發酵的時間為15小時，連續發酵時先進行間歇發酵，待發酵液中菌體達到一定密度時(650nm下光密度為0.3)，分三次添加IPTG至終濃度為1mmol·L-1，同時流加發酵培養基(含甘油濃度為70％)進行恒化培養20小時，用2mol/L氫氧化鈉調節pH控制在6.5～7.5范圍內。
(5)常規方法分離純化獲得二羥基丙酮，發酵液中二羥基丙酮的濃度可達到50g/L。
實施例5利用JM109/gdh+ndh生產二羥基丙酮(1)菌種實施例1獲得的JM109/gdh+ndh。
(2)培養基種子培養基以g/l計，蛋白胨10，酵母膏5，氯化鈉10，氨芐青霉素0.1，卡那霉素0.05；發酵培養基以g/l計，甘油30g，KCl 0.75g，NaH2PO41.38g，(NH4)2SO45.35g，Na2SO10.28g，MgSO16H2O 0.26g，檸檬酸0.42g，酵母粉2g，微量元素各0.3mL；微量元素濃度ZnCl234.2g/L，FeCl36H2O 2.7g/L，MnCl24H2O 10g/L，CuCl22H2O 0.85g/L，CoCl22H2O 23.8g/L，H3BO30.31g/L，Na2MoO10.25g/L種子與發酵培養基均需在滅菌前調節pH為7.0。
(3)種子培養在500mL的三角瓶中進行，裝液量為200mL，搖床轉速為250轉/分鐘，溫度為37℃，培養時間為14小時。
(4)發酵培養在全自動發酵罐中進行，工作體積為5L，實際裝液量為3L，接種量為5％，攪拌轉速為300轉/分鐘，溫度為37℃。發酵過程中向發酵罐中通空氣，通氣量為2vvm。發酵方式是批式發酵，待發酵液中菌體達到一定密度時(650nm下光密度為0.5)，分三次添加IPTG至終濃度為1.5mmol·L-1，同時流加發酵培養基(含甘油濃度為80％)進行恒化培養20小時，用2mol/L氫氧化鈉調節pH控制在6.5～7.5范圍內。
(5)常規方法分離純化獲得二羥基丙酮，發酵液中二羥基丙酮的濃度可達到50g/L。
(6)細胞催化將(4)中發酵所得大腸桿菌細胞在10000×g、4℃條件下離心分離，所得細胞重懸于50mM、pH8.0 Tris/HCl緩沖液中，加入丙酮至1％(w/v)，將該懸浮液在轉速為150轉/分鐘，溫度為30℃條件下處理45分鐘，10000×g、4℃條件下收集細胞。將收集到的細胞用pH6.0的磷酸鈉或磷酸鉀緩沖液洗滌1～2次，重懸于pH6.0的磷酸鈉或磷酸鉀緩沖液中，分兩次加入甘油至終濃度為50％，將該懸浮液置于轉速為200轉/分鐘，溫度為37℃條件下5小時，10000×g、4℃條件下分離細胞，循環利用2～4次，上清為生物轉化得到的二羥基丙酮溶液，濃度為45％(w/v)。轉化率為90％。
序列表<110>華東理工大學<120>生產二羥基丙酮的基因工程菌，其構建方法及其用途<130>PCNHD070481<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1143<212>DNA<213>Klebsiella pneumoniae<400>1atgccgcatt tggcactact catctctaaa ggagcaatta tggaccgcat tattcaatca60ccgggtaaat acatccaggg cgctgatgtg attaatcgtc tgggcgaata cctgaagccg120ctggcagaac gctggttagt ggtgggtgac aaatttgttt taggttttgc tcaatccact180gtcgagaaaa gctttaaaga tgctggactg gtagtagaaa ttgcgccgtt tggcggtgaa240tgttcgcaaa atgagatcga ccgtctgcgt ggcatcgcgg agactgcgca gtgtggcgca300attctcggta tcggtggcgg aaaaaccctc gatactgcca aagcactggc acatttcatg360ggtgttccgg tagcgatcgc accgactatc gcctctaccg atgcaccgtg cagcgcattg420tctgttatct acaccgatga gggtgagttt gaccgctatc tgctgttgcc aaataacccg480aatatggtca ttgtcgacac caaaatcgtc gctggcgcac ctgcacgtct gttagcggcg540ggtatcggcg atgcgctggc aacctggttt gaagcgcgtg cctgctctcg tagcggcgcg600accaccatgg cgggcggcaa gtgcacccag gctgcgctgg cactggctga actgtgctac660aacaccctgc tggaagaagg cgaaaaagcg atgcttgctg ccgaacagca tgtagtgact720ccggcgctgg agcgcgtgat tgaagcgaac acctatttga gcggtgttgg ttttgaaagt780ggtggtctgg ctgcggcgca cgcagtgcat aacggcctga ccgctatccc ggacgcgcat840cactattatc acggtgaaaa agtggcattc ggtacgctga cgcagctggt tctggaaaac900gcgccggtgg aggaaatcga aaccgtagct gcgcttagcc atgcggtagg tttgccaata960actctcgctc aactggatat taaagaagat gtcccggcga aaatgcgaat tgtggcagaa1020gcggcatgtg cagaaggtga aaccatccac aacatgcctg gcggcgcgac gccagatcag1080
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<210>3<211>30<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>引物<400>3ccggaattca tgccgcattt ggcactactc30<210>4<211>28<212>DNA<213>artificial sequence<220>
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<223>引物<400>5ccggaattca tgactacgcc attgaaaaag attg 34<210>6<211>32
<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>引物<400>6cccaagcttt taatgcaact tcaaacgcgg ac 3權利要求
1.一種生產二羥基丙酮的基因工程菌株，其特征在于，該菌株為用重組基因工程質粒pET-gdh和pET-ndh轉化的大腸桿菌。
2.如權利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，其中大腸桿菌選自BL21、JM109、DH5a、TOP10、HB101或BLR之一。
3.如權利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，重組基因工程質粒pET-gdh含有SEQ IDNO1的核苷酸序列。
4.如權利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，重組基因工程質粒pET-ndh含有SEQ IDNO2的核苷酸序列。
5.如權利要求1一4中任一權利要求所述基因工程菌株的構建方法，包括下列步驟a)以克雷伯氏肺炎桿菌、大腸桿菌、志賀菌、沙門氏菌、醋桿菌或葡萄糖桿菌基因組DNA為模板，PCR擴增獲得編碼甘油脫氫酶基因gdh，利用pET系列表達載體構建重組基因工程質粒pET-gdh；b)以克雷伯氏肺炎桿菌或大腸桿菌、志賀菌、沙門氏菌、醋桿菌或葡萄糖桿菌基因組DNA為模板，PCR擴增，獲得編碼NADH脫氫酶基因ndh，利用pET系列表達載體構建重組基因工程質粒pET-ndh；c)將pET-gdh和pET-ndh分別或共同轉入大腸桿菌。
6.如權利要求5所述的構建方法，其特征在于，所述大腸桿菌選自BL21、JM109、DH5a、TOP10、HB101或BLR之一。
7.如權利要求5所述的構建方法，其特征在于，所述PCR擴增所用的模板為克雷伯氏肺炎桿菌基因組DNA。
8.如權利要求5或7所述的構建方法，其特征在于，其中PCR擴增編碼甘油脫氫酶基因gdh時所用的引物為Pgdh-15’-CCGGAATTCATGCCGCATTTGGCACTACTC-3’Pgdh-25’-CCGCTCGAGTTATTCCCACTCTTGCAGG-3’；PCR擴增編碼NADH脫氫酶基因ndh時所用的引物為Pndh-15’-CCGGAATTCATGACTACGCCATTGAAAAAGATTG-3’Pndh-25’-CCCAAGCTTTTAATGCAACTTCAAACGCGGAC-3’。
9.如權利要求5所述的構建方法，其特征在于，重組基因工程質粒pET-gdh含有SEQ ID NO1的核苷酸序列，重組基因工程質粒pET-ndh含有SEQ ID NO2的核苷酸序列。
10.如權利要求1-4中任一權利要求所述基因工程菌株用于生產二羥基丙酮。
11.用權利要求1-4中任一權利要求所述基因工程菌株生產二羥基丙酮的方法，包括下列步驟a)其出發菌為權利要求1-4中任一權利要求所述基因工程菌株；b)種子培養在搖瓶中進行，搖床轉速為100～300轉/分鐘，溫度為27～40℃，培養時間為9～30小時；c)發酵培養在發酵罐中進行，發酵罐接種量為5％～20％，培養基含甘油，攪拌槳轉速為100～400轉/分鐘，溫度為27～40℃，發酵方式可以是間歇發酵、批式流加發酵或連續發酵，間歇或批式流加發酵的時間為10～200小時；d)分離純化二羥基丙酮。
12.如權利要求11所述的方法，其特征在于，在發酵培養過程中向發酵罐中通空氣，通氣量為0.2～4vvm，發酵方式為連續發酵時先進行間歇發酵，待發酵液中菌體達到650nm下光密度為0.2～0.7時，一次或多次添加IPTG至終濃度為0.1～2.5mmol·L-1，同時流加含甘油濃度為重量體積比40％～99％的發酵培養基，進行恒化培養，pH控制在4.5～7.5范圍內。
13.如權利要求11或12所述的方法，其特征在于，步驟c)后還包括細胞催化步驟1)將發酵所得大腸桿菌離心分離；2)所得細胞重懸于Tris/HCl緩沖液中，加入CTAB至終濃度為重量體積比0.01～1％或SDS至重量體積比0.1～3％或丙酮至重量體積比0.1～5％或甲苯至重量體積比0.1～5％或氯仿至重量體積比0.1～5％，處理30～120分鐘；3)離心收集細胞，將收集到的細胞用的磷酸鈉或磷酸鉀緩沖液洗滌，重懸于磷酸鈉或磷酸鉀緩沖液中，一次或多次加入甘油至終濃度為重量體積比10～70％，將該懸浮液置于轉速為50～300轉/分鐘，溫度為27～40℃條件下2～8小時；4)離心分離細胞，上清即為生物轉化得到的二羥基丙酮溶液，重復步驟2)-4)，循環2～15次。
全文摘要
本發明涉及生產二羥基丙酮的基因工程菌，其構建方法及其用途。本發明公開了一種新的生產二羥基丙酮的基因工程菌株，該菌株為用重組基因工程質粒pET－gdh和pET－ndh轉化的大腸桿菌。本發明進一步公開了上述工程菌的構建及其用途和應用。利用本發明的工程菌生產二羥基丙酮，提高了二羥基丙酮的轉化率，同時收集到的菌體經處理后可循環利用，該工藝簡化了微生物生產二羥基丙酮的工藝，降低了生產成本，縮短了發酵時間，提高了生產效率。
文檔編號C12P7/24GK101092604SQ20071004079
公開日2007年12月26日 申請日期2007年5月17日 優先權日2007年5月17日
發明者魏東芝, 馬興元, 鄭宇 , 趙莉, 劉美云 申請人:華東理工大學