檢測阪崎腸桿菌的酶聯免疫吸附測試方法及其中所用的抗體的制作方法

專利名稱：檢測阪崎腸桿菌的酶聯免疫吸附測試方法及其中所用的抗體的制作方法
技術領域：
本發明涉及檢測細菌的酶聯免疫吸附測試(ELISA)技術，具體而言，涉及了檢測阪崎腸桿菌的酶聯免疫吸附測試方法。另外，本發明還涉及ELISA方法中所用的抗體和制備該抗體所需的阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶及其編碼核酸、載體等。
背景技術：
阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)是腸桿菌屬的一種革蘭氏陰性菌，1980年前被稱為“黃色陰溝腸桿菌”。作為奶及奶制品加工過程及成品中的污染源，阪崎腸桿菌能夠引起的嬰幼兒及成人疾病包括嬰兒腦膜炎、膿血癥、敗血癥和小腸結腸炎等，并且可能引起神經功能紊亂，造成嚴重的后遺癥和死亡。例如，1961年到2003年報道的76個病例中19例死亡，死亡率高達50％以上；而2002-2003年美國某知名奶粉生產廠曾自發召回了含有阪崎腸桿菌的嬰兒配方奶粉。FAO/WHO于2004年2月2～5日在日內瓦召開的專家咨詢會上將阪崎腸桿菌列入作為導致嬰幼兒感染、疾病和死亡的主要原因的“A”類微生物范疇，它嚴重威脅人們(尤其是嬰幼兒)的健康，并給食品(尤其是奶及奶制品)工業帶來了重大經濟損失。
為此，各國對食品中的阪崎腸桿菌都有著嚴格的要求。美國FDA2002年建立了阪崎腸桿菌的檢測標準；而我國自2005年10月起也對大部分進口的奶及奶制品都要求進行阪崎腸桿菌的檢查，并要求不得檢出。因此，阪崎腸桿菌的檢測方法正日益引起人們的關注。
除了經典的常規細菌生理生化檢驗方法，在美國專利申請US2007/26482A、US2006/257967A以及本發明人參與的工作(參見食品科學，2006，27(02)208-212)中，分別公開了添加有4-甲基傘形基-α-葡萄糖苷(4-methylumbelliferyl-α-glucoside)、API20E腸桿菌檢測試劑等的細菌培養基，用于菌落培養來檢測阪崎腸桿菌。但是，這種方法需要等待長時間的細菌生長階段，而且容易受具有相似生理生化性質的雜菌干擾。
除了已經建立的SN標準方法，在基因水平上對阪崎腸桿菌的改進檢測方法也有報道，如中國專利申請CN1664112A和中國專利CN1281763C、CN1280429C等。它們主要利用了阪崎腸桿菌的16S和23S rRNA的編碼基因序列，通過核酸探針雜交、PCR(如，熒光定量PCR)等方式來進行檢測。但是，檢測基因的方法無法區分死細菌和活細菌，而且這類方法對雜交條件和擴增條件相當敏感，容易產生操作的輕微失誤而導致較高的假陽性、假陰性結果。
針對現有技術的不足，本發明人開創性地提出了一種運用阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶抗體進行酶聯免疫吸附測試來檢測阪崎腸桿菌的方法，其中開創性地應用了抗具有如Seq ID No2所示氨基酸序列的阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶的抗體，不但能夠快速、高效地檢測出阪崎腸桿菌，而且檢測的靈敏度高、特異性強、結果可靠。另外，本發明人還得到了ELISA檢測阪崎腸桿菌過程中所需的關鍵抗體以及制備該抗體所需的基因、蛋白質(酶)等。盡管該基因與A.Lehner等公開的序列(參見Systematic and Applied Microbiology，29609-625和EMBL核酸數據庫中的AMO75208)相似，但是A.Lehner等的工作是為了研究阪崎腸桿菌代謝途徑的，沒有提示用其制備抗體用于ELISA檢測中。

發明內容
本發明的目的在于提供酶聯免疫吸附測試(ELISA)檢測阪崎腸桿菌的方法，其不但能夠快速、高效地檢測出阪崎腸桿菌，而且檢測的靈敏度高、特異性強、結果可靠。
本發明的目的之二還在于提供ELISA中關鍵的抗體和制備該抗體所需的阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶及其編碼核酸、載體等。
本發明的目的之三還有上述抗體的ELISA應用以及包括了上述抗體的試劑盒。
具體而言，在第一個方面，本發明提供了檢測阪崎腸桿菌的方法，其特征在于，運用抗阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶抗體進行酶聯免疫吸附測試(ELISA)檢測，其中所述α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列如Seq ID No2所示。
在本文中，酶聯免疫吸附測試本身是常用的免疫檢測方法，其通過抗原和相應抗體的特異結合產生抗原-抗體復合物，其中抗原或相應抗體被直接或間接地標記有酶，然后再與酶底物反應，產生可檢測(如顏色或pH、紫外吸光值發生變化)的產物，通過對該產物的檢測即可定性或定量分析抗原或相應抗體。本發明第一個方面中的ELISA可以是直接ELISA方法，例如，固定待測菌體抗原，加入抗具有如Seq ID No2所示氨基酸序列的阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶的抗體，而且所述抗體標記有酶，洗去未與菌體抗原特異結合的抗體，加入酶底物，然后進行檢測。如果固定的菌體抗原與抗體形成了抗原-抗體復合物，抗體上標記的酶可以產生可檢測的產物，檢測該產物就能判斷是否存在阪崎腸桿菌了。本發明第一個方面中的ELISA優選是間接ELISA方法，例如，固定待測菌體抗原，加入抗具有如Seq ID No2所示氨基酸序列的阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶的抗體，洗去未與菌體抗原特異結合的抗α-葡萄糖苷酶抗體，再加入酶標記的抗抗體(又稱二抗)，洗去未與抗α-葡萄糖苷酶抗體特異結合的抗抗體，加入酶底物，然后進行檢測。如果能檢測到酶底物經標記的酶催化產生的產物，則表示存在阪崎腸桿菌。本發明第一個方面中的ELISA還可以是雙抗體夾心ELISA方法、競爭ELISA方法，其中抗具有如Seq ID No2所示氨基酸序列的阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶的抗體可以作為包被在固相載體的固定的抗體而運用其中。另外，本發明第一個方面中的ELISA還有捕獲法測IgM抗體、ABS-ELISA法以及PCR-ELISA法和斑點免疫酶結合試驗等檢測方法。上述ELISA方法本身對所屬領域技術人員來說是熟悉的，也可參見李玉珍等的綜述(中國食品添加劑，2006，03108-112)，其中酶標記抗體的方法、相應的酶、酶底物也是所屬領域技術人員所熟知的，例如可以通過戊二醛將抗體與酶交聯在一起，酶的具體例子有堿性過氧化物酶、辣根過氧化物酶等，至于酶標記的抗抗體，有許多已經商品化了。
在本文中，抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。可利用常規方式制備多克隆抗體，即從接觸了所選抗原的動物或人血清中得到。例如，通過用所選擇的抗原用常規方法刺激所選擇的動物或人的免疫系統，使免疫系統產生天然抗體，然后從動物或人血或其他生物液體中收集這些抗體來制備多克隆抗體。對于單克隆抗體，可利用常規的雜交瘤技術制備。G.Kohler和C.Milstein，Nature，256495-497(1975)中記載了制備單克隆抗體的方法，目前也有許多公知的改良方法。另外，本領域的技術人員采用公知技術操作動物或人抗體的互補決定區，即可制備出嵌合或人源化的抗體，這也可用作本發明的抗體。目前有些抗體已經商品化了，本發明中也包括使用通過商業途徑購買的抗體。在本發明的第一方面中，抗阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶抗體是能特異結合阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶的抗體，其中所述α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列如Seq ID No2所示。該抗體優選是單克隆抗體，尤其優選是由雜交瘤細胞CGMCC2084產生的單克隆抗體。如果本發明的第一方面中的ELISA方法中使用了抗抗體，則抗抗體是能特異結合抗阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶抗體的抗體，通常是特異結合抗阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶抗體所屬的動物物種的抗體。例如，如果抗阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶抗體是鼠抗體，則抗抗體可以是兔抗鼠抗體或羊抗鼠抗體等。這樣的抗抗體或酶標記的抗抗體已經有商品化的產品可供購買。
在第二個方面，本發明提供了一種阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶，其氨基酸序列如Seq ID No2所示。在本文中，“阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶”指是來自阪崎腸桿菌的具有α-葡萄糖苷酶活性的蛋白質。本發明第二個方面的α-葡萄糖苷酶可以作為抗原而用于制備本發明第一方面中的抗阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶抗體。
在第三個方面，本發明提供了編碼本發明第二個方面的阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶的核酸。在本文中，“多核苷酸”、“核酸”、“核酸分子”、“核苷酸序列”可以相互替換使用，均指一個含意。本發明的多核苷酸，可以是DNA形式，也可以是RNA形式，優選DNA形式。DNA形式包括天然cDNA和人工合成的cDNA，DNA可以是編碼鏈或模板鏈。通過常規技術，如PCR方法、重組法或人工合成的方法，本領域技術人員可以很容易獲得本發明的編碼融合蛋白的核苷酸序列或其片段。這些序列一旦獲得，就可以將其克隆入載體，再轉化或轉染入相應的細胞，然后通過常規的宿主細胞進行增殖，從中分離得到大量的核苷酸序列。優選本發明的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID No1所示。
在第四個方面，本發明提供了一種載體，其含有本發明第三個方面的核酸。載體在本文中是指本領域中常用的細菌質粒、粘粒、噬菌粒、酵母質粒、植物細胞病毒、動物病毒及其它各種病毒載體。本發明中適用的載體包括但不限于在細菌中表達用的載體(原核表達載體)、在酵母中表達用的載體(如畢赤酵母載體、漢遜酵母載體等)、在昆蟲細胞中表達的桿狀病毒載體、在哺乳動物細胞中表達用的載體(痘苗病毒載體、逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺伴病毒載體等)、在植物中表達用的植物病毒載體以及在哺乳動物乳腺中表達用的各種載體。總之，只要能在宿主細胞中穩定復制，任何質粒和載體都可使用。優選表達載體包含選擇標記基因，如細菌的氨芐青霉素抗性基因、四環素抗性基因、卡那霉素抗性基因、鏈霉素抗性基因、氯霉素抗性基因；酵母菌的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因、酵母菌的缺陷選擇標志，如His、Leu、Trp等；真核細胞的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因、二氫葉酸還原酶基因及熒光蛋白標記基因等。本領域技術人員可利用DNA重組技術等一系列技術，構建含本發明所述編碼融合蛋白的DNA序列、合適的轉錄和翻譯調控序列、啟動子及選擇性標記基因等特定元件的表達載體。上述載體可用來轉化、轉染合適的宿主細胞，以便獲得本發明第二個方面的阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶。
在第五個方面，本發明提供了一種細胞，其含有本發明第四個方面的載體，或其經本發明第四個方面的載體轉染或轉化而得。細胞可以是原核細胞，也可以是真核細胞，如，細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞等。宿主細胞在轉化或轉染含本發明所述編碼融合蛋白的基因序列后，即構成工程化細胞或細胞株，可用于生產所需融合蛋白，或將該能提供相應融合蛋白的細胞直接用于給藥。本領域技術人員能夠恰當地選擇適當的載體、宿主細胞，并熟知如何將載體高效地轉化或轉染入宿主細胞中，所用方法包括但不限于氯化鈣法、電穿孔法用于細菌細胞，電穿孔法和原生質體融合法用于酵母細胞，脂質體包裹、磷酸鈣共沉淀、電融合法以及顯微注射法用于哺乳動物細胞等真核細胞。
在第六個方面，本發明提供了制備本發明第二個方面的阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶的方法，其包括以下步驟用本發明第五個方面的宿主細胞表達出本發明第二個方面的阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶，并分離所述阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶。獲得的工程細胞可以通過常規方法培養、誘導來表達所需要的融合蛋白，包括發酵過程和純化工藝。上述表達的蛋白可在細胞內、細胞膜上或分泌到細胞周質、細胞外。根據需要，可利用融合蛋白的物理的、化學的以及其它生物學特性，進行分離純化。方法包括但不限于裂菌(超聲波裂菌、滲透壓裂菌)，離心，鹽析，分子篩色譜，離子交換色譜，吸附色譜(親和層析、金屬鏊合層析)，反向色譜，高效液相色譜，毛細管電泳，制備性等電聚焦以及常規的變性、復性處理等，這些方法本身均是本領域技術人員所熟知的。
在第七個方面，本發明提供了抗本發明第二個方面的阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶的抗體。抗體可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體，優選是單克隆抗體，更優選是由雜交瘤細胞CGMCC2084產生的單克隆抗體，其具有特異性好、靈敏度高的優點。在已經獲得抗原的情況下，可利用現有技術制備相應抗體。本發明第七個方面的抗體可運用在本發明的第一方面的檢測方法中。
在第八個方面，本發明提供了本發明第七個方面的抗體在制備檢測阪崎腸桿菌的ELISA試劑盒中的用途。ELISA試劑盒是一種常見的檢測產品，其包括進行ELISA所需的試劑。例如，常見的間接ELISA試劑盒可以包括固定抗原或抗體的固相介質、與抗原特異結合的抗體、標記酶的抗抗體以及酶底物、洗滌液等。其中，為了避免在測試前就混合各種試劑，故而通常用不同的容器裝不同的試劑，再將這些容器裝于一個包裝容器中，由此構成ELISA試劑盒。本發明第七個方面的抗體可以作為與抗原特異結合的抗體而包括在ELISA試劑盒中，成為檢測阪崎腸桿菌的ELISA試劑盒的必要組成部分，繼而可制備出檢測阪崎腸桿菌的ELISA試劑盒，用于實施本發明第一個方面的方法。
在第九個方面，本發明提供了一種檢測阪崎腸桿菌的ELISA試劑盒，其包括裝有本發明第七個方面的抗體的容器。在本文中，容器可以是瓶、盒、注射器等能容納抗體等試劑的常用容器。該ELISA試劑盒還可以包括裝有進行ELISA所需的其它試劑的容器，例如，分別標記酶的抗抗體、酶底物、洗滌液等的容器。通常，ELISA試劑盒還包括有說明書。說明書可以貼在試劑盒上，或者直接打印到試劑盒上，也可以以獨立的形式存在，如作為單獨的紙質說明書而裝在試劑盒中。說明書可以指示檢測阪崎腸桿菌的方法，如本發明第一方面的方法，其中可以包括使用試劑盒中試劑的次序、時間、量和方式等內容。根據需要，如方便運輸、存放，多個ELISA試劑盒可以進一步包裝進更大的包裝中，這也在本發明的范圍內。
在第十個方面，本發明提供了雜交瘤細胞，其保藏號為CGMCC2084。該雜交瘤細胞提交中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，中國科學院微生物研究所，北京)保藏，保藏號為CGMCC2084，保藏日期為2007年6月13日。該雜交瘤細胞可用于生產本發明的抗阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶抗體，所產生的抗體具有特異性好、靈敏度高的優點。因此在另一個方面，本發明提供了一種制備抗阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶抗體的方法，其包括，用本發明第十個方面的雜交瘤細胞分泌出所述抗體并收集、純化所述抗體。
為了便于理解，以下將通過具體的附圖、實施例對本發明進行詳細地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構成對本發明范圍的限制。依據本說明書的論述，本發明的許多變化、改變對所屬領域技術人員來說都是顯而易見的。另外，本發明引用了公開文獻，這些文獻是為了更清楚地描述本發明，它們的全文內容均納入本文進行參考。


圖1是SDS-PAGE電泳圖，顯示了阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶的在表達載體中的表達情況。其中，泳道M是分子量標記；泳道0是誘導前的表達情況；泳道1是誘導后的表達情況。
圖2是用抗阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶抗體的ELISA檢測照片。圖2A和圖2B中的泳道1是阪崎腸桿菌，泳道2是腸炎沙門氏菌，泳道3是陰溝腸桿菌，泳道4是克雷伯氏菌，泳道5是大腸桿菌ATCC 51813，泳道6是大腸桿菌ATCC25922。
具體實施例方式
以下本文將通過具體的實施例來描述發明。如未特別指明之處，可根據本領域技術人員所熟悉的《分子可隆實驗指南》(第三版)(科學出版社，北京，2002年)、《細胞實驗指南》(科學出版社，北京，2001年)、《RNA實驗技術手冊》(科學出版社，北京，2004年)、《免疫檢測技術》(科學出版社，北京，中國，1991年)、《生物合成藥物學》(化學工業出版社，北京，2000年)等實驗手冊、教科書以及本文所列的參考文獻和所用儀器、試劑的廠商說明書來實施。
實施例1阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶基因的克隆取阪崎腸桿菌ATCC29544菌株(可購自美國典型培養物保藏中心(ATCC))接種于LB肉湯，以37℃200rpm震搖培養過夜，收集菌體抽提基因組DNA作為PCR模板，以如下克隆引物對進行PCR擴增5’AGGAGGGGTAATGAGTGAAG3’，5’TTGATACCTCACGACGTCAG3’。PCR條件94℃5分鐘，30個循環(94℃30秒，56℃90秒，72℃60秒)，72℃5分鐘。
瓊脂糖電泳回收約1677bp大小的PCR產物，然后以該PCR產物為模板，以如下表達引物對進行PCR擴增，分別引入BamHI和XhoI酶切位點5’ACTGCggatccgATGAGTGAAGCACCGACGCAG3’，5’TCAGTGCctcgagCGACGTCAGTTTATAAACC3’。用BamHI和XhoI分別酶切作為表達載體的pET22b(+)質粒(可購自Invitrogen公司)和上述PCR產物，用連接酶連接酶切產物，轉化大腸桿菌BL21(DE3)(可購自Invitrogen公司)。挑取陽性轉化子克隆，抽取質粒，酶切鑒定正確后，委托上海生工公司測序，阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶基因序列如Seq ID No1所示。
實施例2阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶的表達與純化挑取經實施例1驗證的轉化子克隆，活化過夜，以1％接種于LB肉湯中，以0.5mM/L的比例加入IPTG，37℃誘導3小時，離心(8000rpm，5分鐘)，棄上清，收集菌體細胞，于-20℃凍存。用40ml結合緩沖液(含20mMTris-HCl，200mM NaCl，pH 8.0)重懸細胞，超聲波破碎細胞。然后，4℃以13000rpm離心30分鐘，取上清液，上樣于SDS-PAGE觀察誘導表達情況。結果如圖1所示，明顯有約65kD(即，阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶的大小)的蛋白質表達了。
取Ni-NTA柱(可購自美國PE公司)，用超過10倍柱體積的結合緩沖液(含20mM Tris-HCl，200mM NaCl，pH 8.0)平衡。將上述破碎細胞后得到的上清液上樣于Ni-NTA柱，然后，用結合緩沖液洗柱至OD280值衡定不變，再分別用洗脫緩沖液1(含20mM Tris-HCl，200mM NaCl，20mM咪唑，pH 8.0)和洗脫緩沖液2(含20mM Tris-HCl，200mM NaCl，500mM咪唑，pH 8.0)依次各洗脫10倍柱體積，同時用OD280檢測，收集洗脫液。用SDS-PAGE檢測洗脫液成分。在咪唑濃度為20mM時大量雜蛋白被洗脫；而在咪唑濃度為500mM時，約65kD(即，阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶的大小)的蛋白質被洗脫，由此得以純化。將純化的約65kD的蛋白質加入含4-硝基苯基-α-D-呋喃型葡萄糖的阪崎腸桿菌顯色培養基(購自Oxoid公司)，發現其能使該培養基顯色。因此，該純化的蛋白質具有能分解4-硝基苯基-α-D-呋喃型葡萄糖的α-葡萄糖苷酶活性，是阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶。
實施例3阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶抗體的制備采用如G.Kohler和C.Milstein(Nature，256495-497(1975))所述的雜交瘤技術，所不同的是用本發明的抗原(即表達、純化得到的阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶)通過昆明系小鼠來制備雜交瘤細胞，挑選到了24個雜交瘤細胞株。
先向小鼠腹腔內注射液體石蠟(每只小鼠0.5ml)。7天后，將雜交瘤細胞株分別接種于注射了液體石蠟的小鼠腹腔內，每只小鼠腹腔注射1～5×106個雜交瘤細胞。10～14天后收集腹水，經10000g離心5分鐘，取上清，用等體積pH7.0的磷酸緩沖液稀釋。稀釋后，緩慢加入同稀釋液等體積的飽和硫酸銨溶液，于4℃靜置2小時，以8000rpm離心30分鐘，棄去上清，沉淀用pH7.0的磷酸緩沖液溶解，用0.45um濾膜過濾。濾出液上樣于用pH7.0的磷酸緩沖液平衡好的Agarose-protein G柱(可購自Pharmcia Biotech公司)。用10倍柱體積的pH7.0的磷酸緩沖液洗柱，洗脫雜蛋白。然后用5～10倍體積0.1M甘氨酸-HCl(pH2.5)緩沖液洗脫結合于柱上的抗體，洗脫液立即用0.1mL 1mol/L Tris-HCl(pH8.0)緩沖液中和，由此得到各個雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體。
通過ELISA法，將以上得到的阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶(抗原)分別和各個雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體配對測定，選擇靈敏度最高的抗體，并將相應的雜交瘤細胞株提交中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，中國科學院微生物研究所，北京)保藏，保藏號為CGMCC2084，保藏日期為2007年6月13日。
實施例4用阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶抗體的ELISA檢測阪崎腸桿菌采用間接ELISA法用本發明的抗體檢測阪崎腸桿菌。選擇易于與阪崎腸桿菌混淆的雜菌以及阪崎腸桿菌，分別取各種菌的菌液與2×Loading Buffer(可購自大連寶生物工程有限公司)等體積混合均勻后煮沸10分鐘，然后進行SDS-PAGE，其中每孔上樣量為12ul(上樣量約為20ug全菌蛋白)。SDS-PAGE完成后，將膠取下，以300mA轉膜1小時。然后，用5％脫脂奶粉封閉過夜。加入實施例3得到的單克隆抗體，室溫振蕩孵育1小時。然后加PBS-T漂洗2遍，再振蕩洗滌3次，每次5分鐘。加入酶標羊抗鼠抗體(可購自美國IDS公司)，室溫振蕩孵育30分鐘。然后加PBS-T漂洗2遍，再振蕩洗滌3次，每次10分鐘。用ECL-PLUS試劑盒(購自Amersham公司)曝光，結果如圖2所示。
圖2的兩次結果都僅僅在阪崎腸桿菌的泳道中出現檢測條帶，而且條帶位置顯示其分子量為約65kD。這顯示，本發明的阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶抗體具有很強的專一性和可靠的重復性，利用它進行的ELISA能夠清楚、可靠地鑒定、區分出阪崎腸桿菌。
序列表<110>楊捷琳<120>檢測阪崎腸桿菌的酶聯免疫吸附測試方法及其中所用的抗體<130>楊捷琳<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1680<212>DNA<213>阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)<400>1atgagtgaag caccgacgca ggtaaaaggc cgctggtgga aagaggcaac ggcctaccag 60atttatccgc gcagctttaa agacagcaac ggcgacggca ttggcgatct caacgggatt120atcgaaaagc tcgattacct gaaagattta ggtatcgatc ttatctggat ctgcccgatg180tacccgtcgc ccaacgacga taacggttat gacatcagcg actatcaggg gatcatggcg240gaatttggca cgatggccga tttcgaccgg ctgctggaag gcgtgcatca gcgcggcatg300cggctgatcc tggacctggt ggtgaaccac acgtccgacg aacatccgtg gtttcttgaa360tcgcgctcct caaaggataa ccccaaacgc gactggtata tctggcgcga cggcaaaaac420ggggcggagc cgaataactg ggaatcgatt ttcagcggct cggcctggaa gcgggatgac480gtgaccggcc agtatttcat gcacctgttc agcagccgtc agcccgatct caactgggaa540aatcatgaga tgcgcgccgc cgtctacgac atgatgcgct ggtggcttga taagggcatt600gacgggtttc gcatcgacgc cattgcgcat atgaaaaagg agccgacgtt aagcgacgtg660ccgaaccccg aaaaactgcc ctacgcgccg tcgatggtgt cgcaccttaa ttacgacggc720ctgctcgact atgtggacga catctgccgc aacgtcttta accattacga catcgtcacg780gtgggcgaga tgaacgggct ggacgctgcc cacgcggaag agtgggtggg cgaaaaccgc840gggcggctga atatggtgtt tcagtttgag catgtccggc tctgggagcc gcaggcgggc900ctgcgcccga cgcccgccgt gctgcgcaac attttcaccg cctggcagca ggcgctggaa960
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Gln Arg Gly Met Arg Leu Ile Leu Asp Leu Val Val Asn His Thr Ser100 105 110Asp Glu His Pro Trp Phe Leu Glu Ser Arg Ser Ser Lys Asp Asn Pro115 120 125Lys Arg Asp Trp Tyr Ile Trp Arg Asp Gly Lys Asn Gly Ala Glu Pro130 135140Asn Asn Trp Glu Ser Ile Phe Ser Gly Ser Ala Trp Lys Arg Asp Asp145 150 155 160Val Thr Gly Gln Tyr Phe Met His Leu Phe Ser Ser Arg Gln Pro Asp165170175Leu Asn Trp Glu Asn His Glu Met Arg Ala Ala Val Tyr Asp Met Met180185 190Arg Trp Trp Leu Asp Lys Gly Ile Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Ile195 200205Ala His Met Lys Lys Glu Pro Thr Leu Ser Asp Val Pro Asn Pro Glu210 215 220Lys Leu Pro Tyr Ala Pro Ser Met Val Ser His Leu Asn Tyr Asp Gly225 230 235 240Leu Leu Asp Tyr Val Asp Asp Ile Cys Arg Asn Val Phe Asn His Tyr245 250255Asp Ile Val Thr Val Gly Glu Met Asn Gly Leu Asp Ala Ala His Ala260265270Glu Glu Trp Val Gly Glu Asn Arg Gly Arg Leu Asn Met Val Phe Gln275280285Phe Glu His Val Arg Leu Trp Glu Pro Gln Ala Gly Leu Arg Pro Thr290 295 300Pro Ala Val Leu Arg Asn Ile Phe Thr Ala Trp Gln Gln Ala Leu Glu305 310 315 320Gly Lys Gly Trp Asn Ala Leu Tyr Val Glu Asn His Asp Val Thr Arg325 330335Val Val Ser Arg Trp Gly Asp Thr Glu His His Trp Arg Glu Ser Ala340345 350Thr Cys Ile Ala Ala Met Tyr Phe Leu Met Gln Gly Thr Pro Phe Ile355360 365
Tyr Gln Gly Gln Glu Ile Gly Met Thr Asn Thr Arg Phe Ala Ser Leu370 375 380Asp Asp Phe Asp Asp Val Ser Ala His Asn Lys Ala Arg Asp Leu Arg385 390 395400Asp Gln Gly Met Arg Glu Glu Glu Ile Val Glu Phe Leu Thr Arg Thr405 410 415Gly Arg Asp Asn Ser Arg Thr Pro Met Gln Trp Asp Ala Ser Pro Tyr420 425 430Ala Gly Phe Ser Thr His Glu Pro Trp Leu Lys Val Asn Pro Asn Tyr435 440 445Glu Met Ile Asn Val Glu Ser Gln Gln His Asp Pro His Ser Val Leu450 455 460Asn Phe Tyr Arg Arg Met Ile His Leu Arg Lys Arg Glu Pro Ala Leu465 470 475 480Ile Tyr Gly Arg Tyr Glu Thr Val Leu Asn Asp His Glu Gln Ile Tyr485490495Ala Tyr Arg Arg Val Leu Gly Asp Glu Gln Leu Val Val Leu Cys Asn500505510Phe Ser Gly Lys Ala Ala Glu Trp Asp Ala Arg Ala Leu Ser Leu Asn515 520525Gly Ala Phe Cys Val Leu Ala Asn Leu Asp Glu Thr Gln Glu Pro His530 535540Arg Leu Arg Ala Trp Glu Thr Arg Val Tyr Lys Leu Thr Ser Leu Glu545550 555 560
權利要求
1.檢測阪崎腸桿菌的方法，其特征在于，運用抗阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶抗體進行酶聯免疫吸附測試檢測，其中所述α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列如Seq IDNo2所示。
2.權利要求1所述的方法，其中所述抗阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶抗體是單克隆抗體，優選其是由雜交瘤細胞CGMCC2084產生的單克隆抗體。
3.一種阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶，其氨基酸序列如Seq ID No2所示。
4.編碼權利要求3的阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶的核酸，優選所述核酸的核苷酸序列如Seq ID No1所示。
5.一種載體，其含有權利要求4的核酸。
6.抗權利要求3的阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶的抗體。
7.權利要求6所述的抗體，其特征在于，所述抗體是單克隆抗體，優選其是由雜交瘤細胞CGMCC2084產生的單克隆抗體。
8.權利要求6或7的抗體在制備檢測阪崎腸桿菌的ELISA試劑盒中的用途。
9.一種檢測阪崎腸桿菌的ELISA試劑盒，其包括裝有權利要求6或7的抗體的容器。
10.雜交瘤細胞，其保藏號為CGMCC2084，于2007年6月13日保藏于中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。
全文摘要
本發明涉及檢測阪崎腸桿菌的酶聯免疫吸附測試(ELISA)的方法，其中運用抗阪崎腸桿菌α－葡萄糖苷酶的抗體，其中所述α－葡萄糖苷酶的氨基酸序列如Seq ID No2所示。另外，本發明還涉及ELISA方法中所用的抗體和制備該抗體所需的阪崎腸桿菌α－葡萄糖苷酶及其編碼核酸、載體等。上述抗體的ELISA應用以及包括了上述抗體的試劑盒。本發明的檢測方法不但能夠快速、高效地檢測出阪崎腸桿菌，而且檢測的靈敏度高、特異性強、結果可靠。
文檔編號C12N5/12GK101082624SQ20071004364
公開日2007年12月5日 申請日期2007年7月10日 優先權日2007年7月10日
發明者楊捷琳, 顧鳴, 黃應峰 申請人:楊捷琳