專利名稱：：一種提高光合細菌產氫速率、產量的方法一種提高光合細菌產氫速率、產量的方法
技術領域：
能源和環境是人類目前面臨的兩大問題。氫氣是未來最理想的綠色能源。在自然界中，許多微生物可以在其代謝過程中將水或碳水化合物中的氫質子轉化為氣氣，在此基礎上形成的生物產氫技術有可能使人類擺脫石油危機并告別燃油汽車排放污染。從產氫速率、碳水化合物產氫轉化效率和產物純化難易來看，光合細菌是最有應用前景的類群之一。光合放氫可以利用多種有機酸，其產氫過程將清潔能源的獲得、光能的利用和治理有機污染物三者有機地結合在一起。但要將光合產氫技術應用于工業生產并滿足人類對能源日益增長的的需求，仍需進一步提高光合細菌產氫的效率，.并尋找合適的廢水作為較廉價的碳源。
發明內容本發明的發明目的是為了提供一種提高光合細菌產氫速率、產量的方法，通過改變光合細菌產氫的培養基、引入適當的鐵、鉬離子以提高產氬效率并降低成本。本發明的目的可以通過以下技術方案來實現。一種提高光合細菌產氫速率、產量的方法，其步驟如下a)選擇菌種選用的類球紅細菌(Rhodobactersphearoides)SH-2菌株；由中科院上海生命科學院植物生理生態研究所分子微生物開放實驗室提供。它可以利用蘋果酸、乙酸、丁酸等進行厭氧光照放氫。b)細胞培養RCVB培養基由適量的碳源，氮源，基本鹽，磷酸緩沖液，維生素組成。調pH值至7.00;接入種子液，培養溫度30土2攝氏度，在搖床上以160r/min培養1-2天。c)微量元素的加入在培養基中加入適量的鉬離子及鐵離子。d)廢水處理將生活污泥、變質牛奶或釀造廢水經過預處理后加入基本鹽，維生素，磷酸緩沖液，L-谷氨酸，調pH值至7.00,滅菌。研究表明，光合細菌的固氮酶是鐵硫蛋白，是一個氧不穩定的雙分子，分子很大很復雜。活性中心除了含有Fe-S外，還含有Mo-Fe活性中心原子簇。實驗表明，培養基中鐵、鉬離子濃度明顯影響類球紅細菌的產氫速率。圖1為本發明中鉬離子濃度對產氫總量的影響折線圖；圖2為本發明中鉬離子濃度對最大產氫速率的影響折線圖;圖3為本發明鉬離子濃度與產氫后的0D值關系圖；圖4為本發明中鐵離子濃度對產氫總量的影響折線圖；圖5為本發明中鐵離子濃度對最大產氫速率的影響折線圖;圖6為本發明鐵離子濃度與產氫后的OD值關系圖；具體實施方式下面結合具體實施例進一步說明本發明的技術特點。本發明的實驗數據通過以下方法測試a)選擇菌種選用的類球紅細菌(Rhodobactersphearoides)SH-2菌株；由中科院上海生命科學院植物生理生態研究所分子微生物開放實驗室提供。它可以利用蘋果酸、乙酸、丁酸等進行厭氧光照放氫。b)細胞培養每1LRCVB培養基由碳源(30mM蘋果酸)，氮源(lgL-谷氨酸)，基本鹽50ml，磷酸緩沖液7.51111,維生素lml組成。調pH值至L00;接入種子液，培養溫度30±2攝氏度，在搖床上以160r/min培養1-2天。c)微量元素的加入在培養基中加入不同濃度的鉬離子及鐵離子。其濃度分別為Mo"(yM):0,5，10,15,20，30，60，100，3.5Fe2+(yM):0,20，60,80，100,150,200,300,42d)廢水處理將生活污泥、變質牛奶或釀造廢水經過預處理后加入基本鹽，維生素，磷酸緩沖液，L-谷氨酸，調pH值至7.00,滅菌。e)廢水中有機酸的測定用島津氣相色譜(Shimadzu,Kyoto,Japan(FID-氫火焰檢測器)(毛細管柱)，進樣量10juL，進樣溫度為25(TC,柱溫8(TC,檢測器溫度為260°C。f)產氣量測定反應在35mL的試管中進行，用60mL的注射器收集氣體。產氣過程中記錄產氣體積，氫氣含量由天美氣相色譜(TechcorapGC7900，Shanghai)(TCD-熱導檢測器)(填充柱)檢測，進樣量O.lmL，進樣口80°C，柱溫80。C,檢測器溫度為13(TC。g)0D值的測定用分光光度計(UnicUV2808,Shanghai)檢測660nm的吸收值。Mo"對產氫的影響培養基中Mo"的濃度對類球紅細菌產氫的產氫總量、底物轉化效率、最大產氫速率均有影響，并存在一個明顯的峰值，具體數據如下<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>從表中看到，當Mo"濃度在3.5pM時，產氫總量、最大產氫速率及底物轉化效率都達到了高峰，分別為105±1ml/33ml培養基、138(mlH2/L'h)、71.22%;當Mo"濃度超過3.5MM時，類球紅細菌的產氫效果開始下降；當Mo"濃度超過10iaM時，產氫總量、最大產氫速率及底物轉化效率沒有大的波動，都維持在相近的水平，分別為70-80ml/33ml培養基左右、60-70mlH2/L.h左右、50%左右。在實驗中還觀察到，當Mo"濃度低于30iuM時，接種后大約18小時左右類球紅細菌開始產氣，在20-30小時段達到產氣高峰；當Mo"濃度高于30juM時，接種后大約27小時左右類球紅細菌開始產氣，在30-40小時段達到產氣高峰。通過對產氣后培養基OD值的檢測，發現當Mo"濃度低于5pM時，Mo"濃度越大，0D值越小；當Mo"濃度超過5nM時，Mo"濃度的變化與0D值并無明顯聯系。說明Mo"濃度對類球紅細菌的生長有一定的影響，但此影響不大，且類球紅細菌在Mo"濃度為3.5mM的培莽基中生長得最好(除了0pM)。因此，控制Mo"濃度在3.5uM，可以大大增強類球紅細菌的產氫效果，提高產氫總量、最大產氫速率及底物轉化效率。鉬離子濃度對產氫效果的影響可由圖1-圖3直觀表達。Fe"對產氫的影響培養基中Fe2+的濃度對類球紅細菌產氫的產氫總量、底物轉化效率、最大產氫速率均有影響，具體數據如下<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>從上表可以看到，隨著F,濃度的增加，類球紅細菌的產氫總量、最大產氫效率、底物轉化效率均變大，當Fe"濃度達到42iuM及150iaM時，產氫總量、最大產氫效率、底物轉化效率達到高峰，且Fe"濃度為150yM的培養基效果最好，產氫總量、最大產氫效率、底物轉化效率分別是122ml/33ml培養基、136mlH2/L.h、82.99%,Fe2'濃度為42(jM的培養基效果略差，產氫總量、最大產氫效率、底物轉化效率分別是115ml/33ml培養基、105mlH2/L-h、78.23%;當Fe"濃度在42)aM及150yM之間時，Fe2+濃度的變化對產氣效果影響不大，產氫總量、最大產氫效率、底物轉化效率分別是100-110ml/33ml培養基左右、90-100ralH2/Lh左右、65%-75°/左右；當Fe"濃度超過150(jM時，產氫效果較150pM的略差，但基本持平，且無大波動。OD值的檢測反映了鐵離子濃度變化對類球紅細菌的生長影響不大，當Fe"濃度在42pM時，類球紅細菌生長得最好，但與其它濃度相比相差很小。因此，控制培養基中Fe2+濃度在42juM或150nM時，類球紅細菌產氣效果最好，當然，若F^濃度為150jLiM,雖則產氫速率較大，但同時也伴隨著成本的上升。鐵離子濃度對產氫效果的影響可由圖4-圖6直觀表達。Mo"與Fe2+的比較將上述兩種微粒的實驗數據中產氣效果最好的兩組進行對比，發現類球紅細菌在150pMF,的培養基中產氫速率略低于在3.5yMMo"的培養基，但產氫總量與底物轉化效率較大。如下表所示:<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>類球紅細菌在釀造廢水中的產氫情況醋是我國人民非常喜愛的一種富有營養的.酸性調味品，研究表明，醋酸是釀造醋中的主要成分，糖、氨基酸、酯、醛、醇、酚、酮類等為微量化學成分。本課題試驗了類球紅細菌在釀造廠制醋的廢水中的產氫效果。通過對釀造廠制醋的廢水進行有機酸檢測，發現其中含有一定濃度的乙酸，具體數據如下<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>將該廢水稀釋1.5倍后進行調制，添加基本鹽，維生素，磷酸緩沖液，L-谷氨酸，調pH值至7.OO作為培養液。在35mL試管中加入33mL培養液，用光照強度為4000-5000Lux的光源照射7天。類球紅細菌在該廢水中的產氫情況如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>以上數據說明，類球紅細菌能在釀造廢水中放氫，且效果較好。類球紅細菌在生活污泥、變質牛奶中的產氫情況生活污泥中含有大量的有機酸，而腐敗的牛奶中有一定濃度的丁酸，生活污泥及腐敗牛奶經與處理后有機酸的含量見下表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>將生活污泥及腐敗牛奶離心，分別在生活污泥和稀釋2.7倍的腐敗牛奶中加入基本鹽，維生素，磷酸緩沖液，L-谷氨酸，調PH值至7.00作為培養液。在35mL試管中加入33mL培養液，用光照強度為4000-5000Lux的光源照射7天。雖然生活污泥及腐敗牛奶中有乙酸、丁酸作為碳源，且類球紅細菌生長情況良好，但是幾乎不產氫。懷疑上述兩種廢水中含有抑制類球紅細菌產氫的物質。因為NH/會抑制光合細菌產氫，故檢驗了其中的氨氮值，為[NH4+]-0.7523mM,不在抑制產氫的范圍內，所以光合細菌不產氫的原因不在于受到"銨抑制"，具體原因仍需進一步分析。(1)從上述實驗數據，在培養基里添加鉬、鐵離子可提高類球紅細菌的產氫效率。當Mo"濃度在3.5;aM時，產氫總量、最大產氫速率及底物轉化效率都達到了高峰，且生長狀況最好。當Fe"濃度達到42mM或150jLiM時，產氫總量、最大產氫效率、底物轉化效率達到高峰，其中又以Fe2+濃度為150pM的培養基效果最好，產氫速率最大，但成本也較大。兩者相比，類球紅細菌在150/aMFe2+的培養基中產氫速率略低于在3.5juMMo"的培養基，但產氫總量與底物轉化效率較大。(2)從上述數據可以得出釀造廢水可作為類球紅細菌光合產氫的廉價碳源。但其在腐敗牛奶及生活污泥中卻不產氫一一盡管這兩類廢水里都含有豐富的小分子有機酸。已排除受銨抑制，具體原因有待進一步探討。權利要求1、一種提高光合細菌產氫速率、產量的方法，其步驟如下a)選擇菌種選用的類球紅細菌(Rhodobactersphearoides)SH-2菌株；由中科院上海生命科學院植物生理生態研究所分子微生物開放實驗室提供。它可以利用蘋果酸、乙酸、丁酸等進行厭氧光照放氫；b)細胞培養RCVB培養基由適量的碳源，氮源，基本鹽，磷酸緩沖液，維生素組成。調pH值至7.00；接入種子液，培養溫度30±2攝氏度，在搖床上以160r/min培養1-2天；c)微量元素的加入在培養基中加入適量的鉬離子及鐵離子；d)廢水處理將生活污泥、變質牛奶或釀造廢水經過預處理后加入基本鹽，維生素，磷酸緩沖液，L-谷氨酸，調pH值至7.00，滅菌。2、根據權利要求l所述的一種提高光合細菌產氫速率、產量的方法，其特征在于所述的Fe2+離子選用0pM-300juM。3、根據權利要求2所述的一種提高光合細菌產氫速率、產量的方法，其特征在于所述的Fe2+離子選用42juM-150mM。4、根據權利要求3所述的一種提高光合細菌產氫速率、產量的方法，其特征在于所述的Fe2+離子選用150]LiM。5、根據權利要求l所述的一種提高光合細菌產氫速率、產量的方法，其特征在于所述的Fe2+離子濃度為0|iM~100MM。6、根據權利要求5所述的一種提高光合細菌產氫速率、產量的方法，其特征在于所述的F^+離子濃度為3.5)LiM。全文摘要本發明公開了一種提高光合細菌產氫速率、產量的方法，其步驟如下a)選擇菌種選用的類球紅細菌(Rhodobactersphearoides)SH-2菌株；b)細胞培養RCVB培養基由適量的碳源，氮源，基本鹽，磷酸緩沖液，維生素組成。調pH值至7.00；接入種子液，培養溫度30±2攝氏度，在搖床上以160r/min培養1-2天；c)微量元素的加入在培養基中加入適量的鉬離子及鐵離子；d)廢水處理將生活污泥、變質牛奶或釀造廢水經過預處理后加入基本鹽，維生素，磷酸緩沖液，L-谷氨酸，調pH值至7.00，滅菌。實驗表明，培養基中鐵、鉬離子濃度明顯影響類球紅細菌的產氫速率。文檔編號C12N1/20GK101333504SQ200710043028公開日2008年12月31日申請日期2007年6月29日優先權日2007年6月29日發明者朱亦辰申請人:上海市上海中學