專利名稱：：一種通用熒光標記探針在pcr-ldr基因單核苷酸多態性芯片上的應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及生物技術,具體涉及到一種通用熒光標記探針在PCR-LDR基因單核苷酸多態性(SingleNucleotidePolymorphisms,縮寫SNP)芯片上的應用。
背景技術：
：隨著人類藥物基因組學的發展，越來越多的研究成果將運用于臨床診斷中，這就需求有大規模的基因單核苷酸多態性位點檢測方法。近年來，將連接反應用于檢測基因單核苷酸多態性位點越來越引起人們的重視，學者們已經做了大量的研究(FranceBaranyetal.,Proc.Nat，lAcad.Sci.USA,88:189-93(1991),TheLigaseChainReaction(LCR)inaPCRWorld,PCRMethodsandApplications,1:5-16(1991))。連接酶鏈式反應(ligasechainreaction,LCR)是指在反應中設計兩對探針，使連接反應可以指數擴增模板。連接酶檢測反應(ligasedetectionreaction,LDR)是在反應中僅加入一對探針，模板被線性擴增。目前，出現了將LDR技術和PCR技7(t關聯使用，以及LDR技術、PCR技術和基因芯片技術關聯用于基因單核苷酸多態性位點檢測(NormanP.Gerryletal.,J.Mol.Biol.(1999)292,251-262,U.S.Pat.Pub,No.2003/0032016A1)，這些技術的出現大大方便了基因位點的檢測，但在這些技術中，需要大量的熒光標記的探針，而這些標記的探針成本昂貴，為開發和應用造成不便，因而，限制了它們的應用。
發明內容本發明所要解決的技術問題在于克服上述不足之處，研究設計應用方便和價格合理的熒光標記探針。本發明提供了一種通用熒光標記探針在PCR-LDR基因SNP(單核苷酸多態性)多態性芯片上的應用。基因單核苷酸多態性包括單位點基因突變、基因缺失、插入、以及微衛星等多種情況，本發明所述的基因單核苷酸多態性位點檢測主要是針對基因單位點突變，即單堿基突變，插入和缺失，并且在突變位點周圍大約20個堿基內沒有其他單位點突變。當LDR和PCR關聯用于基因單核苷酸多態性位點檢測時，針對每一個突變位點，涉及到兩種探針，一種標記探針，序列是和模板配對；第二種檢測探針包含兩個部分，一部分為和模板配對部分，另一部分為和芯片探針互補配對部分。其中第二種探針，即包含通用探針互補配對探針是根據突變位點需要設計，它可以是兩根也可以是三根或者四根，探針中3'端為檢測位點。本發明主要是針對第一種標記探針進行改造，即在標記探針的5'端不直接進行化學標記，而引入一段特異性序列。同時設計一個通用的熒光標記探針，其序列和該特異性序列互補，通過這種方式，在雜交過程中實現熒光標記。在LDR反應結束后，將LDR產物和通用熒光探針點在基因芯片表面，此基因芯片表面點有與檢測探針特異性序列部分相配對的探針，根據雜交掃描結果判讀位點的多態性。具體的說，本發明的探針的設計及其運用包括以下步驟(1)探針設計①設計一種由10-25個堿基組成的通用熒光探針，該通用探針具有極高的特異性，在任何生物中找不到其同源相似的序列。②在要檢測的突變位點的前后各設計10-25堿基長度的序列，其中5'端上游序列是檢測探針，在3'端有檢測位點；3'端下游序列是標記探針。③據檢測探針的數量，針對每一根檢測探針設計不同的長度為15-25堿基的特異性序列和芯片上探針互補。在每個標記探針的3'端引入和通用熒光探針互補的序列。(2)PCR產物制備取待檢測DNAlial，PCR引物各10-30pmol，高溫聚合酶，高溫聚合酶混合液，相互混合，PCR反應條件為依次按94。C30秒，40。C-68。C30秒-2分鐘，60-72°C45秒-2分鐘為一次循環，共循環25-40次；(3)LDR產物制備取PCR產物取待檢測DNA探針各40fmol-10pmo1，連接酶，連接酶緩沖液，相互混合。LDR反應條件為依次按94。C30秒，40-70°C1-10分鐘，以45-60。C為最好作為一次循環，共循環l-40次；(4)結果檢測.取LDR產物l-5)al與l-10(al雜交液混合，點于基因芯片表面，用蓋玻片覆蓋，30-70°C恒溫10-60分鐘，用洗脫液洗脫l-30分鐘，掃描讀取結果。本發明的優點和效果與直接標記技術相比，本發明在檢測效果上具有相同的準確性和精確度。但是，運用本發明可以降低PCR-LDR聯合芯片技術的成本和節省探針合成的時間。'圖1為芯片點樣示意圖。圖2表示HBV1896野生型。圖3表示HBV1896突變型。圖4為芯片示意圖。圖5表示HBV病毒是1896野生型和YMDD野生型。圖6表示HBV病毒1896混合感染和YMDD/YIDD混合感染。圖7為芯片點樣示意圖。圖8為某樣本A的心血管相關基因的分型結果。圖9為某樣本B的心血管相關基因的分型結果。圖IO為芯片點樣示意圖。圖11為某樣本A的腫瘤化療藥物毒副作用相關基因的分型結果。圖12為某樣本B的腫瘤化療藥物毒副作用相關基因的分型結果。具體實施例方式下面結合實施例及其附圖對本發明做進一步說明。實施例一探針的設計以乙型肝炎病毒(HBV)DNA1896位點為例進行說明，1896位點附近序列為:5'GCTGTGCCTTGGGTGGCTTTG/AGGGCATGGACATTGACCCG3'1.引物和探針設計(1)引物設計<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>1、-游引物ACACAGAATAGCTTGCCTGAGTGCTGTATG30(2)通用標記探針Cy5-GATGTAATCCTCCGTAGTGTCGCA(3)標記探針<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注*表示探針需5'端磷酸化。(4)檢測探針一<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(2)通用標記探針Cy5-GATGTAATCCTCCGTAGTGTCGCA(3)標記探針<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注*表示探針需5'端磷酸化。(4)檢測探針一<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(5)檢測探針二<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2.PCR反應反應混合液為200nMdATP，200nMdTTP，200pMdCTP，200(aMdGTP，2mMMgCl2，2UTaqDNA聚合酶，各lpM的上下游引物，1^1基因組模板(濃度大于5ng4U)。反應條件為94°C30秒，60°C30秒，72°C45秒，循環30次。3.LDR反應反應混合液為20mMTris-HCl,pH8.3(at25。C)，50mMKCl，10mMMgCl2，lmMEDTA，lmMNAD+，10mMDTT，0.1%(v/v)TritonX-IOO，探針各0.01|liM,連接酶15U，lplPCR模板DNA。反應條件為94。C30秒，60°C2分鐘，循環30次。4.雜交取PCR產物4pl，加雜交液1(V1，98'C變性5分鐘，冰浴淬火，將混合液點在DNA芯片上，加蓋玻片，50'C恒溫30分鐘，洗脫液洗脫10分鐘，吹干后掃描，結果見圖4-圖6。■實施例三心血管疾病相關基因多態性檢測對心血管相關相關基因(ACE、AGT、ANP664、ALDH、AP0E112和APOE158)的SNP進行分型。1.引物和探針設計(1)普通PCR引物設計<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>2.PCR反應反應混合液為200pMdATP，20(VMdTTP，200(aMdCTP，200(iMdGTP，2mMMgCl2，2UTaqDNA聚合酶，各lpM的上下游引物，1^1基因組模板(濃度大于5ng小l)。反應條件為94°C30秒，60°C90秒，72°C60秒，循環35次。3.LDR反應反應混合液為20mMTris-HCl，pH8.3(at25。C)，50mMKCl，10mMMgCl2，lmMEDTA，lmMNAD+，10mMDTT，0.1%(v/v)TritonX-IOO，探針各0.01jiM，連接酶15U，l(ilPCR模板DNA。反應條件為94。C30秒，60°C2分鐘，循環30次。4.雜交取PCR產物4iul，加雜交液10pl，98。C變性5分鐘，冰浴淬火，將混合液點在DNA芯片上，加蓋玻片，50。C恒溫30分鐘，洗脫液洗脫10分鐘，吹千后掃描，結果見圖7-圖9及表1。表l心血管相關基因的分型結果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實施例四腫瘤化療藥物毒副作用相關基因多態性檢測對腫瘤化療藥物毒副作用相關基因(GSTM1、DPD、UGT1A1、XRCC1、MTHFR、TPMT和GSTP1)的SNP進行分型。(1)普通PCR引物設計<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>(5)檢測探針二<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>反應混合液為200pMdATP，200pMdTTP,200pMdCTP，200pMdGTP，2mMMgCl2,2UTaqDNA聚合酶，各lpM的上下游引物，基因組模板(濃度大于5ng/|al)。反應條件為94°C30秒，58°C卯秒，64°C90秒，循環30次。3.LDR反應反應混合液為20mMTris-HCl,pH8.3(at25。C)，50mMKCl，10mMMgCl2，ImMEDTA，lmMNAD+，lOmMDTT，0.1%(v/v)TritonX-100,探針各0.01iaM，連接酶15U，1(^1PCR模板DNA。反應條件為94。C30秒，60°C2分鐘，循環30次。4.雜交取PCR產物4pl，加雜交液10pl，98'C變性5分鐘，冰浴淬火，將混合液點在DNA芯片上，加蓋玻片，5(TC恒溫30分鐘，洗脫液洗脫10分鐘，吹干后掃描，結果見圖IO-圖12及表2。表2腫瘤化療藥物毒副作用相關基因分型結果<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>權利要求1、一種通用熒光標記探針在PCR-LDR基因單核苷酸多態性芯片上的應用，其特征在于所述應用包括下列步驟(1)探針設計①設計一種由10-25個堿基組成的通用熒光探針，該通用探針具有極高的特異性，在任何生物中找不到其同源相似的序列；②在要檢測的突變位點的前后各設計10-25堿基長度的序列，其中5’端上游序列是檢測探針，在3’端有檢測位點；3’端下游序列是標記探針；③據檢測探針的數量，針對每一根檢測探針設計不同的長度為15-25堿基的特異性序列和芯片上探針互補；④在每個標記探針的3’端引入和通用熒光探針互補的序列；(2)PCR產物制備取待檢測DNA1μl，PCR引物各10-30pmol，高溫聚合酶，高溫聚合酶混合液，相互混合，PCR反應條件為依次按94℃30秒，40℃-68℃30秒-2分鐘，60-72℃45秒-2分鐘為一次循環，共循環25-40次；(3)LDR產物制備取PCR產物1μl取待檢測DNA1μl，探針各40fmol-10pmol，連接酶，連接酶緩沖液，相互混合。LDR反應條件為依次按94℃30秒，40-70℃1-10分鐘，以45-60℃為最好作為一次循環，共循環1-40次；(4)結果檢測取LDR產物1-5μl與1-10μl雜交液混合，點于基因芯片表面，用蓋玻片覆蓋，30-70℃恒溫10-60分鐘，用洗脫液洗脫1-30分鐘，掃描讀取結果。全文摘要本發明公開了一種通用熒光標記探針在PCR-LDR基因SNP單核苷酸多態性芯片上的應用。本發明的應用包括探針設計、PCR產物制備、LDR產物制備及結果檢測等步驟。本發明的探針包括標記探針和檢測探針，由于對標記探針進行改造，可以不直接進行化學標記，因而，能降低PCR-LDR聯合芯片技術的成本和節省探針合成時間，檢測結果達到用直接標記技術檢測的準確性和精確度。文檔編號C12Q1/68GK101358231SQ200710044388公開日2009年2月4日申請日期2007年7月31日優先權日2007年7月31日發明者肖君華,炯陸,陳軼群申請人:上海翼和應用生物技術有限公司