專利名稱：重組人載脂蛋白ai米蘭突變體在畢赤酵母中的表達方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種人載脂蛋白AI米蘭突變體 (Aoplipoproteinl-milano,AIM)的基因工程表達方法。
技術背景人載脂蛋白AI米蘭突變體(AIM)是ApoAI的天然突變體，首次發現于意大利米蘭 地區一個村莊的部分居民中，其血漿中HDL上的ApoAI發生變異，即第173位的Arg突 變成Cys。迄今已發現該家族有40余名AIM攜帶者，盡管這些居民血漿中HDL水平很低， 甘油三酯水平相當高，卻很少患心血管疾病，而且很長壽。研究發現含有AIM的HDL能 提高膽固醇反向轉運(RCT)效率。在HDL上70XCys形成鍵間二硫鍵，30% Cys的巰 基仍以游離態存在。AIM通過鍵間二硫鍵的形成，能導致同源二聚體載脂蛋白AIM/AIM 或異源二聚體載脂蛋白AIM/ApoAII的產生。AIM二聚體的形成使得分子間交聯折疊，形 成一個新的結構域，結合脂的能力大大增強，且AIM 二聚體與ApoAI單體相比，其緊密 型和穩定性更好，在血漿中的半衰期也更長。由AIM與磷脂結合形成的HDL與天然的HDL 相比較，前者對LCAT的激活作用還稍有增強。迄今為止大量的動物和臨床試驗顯示，重組AIM具有比ApoAI更強的抗動脈粥樣硬 化的功能，有可能成為治療和預防動脈粥樣硬化癥的新藥，具有臨床應用前景。2006年美 國洛杉磯Cedars—Sinai醫學中心的研究者，通過對ApoE和ApoAI雙缺陷型小鼠進行骨髓 移植，使之可表達ApoAI或者AIM，之后小鼠被喂食高膽固醇食物，24周后經解剖觀察 到能表達AIM的小鼠動脈粥樣硬化斑塊減少了 65% ，而表達野生型ApoAI的僅減少25 % 。 另據報道美國Esperion公司為治療和預防動脈粥樣硬化癥而研制的藥物ETC-216(即重組AiM/磷脂復合物)，已進入m期臨床試驗。我國有近1億人口患有動脈粥樣硬化疾病，而美國和歐洲則有多達1/3的人口患有此 病，該病已成為全世界發病率最高、預防和治療花費最多的病種之一，因此抗動脈粥樣硬 化的藥物研究正在引起重視。由于AIM不能從血漿中提取，必須依賴基因工程方法進行生 產。然而由于AIM的C末端序列對蛋白酶極其敏感，因此用基因工程方法表達重組人 AIM(Raim)時，極易發生該蛋白C末端的部分降解。國內有人嘗試用大腸桿菌表達系統來 表達rAIM，但表達的rAIM蛋白主要的以包涵體形式存在，而且會發生降解而得不到全長 rAIM，從而失去其重要的生物功能。畢赤酵母表達系統具有真核生物的翻譯后加工的特點，
且發酵條件簡單，表達水平高，表達產物活性好，因此本發明選用畢赤酵母分泌表達系統 進行rAIM的表達研究，通過對酵母工程菌搖瓶培養條件的優化，使rAIM的降解得到有 效抑制，其表達水平約為70mg/L發酵液，其中全長rAIM所占比例約為80%。目前在國 內外均未見采用畢赤酵母表達rAIM的報道。 發明內容本發明目的是提供一種用基因工程技術高效表達rAIM的方法。本發明提出的用基因工程技術高效表達rAIM的方法，具體是采用DNA定點突變和 DNA重組技術構建畢赤酵母重組工程菌株，經搖瓶培養和誘導，SDS-PAGE、 Western blot 鑒定，證明工程菌能高效分泌表達rAIM;對工程菌的搖瓶培養基和培養條件進行優化后， 發酵上清液中有明顯的rAIM表達，且rAIM的降解得到有效控制；用冷丙酮沉淀法部分 純化了工程菌發酵液中的表達產物rAIM，并驗證了其與磷脂結合的活性。本發明的具體操作步驟如下1重組表達質粒的構建采用重組PCR法對pPIC9k-apoAI質粒(詳見生物工程學報，2004,20(6):906-9")進行 定點突變得到重組表達質粒pPIC9k-apoAI-milano，使apoAI cDNA的第173位Arg的密 碼子(CGC)突變成Cys的密碼子(TGT)。2酵母工程菌株的篩選重組表達質粒pPIC9K-apoAI-milano經Sgr/ll酶切線性化后，電轉化到畢赤酵母 GS115。轉化子經G418抗性篩選，獲得高抗性菌株。高抗性菌株經搖瓶培養和誘導， SDS-PAGE鑒定，證明能高效分泌rAIM。3酵母工程菌株的搖瓶培養將高表達的酵母工程菌株接種于BMGY培養基中，培養后分別轉入常規的BMMY培 養基或經過優化的BMMY培養基中進行甲醇誘導。4 rAIM的SDS-PAGE、 Western blot鑒定取發酵上清液作SDS-PAGE、 Western blot鑒定，證明發酵上清液中有明顯的rAIM 表達。5 rAIM的部分純化采用冷丙酮沉淀法部分純化酵母工程菌發酵上清液中的表達產物rAIM。 6rAIM與磷脂結合能力的分析通過rAIM與脂質DMPC (1,2-豆蔻酰磷脂酰膽堿)結合試驗，證明酵母工程菌表達
的rAIM具有磷脂結合活性。鑒于人載脂蛋白Al米蘭突變體具有比ApoAI更強的抗動脈粥樣硬化的功能，有廣闊 的臨床應用前景，因此采用畢赤酵母分泌表達系統成功表達rAIM，為今后用基因工程方法 生產rAIM積累了經驗。
圖1為本發明的重組表達質粒pPIC9K-apoAI-milano經Xhol、 EcoRI雙酶切后DNA 電泳鑒定1、化b ladder; 2、 pPIC9K-apoAI陽milano經Xhol、 EcoRI雙酶切。圖2為本發明apoAI-milano cDNA在畢赤酵母染色體上AOX1位點的雙交換整合。圖3為本發明的rAIM rAIM用常規方法(a)和優化方法(b)表達的SDS-PAGE,Western blot鑒定1.人血漿ApoAI; 2.酵母工程菌的發酵上清液3. GS115發酵上清液。圖4本發明的rA頂與脂質匿PC的結合曲線。
具體實施方式
實施例l重組表達質粒的構建和鑒定重組質粒pPIC9k-apoAI-milano是采用重組PCR法對pPIC9k-apoAI質粒進行定點突 變后得到，使cDNA的第173位Arg的密碼子(CGC)突變成Cys的密碼子(TGT),突變序列經 過測序驗證。突變后的apoAI-milano cDNA插在pPIC9k的X/ o1、 EcoRI位點上，大小約為 747bp。實施例2酵母工程菌株的篩選和鑒定重組表達質粒pPIC9K-apoAI-milano DNA經Sg/ll酶切后，與畢赤酵母GS115感受態細 胞混合，在電壓1300V，電阻200Q,電容25uF條件下電擊轉化，涂布RDB平板，30°C 培養3天，得到1500多個轉化子。轉化子經G418抗性篩選，獲得在含G418 4mg/ml平板上 仍能生長的高抗性轉化子23個。通過搖瓶培養和SDS-PAGE鑒定，從G418高抗性轉化子 篩選得到能分泌表達rAIM的酵母工程菌20株。實施例3酵母工程菌的誘導表達按常規方法，將酵母工程菌株接種于3ml BMGY培養基的試管中，3CTC振蕩培養 18h 。將取1m睹養物種接于含50ml BMGY培養基中，3CTC振蕩培養24h，于室溫6000r/min 離心6min，收集菌體。將菌體轉移到15ml BMMY培養基中，3CTC振蕩培養72h，每隔24h 補加一次甲醇。取發酵上清液作SDS-PAGE和Western blot鑒定，發現工程菌按常規方法 培養和誘導，其表達產物rAIM會發生部分降解，它的分子量比人血漿ApoAI (28.3KD)稍 小，約23KD。進一步，本發明還對BMMY培養基和培養條件的進行優化，即用KOH將BMM丫培養基
的pH調節到6.9-7.1，蛋白胨的用量從原來占培養基質量的20/。增加到3.9%-4.1%，并添加 原培養基體積0.8-1.2。/。的Arg和Ala(w/v)以及4.5-.5.5mmol/L的EDTA，誘導時將溫度從原來 的30。C降低至24-26。C，誘導時間為70-75小時。結果rAIM的表達水平可達到70mg/L左右， 其中全長rAIM (28.3KD)所占比例約80%， rAIM的降解得到有效控制。通過SDS — PAGE 和Westem blot鑒定，初步證明rAIM的分子質量與人血漿提取ApoAI相同。 實施例4 rAIM的Westem blot鑒定將電泳后的SDS — PAGE凝膠剝離，電轉移到PVDF膜上，PVDF膜用5X脫脂牛奶封 閉；加入一抗(Rabbit anti—Human ApolipoproteinAI)， 37。C振蕩1h，洗滌2次;加入二 抗(Goat anti—Rabbit IgG， Alkaline phosphatase conjugated), 37。C振蕩1h，洗滌1次； 用底物緩沖液洗滌1次；在10m喊性磷酸酶底物緩沖液中加入33ulBCIP和66ulNBT，將 PVDF膜浸入，37。C顯色3min;用水沖洗終止反應。實施例5冷丙酮法部分純化rAIM發酵上清液于《C， 10000r/min離心10min，加入一2(TC預冷的丙酮，使丙酮濃度(v/v) 達到60%。攪拌均勻后，在一20'C冰箱中靜置過夜，于4。C， 12000r/min離心20min,收 集沉淀。沉淀用1/10原發酵上清液體積的0.5XPBS洗滌、吹打。室溫12000r/min離心 20min，收集沉淀。將沉淀再用1/20原發酵上清液體積的0.5XPBS重復洗滌，收集上清液。實施例6 rAIM與磷脂結合能力的分析將DMPC干粉懸于0.5XPBS溶液中，在漩渦振蕩器上劇烈振蕩，以形成多層脂質體， 分別將rAIM和人血漿ApoAI樣品用0.5XPBS溶解，使反應體系中載脂蛋白與DMPC的質量 比為1: 2。分別將載脂蛋白溶液與DMPC溶液在24。C水溶液中溫育，然后立即混合液體， 室溫下測定325nm的吸光值A325。每隔10min測定一次，連續測2h，重復3次。結果表明， 用優化方法表達后得到的rAIM，其與磷脂結合的量和人血漿ApoAI相比十分接近，這說明 在畢赤酵母中表達的rAIM具有磷脂結合活性。
權利要求
1.一種重組人載脂蛋白AI米蘭突變體在畢赤酵母中分泌表達的方法，其特征是將apoAI-milano cDNA插入表達載體pPIC9k；經Bg/II酶切后電擊導入畢赤酵母GS115中，獲得重組工程菌株；在BMMY培養基中進行搖瓶培養和甲醇誘導，實現rAIM的分泌表達。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于具體操作步驟如下(1) 構建重組表達質粒通過重組PCR方法對pPIC9k-apoAI質粒進行定點突變得到重組表達質粒 pPIC9k-apoAI-milano，使apoAI cDNA的第173位Arg的密碼子CGC突變成Cys的密碼子 TGT，突變的DNA序列經測序驗證；突變后的apoA卜milano cDNA插在pPIC9k的X/ o I 和Ecof I位點上，大小約為747bp;(2) 篩選酵母工程菌將重組表達質粒pPIC9k-apoAI-milano經Sg/n酶切，電擊轉化畢赤酵母GS115，在 RDB平板上獲得轉化子；轉化子在含G418的YPD平板上進行G418抗性篩選，獲得高抗性 菌株；通過搖瓶發酵和SDS — PAGE檢測，篩選得到能分泌表達rAIM的酵母工程菌株；(3) 酵母工程菌株的誘導表達將高表達的酵母工程菌株接種于BMGY培養基中，培養后分別轉入常規的BMMY培養 基或經過優化的BMMY培養基中進行甲醇誘導；這里所述優化的BMMY培養基中誘導;是指 用KOH將BMMY培養基的pH調節到6.9-7.1,蛋白胨的用量為BMMY培養基質量的 3.9-4.1%;并添加Arg和Ala以及EDTA，添加量Arg和Ala為BMMY的0.8-1.2。/。r W/V， EDTA 為4.5-5.5mmol/L，誘導溫度為24-26"，誘導時間為70-75小時。
全文摘要
本發明屬于生物工程技術領域，具體為一種重組人載脂蛋白AI米蘭突變體(rAIM)在畢赤酵母中分泌表達的方法。將突變后的apoAI-milano cDNA插入表達質粒pPIC9k，電擊導入畢赤酵母GS115，通過對搖瓶培養基和培養條件的優化，發酵上清液中有明顯的rAIM表達，其分子量與人血漿中提取的ApoAI相同。純化后的rAIM具有磷脂結合活性。
文檔編號C12N1/19GK101126088SQ20071004402
公開日2008年2月20日 申請日期2007年7月19日 優先權日2007年7月19日
發明者宋大新, 彥 張, 趙志安, 江 鐘 申請人:復旦大學