專利名稱：用誘導培養基鏈球菌制備磷酸甘油氧化酶的方法
技術領域：
本發明涉及一種生產氧化酶的方法，特別是一種用誘導培養基生產磷酸甘油氧化酶的方法。
背景技術：
血清中甘油三酯的含量被確認為是高血脂和心臟病的臨床診斷中一個重要指標。磷酸甘油氧化酶法測定甘油三酯含量，具有高度特異性、微量、簡便、快速和實現儀器自動化測定等優點，而曾被中華醫學會檢驗分會推薦作為臨床實驗室測定血清甘油三酯的常規方法[1，2]。磷酸甘油氧化酶(L-a-Glycerophosphate Oxidase，GPO，EC 1.1.3.21)，又名甘油磷酸氧化酶，是甘油三酯試劑盒測定反應中最后一個酶，要求它具有更高的專一性、酶活性和比活性。目前國內對此酶的研究和開發報道極少。1997年中國科學院微生物研究所馮詠梅等報道了磷酸甘油氧化酶的菌種選育及發酵條件的研究，此后未見相關方面的研究報道。也無商品酶制劑出售。
發明內容
本發明的目的是提供一種將利用分離得到的鏈球菌Streptococcus SP.在菌體培養過程中找到菌種培養的最佳條件，并利用此培養生產過程得到可顯著提高產酶量和酶的穩定性的甘油磷酸氧化酶的方法。
本發明是一種用誘導培養基生產磷酸甘油氧化酶的方法，將利用分離得到的鏈球菌置于含有甘油的誘導培養基中培養，經分離純化得到甘油磷酸氧化酶，其特征在于一、鏈球菌株的培養基組成重量百分比斜面誘導培養基酵母提取物0.5-2.5，蛋白胨1.0-2.0，葡萄糖0.05-0.5，磷酸氫二鉀0.2-0.8，甘油0.1-0.5，瓊脂1.5-3.0，硫酸鎂4，氯化錳1，氯化鈉20，pH6.8的混合鹽溶液0.1-0.4毫升；種子培養基酵母提取物0.5-2.5，蛋白胨1.0-2.0，葡萄糖0.1-0.8，磷酸氫二鉀0.2-0.8，甘油0.1-0.5，硫酸鎂4，氯化錳1，氯化鈉20，pH6.8的混合鹽溶液0.1-0.4毫升；發酵培養基酵母提取物0.5-2.5，蛋白胨1.0-2.0，磷酸氫二鉀0.5-2.0，甘油0.1-0.5，硫酸鎂4，氯化錳1，氯化鈉20，pH6.8的混合鹽溶液0.1-0.4毫升；二、菌株的培養條件菌株在25-32℃斜面培養基上培養18-28小時后，接入種子培養基，25-32℃振蕩，200轉/分鐘，培養18-24小時，將種子液按5-10％比例接入發酵培養基中，25-32℃，200轉/分鐘，旋轉搖床上培養18-28小時；三、將上述條件下培養的菌液按照以下條件進行分離純化聚乙二醇-硫酸銨雙水相體系萃取在4℃，將發酵液10,000轉/分鐘，離心10分鐘，收集菌體，用20毫摩爾pH7.5三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液洗滌菌體3次，按1克菌體加入4毫升pH7.5三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液的比例懸浮菌體，在低溫，50kHz，600W超聲波破碎，破碎3次，每次破碎3秒，間隙2秒，5分鐘/次，持續15分鐘，破碎液于4℃下，12,000轉/分鐘，離心5分鐘，收集破碎液上清，測定蛋白質含量。然后進行雙水相體系萃取。雙水相組成在16.5％聚乙二醇2000，13.2％(NH4)2SO4，pH7.5，磷酸甘油氧化酶在上相的收率為90％，分配系數為1.0，純化倍數為7倍；二乙基氨基乙基-瓊脂糖凝膠FF柱層析用pH750.0毫摩爾三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液充分平衡柱，上樣，用同樣緩沖液洗雜蛋白，然后以0～0.5摩爾NaCl，pH750毫摩爾三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸進行直線梯度洗脫，分步收集，通過檢測，收集酶活性峰部分；黃素腺嘌呤二核苷酸-瓊脂糖凝膠親合柱層析層析柱床體積5.0毫升，用3毫摩爾α-巰基乙醇的pH750.0毫摩爾硼酸緩沖液充分平衡，樣品上柱后，用含上述平衡緩沖液充分洗脫雜蛋白，然后用含黃素腺嘌呤二核苷酸的pH750.0毫摩爾硼酸緩沖液洗脫，收集酶活性峰部分。
本發明通過大量科學試驗，在實踐中不斷總結、提高，給出了培養基配方、溫度、酸堿度、采酶時間等關鍵工藝技術，本方法具有產酶量高、酶的穩定性好、酶的提取和分離純化過程簡化等優點。
具體實施例方式實施例1、一、制作培養基(重量百分比)斜面誘導培養基(％)酵母提取物2.5，蛋白胨2.0，葡萄糖0.5，磷酸氫二鉀0.8，甘油0.5，瓊脂3.0，硫酸鎂4，氯化錳1，氯化鈉20，pH6.8的混合鹽溶液0.4毫升；種子培養基(％)酵母提取物2.5，蛋白胨2.0，葡萄糖0.8，磷酸氫二鉀0.8，甘油0.5，硫酸鎂4，氯化錳1，氯化鈉20，pH6.8的混合鹽溶液0.4毫升；發酵培養基(％)酵母提取物2.5，蛋白胨2.0，磷酸氫二鉀2.0，甘油0.5，硫酸鎂4，氯化錳1，氯化鈉20，pH6.8的混合鹽溶液0.4毫升；二、培養菌株將菌株置于32℃斜面培養基上培養28小時后，接入種子培養基，32℃，200轉/分鐘，振蕩培養24小時。將種子液按10％比例接入發酵培養基中，32℃，200轉/分鐘，旋轉搖床上培養28小時。
三、菌體破碎將發酵液按照5000轉/分鐘，離心10分鐘，收集菌體，用生理鹽水洗滌兩次。稱取菌體濕重，并按重量/體積＝1∶4的比例懸浮在50毫摩爾pH8.5硼酸-硼砂緩沖液中，冰浴條件下超聲波50kHz，600W破碎3次，每次破碎5秒，間隙3秒，持續30分鐘，破碎液于4℃下離心12000轉/分鐘，離心15分鐘，棄沉淀，得到粗級抽提液。
四、將上述條件下培養的菌液按照以下條件進行分離純化聚乙二醇-硫酸銨雙水相體系萃取按1克菌體加5毫升pH8.5 50.0毫摩爾三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，加適量溶菌酶懸浮菌體，超聲波破碎3分鐘，2～4℃。破碎液經12,000轉/分鐘，離心10分鐘，收集上清，測定蛋白質含量。然后進行雙水相體系萃取。
二乙基氨基乙基-瓊脂糖凝膠FF柱層析柱規格2.6cm×7.0cm，用pH7 50.0毫摩爾三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液充分平衡。上樣流速1.5毫升/分鐘，上樣畢，用同樣緩沖液流速4.0毫升/分鐘洗雜蛋白。然后以0～0.5摩爾NaCl，pH7 50毫摩爾三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液進行直線梯度洗脫，流速2.0毫升/分鐘。通過檢測，收集酶活性峰部分。
黃素腺嘌呤二核苷酸-瓊脂糖凝膠親和層析層析柱床體積5.0毫升，用3毫摩爾α-巰基乙醇的pH7 50.0毫摩爾硼酸緩沖液充分平衡。樣品上柱后，用含上述平衡緩沖液充分洗脫雜蛋白。然后用含黃素腺嘌呤二核苷酸的pH7 50.0毫摩爾硼酸緩沖液洗脫，流速10.0毫升/小時，收集酶活性峰部分。
實施例2一、制作培養基(％)斜面誘導培養基酵母提取物0.5，蛋白胨1.0，葡萄糖0.05，磷酸氫二鉀0.2，甘油0.1，瓊脂1.5，硫酸鎂4，氯化錳1，氯化鈉20，pH6.8的混合鹽溶液0.1毫升；種子培養基酵母提取物0.5，蛋白胨1.0，葡萄糖0.1，磷酸氫二鉀0.2，甘油0.1，硫酸鎂4，氯化錳1，氯化鈉20，pH6.8的混合鹽溶液0.1毫升；發酵培養基酵母提取物0.5，蛋白胨1.0，磷酸氫二鉀0.5，甘油0.1，硫酸鎂4，氯化錳1，氯化鈉20，pH6.8的混合鹽溶液0.1毫升；二、培養菌株菌株在25℃斜面培養基上培養18小時后，接入種子培養基，25℃，200轉/分鐘，振蕩培養18小時。將種子液按10％比例接入發酵培養基中，25℃，200轉/分鐘旋轉搖床上培養18小時。
三、將上述條件下培養的菌液按照以下條件進行分離純化分離純化與實施例1相同。
實施例3一、制作培養基(％)斜面誘導培養基酵母提取物1.0，蛋白胨1.5，葡萄糖0.25，磷酸氫二鉀0.5，甘油0.12，瓊脂2.0，硫酸鎂4，氯化錳1，氯化鈉20，pH6.8的混合鹽溶液0.2毫升；種子培養基酵母提取物0.5，蛋白胨1.0，葡萄糖0.5，磷酸氫二鉀0.5，甘油0.1，硫酸鎂4，氯化錳1，氯化鈉20，pH6.8的混合鹽溶液0.2毫升；發酵培養基酵母提取物0.5，蛋白胨1.0，磷酸氫二鉀2.0，甘油0.1，硫酸鎂4，氯化錳1，氯化鈉20，pH6.8的混合鹽溶液0.2毫升；二、培養菌株菌株在30℃斜面培養基上培養22小時后，接入種子培養基，30℃200轉/分鐘，培養20小時。將種子液按10％比例接入發酵培養基中，30℃，200轉/分鐘，旋轉搖床上培養22小時。
三、將上述條件下培養的菌液按照以下條件進行分離純化分離純化與實施例1相同。
實施例4一、制作培養基(％)斜面誘導培養基酵母提取物0.5，蛋白胨2.0，葡萄糖0.3，磷酸氫二鉀0.4，甘油0.5，瓊脂2.0，硫酸鎂4，氯化錳1，氯化鈉20，pH6.8的混合鹽溶液0.3毫升；種子培養基酵母提取物2.0，蛋白胨2.0，葡萄糖0.3，磷酸氫二鉀0.6，甘油0.5，硫酸鎂4，氯化錳1，氯化鈉20，pH6.8的混合鹽溶液0.2毫升；發酵培養基酵母提取物2.3，蛋白胨1.4，磷酸氫二鉀1.0，甘油0.4，硫酸鎂4，氯化錳1，氯化鈉20，pH6.8的混合鹽溶液0.4毫升；二、培養菌株菌株在30℃斜面培養基上培養18小時后，接入種子培養基，30℃，200轉/分鐘，振蕩培養24小時。將種子液按5-10％比例接入發酵培養基中，30℃，200轉/分鐘，旋轉搖床上培養24小時。
三、將上述條件下培養的菌液按照以下條件進行分離純化分離純化與實施例1相同。
按照本發明方法制備的磷酸甘油氧化酶經檢測，結果如下比活18.0-20.0國際單位/毫克純化倍數＞200.0回收率 ＞22％
高壓液相色譜顯示 純度大于98％還原/非還原條件下，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳單一蛋白著色帶。
權利要求
1.用誘導培養基鏈球菌制備磷酸甘油氧化酶的方法，將利用分離得到的鏈球菌置于含有甘油的誘導培養基中培養，經分離純化得到甘油磷酸氧化酶，其特征在于一、鏈球菌株的培養基組成重量百分比斜面誘導培養基酵母提取物0.5-2.5，蛋白胨1.0-2.0，葡萄糖0.05-0.5，磷酸氫二鉀0.2-0.8，甘油0.1-0.5，瓊脂1.5-3.0，硫酸鎂4，氯化錳1，氯化鈉20，pH6.8的混合鹽溶液0.1-0.4毫升；種子培養基酵母提取物0.5-2.5，蛋白胨1.0-2.0，葡萄糖0.1-0.8，磷酸氫二鉀0.2-0.8，甘油0.1-0.5，硫酸鎂4，氯化錳1，氯化鈉20，pH6.8的混合鹽溶液0.1-0.4毫升；發酵培養基酵母提取物0.5-2.5，蛋白胨1.0-2.0，磷酸氫二鉀0.5-2.0，甘油0.1-0.5，硫酸鎂4，氯化錳1，氯化鈉20，pH6.8的混合鹽溶液0.1-0.4毫升；二、菌株的培養條件菌株在25-32℃斜面培養基上培養18-28小時后，接入種子培養基，25-32℃振蕩，200轉/分鐘，培養18-24小時，將種子液按5-10％比例接入發酵培養基中，25-32℃，200轉/分鐘，旋轉搖床上培養18-28小時；三、將上述條件下培養的菌液按照以下條件進行分離純化聚乙二醇-硫酸銨雙水相體系萃取在4℃，將發酵液10,000轉/分鐘，離心10分鐘，收集菌體，用20毫摩爾pH7.5三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液洗滌菌體3次，按1克菌體加入4毫升pH7.5三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液的比例懸浮菌體，在低溫，50kHz，600W超聲波破碎，破碎3次，每次破碎3秒，間隙2秒，5分鐘/次，持續15分鐘，破碎液于4℃下，12,000轉/分鐘，離心5分鐘，收集破碎液上清，測定蛋白質含量。然后進行雙水相體系萃取。雙水相組成在16.5％聚乙二醇2000，13.2％(NH4)2SO4，pH7.5，磷酸甘油氧化酶在上相的收率為90％，分配系數為1.0，純化倍數為7倍；二乙基氨基乙基-瓊脂糖凝膠FF柱層析用pH7 50.0毫摩爾三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液充分平衡柱，上樣，用同樣緩沖液洗雜蛋白，然后以0～0.5摩爾NaCl，pH7 50毫摩爾三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸進行直線梯度洗脫，分步收集，通過檢測，收集酶活性峰部分；黃素腺嘌呤二核苷酸-瓊脂糖凝膠親合柱層析層析柱床體積5.0毫升，用3毫摩爾α-巰基乙醇的pH7 50.0毫摩爾硼酸緩沖液充分平衡，樣品上柱后，用含上述平衡緩沖液充分洗脫雜蛋白，然后用含黃素腺嘌呤二核苷酸的pH7 50.0毫摩爾硼酸緩沖液洗脫，收集酶活性峰部分。
全文摘要
本發明是用誘導培養基鏈球菌制備磷酸甘油氧化酶的方法。培養基組分及培養條件斜面誘導培養基由酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖、磷酸氫二鉀、甘油、瓊脂、硫酸鎂、氯化錳、氯化鈉、pH6.8的混合鹽溶液構成；種子培養基由酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖、磷酸氫二鉀、甘油、硫酸鎂、氯化錳、氯化鈉、pH6.8的混合鹽溶液構成；發酵培養基由酵母提取物、蛋白胨、磷酸氫二鉀、甘油、硫酸鎂、氯化錳、氯化鈉、pH6.8的混合鹽溶液構成。菌株經斜面培養，種子培養，旋轉搖床發酵培養，再進行放大培養后收集菌體，采用聚乙二醇－硫酸銨雙水相萃取和兩步層析純化即得到磷酸甘油氧化酶。
文檔編號C12R1/46GK101070529SQ200710049088
公開日2007年11月14日 申請日期2007年5月14日 優先權日2007年5月14日
發明者王騰, 孟延發 申請人:王騰, 孟延發