專利名稱：一種雞白細胞介素1β基因及其真核表達質粒構建及免疫效應的制作方法
一種雞白細胞介素i e基因及其真核表達質粒構建及免疫效應[技術領域]本發明涉及動物醫藥生物工程領域，是一種雞白細胞介素ie基因及其真 核表達質粒與應用。[背景技術]細胞因子作為機體內細胞之間相互作用的主要介質，在機體的免疫應答、炎癥反應、造血功能、胚胎發育及機體的生長發育等各個方面都起重要作用。20世紀80年 代以來，隨著細胞因子的研究進展，人們逐漸認識到細胞因子的免疫增強作用。細胞因子對 免疫細胞的分化和增殖、抗原的識別和提呈、抗體的產生和調節、免疫細胞之間的聯絡等一 系列從識別到效應的免疫應答過程都有極其重要的作用。可以說細胞因子對于免疫系統就如 激素對于內分泌系統，神經遞質對神經系統一樣重要。細胞因子控制著疫苗免疫和病原微生 物感染機體后免疫應答的類型和方向，其對免疫應答的調節方式最為接近機體正常的調節機 理，細胞因子作為疫苗增強劑具有其他佐劑無法比擬的優點。白細胞介素l (IL-1)是一種主要由單核細胞、巨噬細胞合成分泌的蛋白多肽，是細胞因 子的一種。IL-l有兩個分子亞型(IL-la、 IL-ip)，這兩個亞型之間氨基酸序列有很大差別，但 他們識別同一個受體功能基本相同。哺乳動物IL-l由p和l3兩條鏈組成，具有廣譜的免疫和非 免疫活性。1982年HayariY第一次證實了雞IL-l(CML-l)的存在，用脂多糖刺激雞的脾細胞， 在其細胞上清中檢測到IL-1樣生物活性物質，雞IL-1樣活性最初發現于受刺激的脾細胞條件 培養基中。Klasking等將其部分純化后發現，雞IL-1對鼠胸腺細胞具有微弱的刺激活。也能微 弱地誘導對鼠L-M細胞的殺傷活性。1998年，Weining等利用LPS刺激HD-11細胞，構建cDNA文庫，對所得到的克隆進行功 能表達，成功地克隆了雞的編碼ChIL-lp (Chicken IL-lp)cDNA。 ChIL-lpcDNA最初的翻譯產 物含267個氨基酸，與人IL-ip的氨基酸同源性為250/。。類似哺乳動物的IL-1(3，也缺少信號肽， 可能是先合成無活性的前體分子，然后剪切成有活性的分子。其在大腸桿菌中的表達產物接 種雞，可明顯誘導血清皮質醇(corticosterone.) —過性的增加。另夕卜，Byme等報道，雞IL-1(3 在抗球蟲感染的免疫反應中具有重要作用。Brezinschek等報道雞IL-l分子量在16-21.5kDa不等，但也有人報道其分子量為5kDa,目前 國內關于IL-ip基因的研究比較少，關于其免疫佐劑效應的研究更少。2003年張永霞等[52]克隆 IL-l(3與pUC19載體連接，用地高辛隨機引物法標記IL-lpcDNA制備探針，原位雜交檢測禽腦 脊髓炎病雞與正常雞腦組織中IL-lpmRNA表達情況，結果表明腦炎病雞腦中IL-ipmRNA 表達水平高于正常雞。2004年邵衛星等，盧建紅等克隆了IL-1I3基因，以雞痘病毒(FPV)為活 載體，構建了表達ChlL-l(3的重組雞痘病毒rFPV-IL-ip。應用XTT / PMS方法檢測rFPV-IL-l卩感染的成纖維細胞72h后表達ChlL-ip的生物活性，效價為l. 0xl05U/mI ，證明FPV能有效 地表達CML-lj3。 2006年邵衛星等在新城疫LaSota疫苗免疫不全的情況下，重組雞痘病毒(rFPV)表達的IL-lp、 IL-2和髓細胞生長因子(MGF)是否具有免疫增強作用。IO日齡SPF 雞隨機分成8組(1 Vin)，每組18只，每只接種l個半數保護劑量(PD50)的LaSota疫苗， 同時免疫不同劑量的表達雞IL-ip、 IL-2或cMGF的rFPV (rFPV-IL-lp、 IL-2、 cMGF)。結果 表明，rFPV表達的IL-l(3、 IL-2或cMGF可以消除雞痘病毒在免疫早期對雛雞體重增長的影響； 一定劑量的IL-1(3和IL-2可使雞脾臟中CD4+T細胞和CD8+T細胞的總體水平提高；免疫21d后 用新城疫的F48E8強毒經肌肉攻毒。 一定劑量的IL-ip和IL-2能提高La Sota疫苗的免疫保護率。 本研究表明rFPV表達的IL-ip和IL-2在一定的劑量下可以增強LaSota疫苗的免疫效果，具有免 疫增強作用。與其他細胞因子相比較，IL-ie在細胞因子網絡中屬于參與免疫應答早期階段 的細胞因子，且有研究表明，IL-ie可能是細胞因子網絡功能形成的中心，促進胸腺細胞、T 細胞的活化、增殖和分化，促進多種細胞因子(如IL-2、 IFN-Y等)的分泌，在抗細胞內病 原體的感染中起著關鍵的作用，因此IL-1 e是具有較好應用前景的免疫佐劑。 [發明內容l本發明根據Genbank中注冊的雞白細胞介素ie基因序列設計引物，以IL-1 P 基因的重組質粒PCIL-為模板，用PCR方法擴增雞白細胞介素ie基因，并將PCR產物經 BamH I和EcoR I雙酶切定向插入以BamH I和EcoR I雙酶切處理的真核表達載體pcDNA3. 1 (+)中，經雙酶切和PCR鑒定，構建了雞白細胞介素ie成熟基因真核表達質粒，研制了分子佐劑pDNAIL-ip。該分子佐劑pDNAIL-ip可用于作為預防雞傳染病DNA疫苗的佐劑。 [具體實施方式
l1. 本發明使用的真核表達載體pcDNA3. 1 ( + )為Invitrogen公司的產品。雞白細胞介素lp 基因的重組質粒PCIL-1 e為四川大學動物疾病防控生物工程研究中心克隆并保存。使用的限 制性內切酶EcoRI 、 BamHI ， T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶等均購自成都天泰生命科技有限公司。2. 引物是根據Genbank上已發表的IL-1(3序列(Y15006)和真核表達載體pcDNA3.1(+)上的 酶切位點設計并合成的，并在基因上下游分別引入酶切位點BamH I和EcoR I 。引物序列為上游引物5'. CAAGa47UCATGGCGTTCGTTCCCGACCT -3 ' 下游引物5'- GAAOWrCTCAGCGCCCACTTAGCTTG -3，3. 雞白細胞介素lp基因的PCR獲取，以PCIL-1 e質粒為模板，加入TaqDNA聚合酶、上下 游引物、dNTP進行擴增反應。PCR的反應體系為10Xbuffer 5uL， 4XdNTPmix (2. 5mmol/L) 4uL，上、下游引物(20umol/L)各1 u L， Mgcl2 4uL， PUCIL18質粒1 u L， ddH20 33.5 PL， Taq酶(5u/uL) 0.5nL。反應參數為95。C處理5min，然后94。Clmin、 55。Clmin、72'C2min，共31個循環，72。C延伸10min。 PCR產物在2. 0%瓊脂糖凝膠電泳觀察，可見約為 0.8kb的擴增條帶，大小與預期的結果一致。雞白細胞介素lp的基因序列:CCGACCAGGTCAACATCGCCACCTACAAGCTAAGTGGGCGCTGA4. 雞白細胞介素ie基因真核表達質粒pDNAIL-ip的構建，將雞白細胞介素1P基因的PCR 產物用酚氯仿抽提純化，乙醇沉淀，干燥后用TE溶解。雞白細胞介素1P基因的PCR純化產 物用EcoRI、 BamH I進行雙酶切處理，膠回收0.8kb的條帶。以同樣的方法對pcDNA3. 1 (+) 質粒進行雙酶切處理，膠回收5.4kb左右DNA片段。分別取5nL雙酶切后膠回收的雞白細胞介素ie基因片段，加入10xT4 DNA Ligase buffer luL， T4DNA連接酶1 ii L，酶切處理載體pcDNA3. 1 (+) 1 y L， ddH20 2uL， 16。C連 接18小時。將連接產物轉化DH5a感受態細胞，在含有氨芐青霉素的LB平板上37'C培養。5. 雞白細胞介素1 P基因真核表達質粒pDNAIL-l p的雙酶切鑒定，在含有氨芐青霉素的LB 平板上挑取單個菌落，抽提質粒DNA進行雙酶切鑒定。將雞白細胞介素lp基因真核表達質 粒pDNAIL-l p分別用EcoR I 、 BamH I進行雙酶切，酶切產物在0. 8%瓊脂糖凝膠電泳觀察， PCIL18雙酶切后產生約為5. 4kb和0. 8kb左右的兩條帶，證明己經成功構建了雞白細胞介素 18基因真核表達質粒pDNAIL-l 0 。6. 雞白細胞介素lp基因真核表達質粒pDNAIL-iP的PCR鑒定，在含有氨芐青霉素的LB平 板上挑取單個菌落，抽提質粒DNA進行PCR鑒定。以pDNAIL-iP質粒為模板，加入Taq DNA 聚合酶、上下游引物、dNTP進行擴增反應。PCR的反應體系為10Xbuffer 5u L, 4XdNTPmix(2.5關ol/L) 4u丄，上、下游引物(20yniol/L)各1 u L， Mgcl2 4yL， PCIL18質粒1 u L， ddH20 33.5uL， Taq酶(5u/iiL) 0.5uL。反應參數為95。C處理5min，然后94。Clmin、 55。Clmin、 72。C2min，共31個循環，72。C延伸10min。 PCR產物在2. 0%瓊脂糖凝膠電泳觀察， 可見約為0.8kb的擴增條帶，證明己經成功構建了雞白細胞介素1P基因真核表達質粒 pDNAIL-1 & 。7. 雞白細胞介素W基因真核質粒pDNAIL-iP的研制。從LB固體培養基中挑取單菌落，接種于盛有10ml液體培養基的三角瓶中，37。C震蕩過夜培養。在1000ml的三角瓶中加入100ml 的發酵培養基，接入5ml的菌種，37°C， 200rpm/min，培養20h.。用常規提取質粒的堿裂 解方法進行質粒的大量抽提，用硅藻土吸附方法進行純化。電泳鑒定質粒的純度和含量。質 粒用PBS緩沖液稀釋到lmg/ml，即為雞白細胞介素1 P基因分子佐劑pDNAIL-l P 。該分子佐 劑與DNA疫苗混合，質脂體包裹后用肌肉注射的方法進行預防接種。8.用該分子佐劑與禽傳染性支氣管炎DNA疫苗聯合應用，免疫SPF雞，通過檢測血清IBV 特異性抗體、CD4+、 CD8+、 CD3+T淋巴細胞百分含量來檢測其對禽傳染性支氣管炎DNA疫苗的 免疫增強作用。將2日齡健康SPF雛雞140只，隨機分成7個組，每組20只，分別用PBS液(O. 2ml)、 IBV滅活疫苗(0.2ml)、 IBV弱毒疫苗(0. 2ml)、 pcDNA3. 1 (150ug)、 IBVDNA疫苗(150ug)、 pDNAIL-IP (50wg)、 IBV DNA疫苗+pDNAIL-1 e (150u g+50y g)進行免疫，于免疫后7、 14、 21、 28、 35天，隨機取5只頸靜脈采血，分離血清。采用間接ELISA法檢測血清IBV特異性抗體； 同時采取抗凝血分離淋巴細胞，用流式細胞儀進行淋巴細胞亞類CD4+、 CD8+、 CD3+T淋巴細胞 百分含量的測定，于免疫后35天用IBV強毒進行攻毒保護實驗。測定結果發現，在免疫后 pDNAIL-1 e +0歴組在免疫后血清18￥特異性抗體水平14天就極顯著高于滅活苗和弱毒苗組，在 21天高于所有實驗組，差異極顯著，在28天與IBVDNA疫苗組比較差異顯著；測定003+T淋巴 細胞結果表明，在免疫后14天pDNAIL-le+IBV DNA組高于IBV DNA疫苗組，差異極顯著，21 天與所有實驗組比較均出現差異極顯著；檢測CD4+T淋巴細胞結果表明，7天時pDNAIL-l 0 +IBV DNA組與pcDNA3. l組、滅活苗組、弱毒苗組和PBS苗組比較差異顯著，在免疫后14天、21天與 IBV DNA疫苗組比較，差異極顯著;研究CD8+結果表明，在免疫后14天，pDNAIL-1 e+IBV DNA 組和IBV DNA疫苗組比較差異極顯著，21天時與除DNA疫苗組外的其它五個實驗組比較差異顯 著。攻毒實驗結果表明，pDNAIL-l e+IBV DNA組死亡保護率(90%)高于IBVDNA疫苗組(85%) 與弱毒苗組(80%)，但低于滅活苗組的保護率(100%)。實驗結果說明分子佐劑pDNAIL-l e對IBV DNA疫苗具有一定的免疫增強作用。雞白細胞介素ie的基因序列表:Organization ApplicantStreet: City : State : Country : PostalCode : PhoneNumber : FaxNumber : Email Address : < 110> OrganizationName :四川大學Application Project<120> Title : —種雞白細胞介素1 P基因及其真核表達質粒構建及免疫效應 <130>AppFileReference : <140> CurrentAppNumber : <141> CurrentFilingDate : --Sequence<213> OrganismName : Gallus gallus <400> PreSequenceString :atggcgttcg ttcccgacct ggacgtgctg gagagcagca gcctcagcga agagaccttc tacggcccct cctgcctctg cctgcagaag aagcctcgcc tggattctga gcacaccaca gtggacgtgc aggtgacggt gcggaaggga cgtggtgccc ggagctttcg gcgggccgcc gtgctggtgg tggccatgac caaactgctg cggaggccga ggagcaggga ctttgctgac agcgacctga gcgcgctcct ggaggaggtt tttgagcccg tcaccttcca gcggctggag agcagctacg ccggggcgcc cgccttccge tacacccgct cacagtcctt cgacatcttc gacatcaacc agaagtgctt cgtgctggag tcacccaccc agctggtggc cctgcacctc caggggcccc cctccagcca gaaagtgagg ctcaacattg cactgtgccg gccccgaggc ccacggggca gcgctggaac tgggcagatg ccagtggcac tgggcateaa gggctacaag ctctacatgt cgtgtgtgat gagcggcacc gagcccacac tgcagctgga ggaagccgac gtcatgcggg acatcgacag cgtcgagctg acccgcttca tcttctaccg cctggacagc ccgactgagg gcaccacgcg ctttgagtcg gccgccttcc ccgggtggtt catctgcacc tccctgcagc cccggcagcc cgtgggcatc accaaccaac ccgaccaggt caacatcgcc acctacaagc taagtgggcg ctga <212>Type :DNA <211> Length : 804SequenceName : ChIL-ipSequenceDescription :60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 78080權利要求
1.一種雞白細胞介素1β基因及其真核表達質粒構建及免疫效應，其特征在于用分子生物學方法將雞白細胞介素1β基因插入真核表達載體pcDNA3.1(+)中，構建能表達雞白細胞介素1β基因的真核表達質粒，研制分子佐劑pDNAIL-1β，該佐劑可用于作為雞傳染病DNA疫苗的免疫增強劑。
2. 根據權利要求l所述的真核表達質粒pDNAIL-ip，其特征在于用雞白細胞介素 1 e基因經BamH I和EcoR I雙酶切后，插入真核表達載體pcDNA3.1(+)中，構 建真核表達質粒，研制DNA疫苗分子佐劑pDNAIL-lp。
3. 權利要求2所述的真核表達質粒pDNAIL-ip用于作為雞傳染病DNA疫苗的免 疫增強劑。
全文摘要
本發明是一種雞白細胞介素1β基因及其真核表達質粒構建與免疫效應。本發明根據Genbank中注冊的雞白細胞介素1β蛋白基因序列設計引物，以雞白細胞介素1β蛋白基因的重組質粒PCIL-1β為模板，用PCR方法擴增雞白細胞介素1β，并將PCR產物經BamH I和EcoR I雙酶切定向插入以BamH I和EcoR I雙酶切處理的真核表達載體pcDNA3.1(+)中，成功的構建了雞白細胞介素1β成熟蛋白真核表達質粒，研制出分子佐劑pDNAIL-1β。該分子佐劑可作為禽類DNA疫苗的免疫增強劑。通過檢測血清IBV特異性抗體、CD4+、CD8+、CD3+百分含量，研究了該分子免疫佐劑對禽傳染性支氣管炎DNA疫苗的免疫增強作用。結果發現分子佐劑pDNAIL-1β對IBV DNA疫苗具有一定的免疫增強作用。
文檔編號C12N15/79GK101235374SQ20071005044
公開日2008年8月6日 申請日期2007年11月8日 優先權日2007年11月8日
發明者余協中, 夏青青, 毅 張, 徐永莉, 王紅寧, 田國寶 申請人:四川大學