一種細尖狼蝎Kv1.3阻斷劑基因及制備方法和應用的制作方法

專利名稱：一種細尖狼蝎Kv1.3阻斷劑基因及制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，本發明涉及一種細尖狼蝎Kvl.3阻斷劑基因，該 基因的分離方法和生產這種細尖狼蝎Kvl. 3阻斷劑。具體地說，本發明涉及一種 細尖狼蝎Kvl. 3阻斷劑基因的分離；涉及一種細尖狼蝎Kvl. 3阻斷劑重組大腸桿 菌及其構建方法；還涉及一種細尖狼蝎Kvl. 3阻斷劑的制備方法，同時還涉及 Kvl.3阻斷劑在自身免疫疾病中的用途。
背景技術：
蝎(scorpion)是我國的一種傳統名貴中藥，2000多年前就記載了蝎子的 藥用史。明朝《本草綱目》更詳細記載蝎主治"諸風癮疹、中風、半身不遂、口 眼歪斜、語澀、手足抽摯，小兒驚癇風搐"等多種疾病，具有抗腫瘤，殺蟲，抑 菌和抗菌功效，其作用主要來源于蝎尾毒腺分泌的毒液。毒液的主要成分是一類 由10-100個氨基酸組成的具有多種生物活性的小分子多肽，它們可以選擇性、 特異性的與細胞膜上的膜蛋白相互作用，從而改變細胞對離子的通透能力，調節 細胞體積、pH、膜電位、興奮性等多種細胞代謝過程和細胞分泌、激素作用和信 號轉導等多種生理過程。因此，蝎毒素具有重要的理論研究意義和應用開發價值。 但是由于蝎毒成分復雜，結構相似，難以分離，許多成分所起的作用甚至相反， 而且有效成分往往含量低，這些無疑都限制了蝎毒的研究和應用。很有必要采用 現代分子生物學技術研究蝎毒單體成分的生理功能。
離子通道(ion cha皿el)是細胞膜上的一類特殊親水性蛋白質微孔道，由于離 子通道的功能、結構異常與許多疾病的發生和發展有關，因此離子通道的相關研 究已成為了各國科學家們研究的重點之一。鉀離子通道是細胞膜上重要的離子通 道，是離子進出細胞的必經之路，對于細胞功能的調節具有十分重要的作用，而 且由于其功能異常會引起多種神經精神疾病，因此鉀離子通道的結構與功能研究
也是目前分子神經生物學的前沿熱點。近年來，電壓門控的鉀離子通道Kv1.3已 成為了一個治療眾多疾病的有效靶標。對鉀通道Kvl.3的研究表明，Kvl.3控制 人類T淋巴細胞的活化，專一性的Kvl.3離子通道抑制劑將對T淋巴細胞的活 化產生影響，這類抑制劑很可能成為新的免疫抑制因子，可用于防治移植排斥反 應和治療自身免疫疾病。
目前涉及蝎毒腺毒素基因的專利有7項①東亞鉗蝎毒素BmKAS在制藥中 的應用，該發明涉及東亞鉗蝎毒素BmKAS在制備抗外周傷害藥中的應用，以及 東亞鉗蝎毒素BmKAS在制備抗痛覺過敏藥中的應用；②一種含有雙價抗蟲基因 的重組桿狀病毒，該發明涉及東亞鉗蝎昆蟲特異性神經毒素基因BmKIT與一種 昆蟲幾丁質酶基因(Chi)，獲得含雙價抗蟲基因的重組桿狀病毒 AcNPV-BmKIT-Chi;③蝎抗心律失常肽重組大腸桿菌及其構建方法，該發明涉 及了一種蝎抗心律失常肽BmKIM基因重組大腸桿菌，用于大量生產可溶、具有 抗心律失常活性的重組肽；④蝎抗心律失常肽及其制備方法和應用，該發明公開 了一種蝎抗心律失常肽BmKIM及其制備方法和應用，本發明所得到的重組 BmKIM多肽具有高效抗心律失常活性，且可溶性好，產量高；⑤一種人工合成 的蝎氯離子通道神經毒素基因-rBmKCTa,該專利涉及到氯離子通道神經毒素 BmKCT基因，采用基因工程所得的改良的重組蝎氯離子通道神經毒素對神經膠 質細胞具有抑制作用，可用于制備通過抑制神經膠質細胞可以治療的疾病的藥 物;⑥一種過渡型蝎毒素BmKabT的用途,本發明公開了的過渡型蝎毒素BmKabT 的用途，它可以作為一個獨特的鈉通道調制劑，研究鈉通道組成、結構和功能的 探針，可調節和治療鈉通道相關疾病的調制劑和藥品,可制備調節或治療高血鉀性 麻痹、先天性肌強直及其它骨骼肌疾病、第三類長QT間隔癥(LQT3)、原發性 心室纖顫及其他心臟疾病的調制劑或藥品；⑦一種重組蝎昆蟲毒素及其可溶性表 達和純化方法，該發明涉及一種重組蝎昆蟲毒素rBmKIT及其可溶性表達和純化 方法。
盡管①②③④⑤⑥⑦專利都是關于東亞鉗蝎毒素的內容，專利涉及的蝎毒素 基因BmKAS、 BmKIT、 BmKIM、 BmKCT、 BmKabT與本發明獲得的來自于細 尖狼蝎(Lychas mucronatus， Lm) Lm8基因是完全不同的毒素基因，并且①②
③④dXD⑦專利發明都沒有涉及到鉀離子通道阻斷劑的功能。

發明內容
本發明的一個目的在于提供一種細尖狼蝎Kvl.3阻斷劑基因，該基因小，易于操作。
本發明的另一個目的還在于提供一種細尖狼蝎Kvl.3阻斷劑重組大腸桿菌 的構建方法，方法簡便，安全性高，生產成本低廉，純化簡單且產物純度高。
本發明再有一個目的是提供一種用基因工程方法生產的細尖狼蝎Kvl.3阻 斷劑的高效生物活性，細尖狼蝎Kvl. 3阻斷劑在制備治療或預防自身免疫疾的病 藥物中的應用。
為了實現上述目的，本發明的構思為①構建一個高質量細尖狼蝎毒腺組織 cDNA文庫；②以上述①毒腺組織cDNA文庫為基礎，通過隨機測序方法篩選到 了一個克隆子8 (編號)，序列分析為一種鉀離子通道毒素基因，命名為Lm8，
該菌己經保藏，保藏單位中國典型培養物保藏中心，保藏地址中國.武漢.武漢大學，保藏日期2007年8月29日，保藏編號CCTCCNO: M207131，分 類命名^ c力eric/ ia coh' DH5a/Lm8/pSPORTl;③構建了表達和生產重組蝎 毒素Lm8的基因工程菌，保藏單位中國典型培養物保藏中心，地址中國.武 漢.武漢大學，保藏日期2007年8月29日，保藏編號CCTCCNO: M207132， 分類命名￡sc/ eric/u'a co"'Rossetta (DE3)/Lm8/pGEX-6p-l; 采用基因工 程的方法，獲得了高純度的重組蝎毒素Lm8，純度達95%;⑤通過膜片鉗方法， 測定了④獲得的重組蝎毒素Lm8對電壓門控鉀離子通道Kvl.3的高效阻斷效用， 其半效抑制劑量IC50為26.40± 1.62nM。細尖狼蝎毒素Lm8在制備治療或預防 自身免疫疾病的藥物中具有重要應用價值。
本發明的一個目的在于提供一種細尖狼蝎Kvl.3阻斷劑基因。首先構建高質 量細尖狼蝎毒腺組織cDNA文庫。包括其毒腺用于總RNA的分離；取500mg 的蝎尾腺在液氮中研成細粉末，通過Trizol方法制備的蝎毒腺總RNA;制備的 蝎毒腺總RNA采用甲醛變性凝膠電泳檢測其質量。
通過上述方法制備的蝎毒腺總RNA量為3mg，采用PolyATract mRNA分離 系統(購自美國Promega)分離和純化mRNA。紫外分光光度計測定其獲得的蝎 毒腺mRNA量約10嗎；用5嗎mRNA作為起始量，進行cDNA的第一鏈和第二 鏈合成，繼續雙鏈cDNA與Sail銜接頭的連接，Notl消化雙鏈cDNA，去除雙
鏈cDNA分子中的過量Sail銜接頭和酶切小片段，雙鏈cDNA與pSPORTl載體 (購自美國Invitrogen)的連接和轉化，毒腺細胞cDNA文庫的鑒定等步驟。結 果獲得了一個豐度為1.5"(^個克隆子4igcDNA。采用該方法構建的蝎毒腺cDNA 文庫陽性插入率達到95%以上，細尖狼蝎的毒素基因覆蓋率達到95%以上。
隨機從構建好的細尖狼蝎毒腺細胞cDNA文庫中挑選100克隆子，送公司 測序。序列分析表明克隆子8為一個新的細尖狼蝎鉀離子通道毒素基因，命名為 Lm8。 一種分離的多肽基因，其序列為SEQ ID NO:l所示的核苷酸序列 ggaaggaaaatgaacaaagtttgctttgtcgtcgttcttgttctcttcgtggctctggctgcatatgtgtcacctatcgaaggtgt accaacaggaggatgcccactttcggattcgctgtgtgccaaatattgcaagtcccacaaatttggcaaaaccggaagatg caccggaccaaacaagatg肌atgteaatgtctcgtgteate犯atgtoagcg3ataa昭atttgtg3atga3a3犯3a3a3 aa (圖1)。
本發明的另一個目的還在于提供一種細尖狼蝎Kvl.3阻斷劑多肽。 一種分 離的蛋白質，其序列為SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。Lm8的前體組織形式 編碼65個氨基酸殘基(SEQIDNO:2)，由二個部分組成，即信號肽(25個殘基) 和 成 熟 肽(40個 殘 基 ) 廳KVCFVVVLVLFVALAAYVSPIEGVPTGGCPLSDSLCAKYCKSHKFGKTG RCTGPNKMKCKCLV (SEQ ID NO:2)，信號肽序列為前25個氨基酸殘基 MNKVCFVVVLVLFVALAAYVSP正G，其成熟肽是由40個氨基酸組成-VPTGGCPLSDSLCAKYCKSHKFGKTGRCTGPNKMKCKCLV (圖1)。
本發明的另一個目的在于提供一種細尖狼蝎Kvl.3阻斷劑重組大腸桿菌的 構建方法(構建重組表達載體的示意圖見圖2)。包括設計與合成PCR上游引物 (8-FP: 5-GATGGATCCGATGACGATGACAAGAATGAAGCGGTGCCAACA-3 )和下游引 物(8-RP: 5-GCTCTCGAGTCAGATAGAACATTTACA-3)，用PCR技術從細尖狼蝎毒 腺cDNA庫中擴增Kvl.3阻斷劑基因的成熟肽編碼片段，并通過表達載體轉化到 受體菌大腸桿菌DE3 (購自美國NOVAGEN)。其特征是，設計的PCR引物含小 腸激酶酶切位點(gatgacgatgacaag: DDDDK)，將PCR擴增的Kvl.3阻斷劑成熟 肽編碼片段經過限制性內切酶(8amffl和J^cjI)酶切，回收純化后與經Bamffl 和^7wI酶切的pGEX-6p-l (購自美國Novagen)質粒連接，連接產物轉化大腸 桿菌感受態DH5a (購自中國典型培養物保藏中心)中，PCR方法和雙酶切法鑒
定陽性克隆子(圖3和圖4)。陽性克隆子進一步測序確證Kvl.3阻斷劑成熟肽 編碼片段克隆到表達載體中。提取重組測序正確的重組陽性克隆子質粒Lm8/ pGEX-6p-l ，轉化到大腸桿菌DE3中獲得重組大腸桿菌Rossetta (DE3)/Lm8/pGEX-6p-l，用于生產可溶的且有活性的重組細尖狼蝎Kvl.3阻斷劑多肽。
本發明的另一個目的在于提供一種生產細尖狼蝎Kvl.3阻斷劑多肽的基因 工程方法。將重組大腸桿菌Rossetta(DE3)/Lm8/pGEX-6p-l經0. lmM的IPTG誘 導，高表達了谷胱甘肽轉移酶-Lm8融合蛋白(GST-Lm8)(圖5)，經谷胱甘肽親 和層析柱純化得到了高純度的融合蛋白GST-Lm8 (圖5)，超慮離心脫鹽后用小腸 激酶28'C酶切過夜(圖5)，酶切產物經過高效液相色譜HPLC將Lm8和GST分開
(圖6)，手工收集Lm8蛋白峰，低溫冷凍凍干(一40'C)，獲得了高純度和可溶 性好的重組細尖狼蝎Kv1.3阻斷劑多肽Lm8，最終得率達到lmg/L。質譜分析重 組細尖狼Kvl.3阻斷劑多肽Lm8與預期分子量大小一致(圖7)。根據本發明的 生產方法，所得到的重組肽有以下特點重組肽中不含有多余氨基酸殘基，與由 cDNA推測的成熟肽一致；所得到的重組肽是可溶的非包涵體狀態，而且產量高， 產量為lmg/L培養物。
本發明還有一個目的是提供一種用基因工程方法生產的細尖狼蝎Kvl.3阻 斷劑對電壓門控鉀離子通道Kvl. 3的高效抑制作用。包括穩定超表達人電壓門控 鉀離子通道Kvl. 3綠色熒光蛋白細胞系Cos7/raKv1. 3的構建(圖8)，采用全細 胞膜片鉗的方法，發現重組細尖狼蝎毒素多肽Lm8對表達于Cos7細胞系Kvl. 3 電流有明顯的阻斷作用，且具有劑量依賴性(圖9)。通過濃度依賴曲線測定了 重組細尖狼蝎毒素多肽Lm8對Kv1. 3電流的半效抑制濃度IC50為26.40± 1.62nM
(圖10)。采用本發明的方法生產的細尖狼蝎Kv1.3阻斷劑具有高效抑制電壓門 控的鉀離子通道Kvl.3的作用，在制備治療或預防自身免疫疾病(如哮喘、肌肉 硬化癥、紅斑狼瘡、硬皮病、類風濕性關節炎等)的藥物中有重要的應用價值。 本發明是一種細尖狼蝎Kvl.3阻斷劑基因及制備方法和應用。獲得了一個全 新的鉀離子電壓門控通道Kvl.3阻斷劑基因。并且，構建了一種細尖狼蝎Kv1.3 阻斷劑重組大腸桿菌，其方法簡便，安全性高，生產成本低廉，純化簡單且產物 純度高。可以大規模基因工程生產Kvl.3阻斷劑，用于防治自身免疫疾病。


圖1細尖狼蝎Lm8基因及其氨基酸。
cDNA序列下方為推斷的對應氨基序列；信號肽氨基酸以單下劃線標記；雙下
劃線部分為PolyA加尾信號。
圖2構建重組表達載體Lm8-pGEX-6p-l示意圖。
抽提pGEX-6p-l質粒；PCR擴增Kvl.3阻斷劑基因；B"w//1和lol酶切 pGEX-6p-l和Kvl.3阻斷劑基因的PCR擴增產物；酶切的質粒和片段的連接， 獲得重組克隆子質粒Lm8-pGEX-6p-l 。
圖3 PCR方法鑒定重組Lm8-pGEX-6p-l陽性克隆子。
M為DNA Marker; 1為PCR陰性對照；2為PCR陽性對照；3_5為陽性轉化子。 圖4酶切方法鑒定重組Lm8-pGEX-6p-l陽性克隆子。
M為DNA Marker; 1為Lm8基因片段的陽性對照；2為BamHI和Xhol雙酶切 重組質粒Lm8-pGEX-6p-l; 3為BamHI單酶切重組質粒Lm8-pGEX-6p-l 。 圖5重組GST-Lm8、 Lm8的表達與純化的SDS-PAGE。
A: 1為標準蛋白質分子量Marker; 2為重組大腸桿菌Rossetta (DE3)/Lm8/pGEX-6p-l未經IPTG誘導；3為重組大腸桿菌Rossetta (DE3)/Lm8/pGEX-6p-1經IPTG誘導；4為重組大腸桿菌Rossetta (DE3)/pGEX-6p-l未經IPTG誘導；5為重組大腸桿菌Rossetta (DE3)/ pGEX-6p-l經IPTG誘導。
B: l為標準蛋白質分子量Marker; 2為經谷胱甘肽親和層析柱純化得到了高
純度的融合蛋白GST-Lm8; 3為GST蛋白；4為HPLC純化的Lm8蛋白；5為小
腸激酶28'C酶切過夜產物。
圖6 HPLC分離GST和Lm8蛋白。
箭頭指示純化的Lm8蛋白。
圖7重組Lm8蛋白的質譜分析。
圖8穩定超表達人電壓門控鉀離子通道Kvl.3綠色熒光蛋白細胞系 Cos7/mKvl.3。
圖9重組Lm8蛋白對Kv1.3電流的濃度阻斷效用。 圖10重組Lm8蛋白對Kv1.3電流的濃度依賴曲線。
下面的實施例可以使本專業技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式 限制本發明。
實施例1:蝎毒腺總RNA的提取(Trizol LS —步法Trizol LS購自美Invi加gen) ①取500mg的蝎尾腺在液氮中研成細粉末，加入10ml TRIZOL reagent混勻， 室溫(20-25'C，以下相同)放置5分鐘；②然后加入2ml氯仿混合15秒，室溫放 置2-3分鐘，4匸下12000g離心15分鐘；(D取水相加1倍體積異丙醇，室溫放 置10分鐘，4。C下12000g離心10分鐘得RNA沉淀； 沉淀用5ml75%乙醇洗 滌，7500g離心5分鐘；⑤RNA沉淀干燥后溶于DEPC-treated water, 55-60。C保 溫10分鐘以徹底溶解RNA。整個過程參照TRlZOL(Total RNA Isolation)Reagent Kit推薦方法進行。
實施例2: mRNA的分離純化
采用PolyA Tract mRNA分離系統(Promega， USA)分離和純化mRNA，其工 作原理是基于Oligo (dT)與niRNA 3'端poly(A)尾的互補配對特性，用生物素 標記01igo (dT)，通過它與mRNA 3'端poly (A)的退火形成雜交體，然后用標 有親合素的磁珠和磁性分離架捕獲并洗滌生物素Oligo (dT)/mRNA雜交體，最后 用無RNA酶的ddH20將之洗脫下來，達到從總RNA中分離mRNA的目的。①樣品 的制備將RNA加入到含有32tiie-巰基乙醇的800nl的GTC中。②探針 的退火取250pM濃度Oligo (dT) 5|_d,加蒸餾水至50(xl;加入1.6ml預 熱(70°C)的dilution buffer (dilution buffer已加入32pl P 一巰基 乙醇)，與RNA混勻，7(TC溫育5分鐘。③磁珠的活化取1.2ml的磁珠 SA-PMPS(購自美國Promega公司)于1. 5ml的離心管中；用0. 5XSSC(0. 15 摩爾/升的氯化鈉和0. 015摩爾/升的擰檬酸鈉，pH7. O)重懸SA-PMPS，以 磁架吸附磁珠，原體積0. 5XSSC洗滌SA-PMPS3次。④mRNA的獲取將 7(TC溫育的RNA與SA-PMPS混合，室溫放置5分鐘放磁架上吸附磁珠，棄 上清液；2ml的0. 5XSSC懸浮磁珠，洗滌重復2次，最后一次盡量去除SSC; 加入無RNA酶的ddH20至磁珠中，輕輕混勻，然后離心(12000gX3分鐘) 或磁架吸附磁珠；取上清，獲得mRNA。通過電泳和紫外測定raRNA的濃度 和純度。⑤niRNA的沉淀將④獲得的mRNA中加入糖原和2. 5倍體積的無 水乙醇，沉淀過夜，mRNA將用于cDNA的合成。
實施例3:第一鏈cDNA合成
①在1.5ml Ep管中加入2pl Abt I Primer-ad鄰ter (美國INVITOGEN公 司)和6nlmRNA (含3嗎mRNA)， 70。C溫育10rain，迅速放于冰上，離心后，加 入下列成分4^1 5X first strand buffer (美國INVITOGEN公司)；2pl 0. 1M DTT; 1^1 lOmM dNTPs; l^il DEPC H20。輕輕混勻后離心，37。C放至2min;②加 入5pl逆轉錄酶，混勻后取2pl，加lpl [a-32p]dCTP (4pCi)(示蹤管)。與上 述反應組分(樣品管)同時37t:溫育lh，然后放入冰上終止反應；③對于示蹤 管，依次加入20 mM EDTA和5^1酵母t腦A，混勻后，分別取兩份10pl點 于兩張濾膜上，1份用10% TCA洗3次，每次5min， 95%乙醇洗1次，空氣干燥 后，放入1.5ml閃爍液中(為l"樣品)；另l份空氣干燥后，放入1.5ml閃爍液 (為28樣品)。另3(^1示蹤液，加1. 5pl 7. 5M NH40Ac和90^1無水乙醇(-20 。C)，混勻后立即14，000rpm離心20min，棄上清，加入0. 5ml 70%無水乙醇(-20 。C )， 14, OOOrpm離心2min，棄上清，37。C干燥10min讓乙醇揮發，溶于10^1 TEN 溶液，加入10pl 2X加樣緩沖液，取10jil用于堿性凝膠電泳。用[a-32P]dCTP 標記入DNA片段作分子量標記;④混勻后室溫下放置15min,加入2^1 0. 2 M EDTA終止反應。取6|il反應液和6ml 2X堿性電泳緩沖液混勻，電泳5h后， 用7y。TCA浸泡20min,直至溴酚蘭變黃。然后用衛生紙吸干(8h左右)，進行放 射自顯影；⑤對于樣品管，用于第二鏈的合成。
歷/7t/ III 10X buffer2(xl
dGTP0. 2mM
dATP0. 2mMdCTP2(iCi
/Z/"(^ III markerslpg
Klenow DNA polymerase2 unit
Add ddH20 to final volume of20pl
實施例4:第二鏈cDNA合成
①冰上在樣品管中依次加入下列成分；②輕輕混勻后，16。C溫育2h; (d加 入2pl (10units) T4DNA聚合酶，繼續16。C反應5min;④轉入冰上，加入10pl 0. 5MEDTA;⑤加入等體積(150^1)酚/氯仿/異戊醇(25/24/1)，徹底渦旋后， 室溫下14, OOOrptn離心5min。將水相(140^1)轉入另一 1. 5ml Ep管；⑥加入 70^1的7. 5M NH40Ac和0. 5ML無水乙醇(-20°C)，渦旋后，室溫下14， 000rpm 離心20min;⑦棄上清，加入O. 5ml70。/。乙醇(-20。C)，同上離心2min。棄上清， 37。C干燥10rain。
<formula>formula see original document page 12</formula>
實施例5:雙鏈cDNA與&7 I銜接頭的連接
①用25^1 DEPC ddH20溶解實施例4的cDNA樣品，然后按下表依次加入； ②輕輕混勻，16t反應過夜(約20h)。③用酚/氯仿/異戊醇(25/24/1)抽提和 朋40ac/乙醇沉淀后，37。C干燥10fflin。
<formula>formula see original document page 12</formula>實施例6: Abt I消化雙鏈cDNA
①將實施例5的樣品溶于41pl，然后按下表依次加入；②混勾后，37匸溫
育2h;③用酚/氯仿/異戊醇(25/24/1)抽提一次，然后用7. 5M冊40ac/乙醇沉 淀，37。C干燥10rain。
溶于70pl TEN,取1^1用于定量，其余-20。C保存備用。
REACT 3 buffer 5^1 Not I 4^1 Final Volume 50jlU
實施例7:去除雙鏈cDNA分子中的過量&7 I銜接頭和酶切小片段
用nucleon extraction and purification kit (Amersham， USA) 去除過 量工銜接頭和酶切小片段。①室溫下懸浮樹脂，然后取600pl加于離心柱中， 2 000 rpm離心lOs,去掉液體。在樹脂中央加入4(^1上述cDNA溶液。同上離 心；②收集洗脫液用于連接反應。
實施例8:雙鏈cDNA與pSPOKTl載體的連接和轉化
①在1. 5ml Ep管中依次加入下列成分；②室溫下反應16h;③在②反應液 中依次加入下列成分5.0^1 yeast tRNA， 12. 5^1 7. 5 M NH40ac， 70pl無水 乙醇(-20。C)。渦旋混勻后立即14000離心20min; 沉淀用70%乙醇(-20°C) 洗滌，37。C干燥后溶于4^a;⑤取2pl電擊轉化50pl ￡co/i K12 MC1061。
5X T4纖ligase buffer 4)^1
pSP0RTl， NotI-Sail-Cut (50ng/|il) 1^1
c畫(3ngAtl) 4)^1
T4DNA ligase ljil
Add ddH20 to final volume 20jli1
實施例9:毒腺細胞cDNA文庫的初步鑒定
用PCR方法鑒定文庫的質量，正向引物5' TCGACCCACGCGTCCG 3'(按Sail 銜接頭序列設計)；反向引物5， GAGCGGCCGCCCT15 3，(按NotI引物-銜接頭 的序列設計)。
實施例10:隨機測序策略篩選cDNA文庫
隨機從構建好的細尖狼毒腺細胞cDNA文庫中挑選100克隆子，送上海三 博公司測序。序列錄入軟件為BioEditv4.5.8 (Tom Hall, 1999)，同源性比較和信 號肽切割位點預測軟件分別為CLUSTAL X 1.8 (Thompson et al., 1997)和 PC/GENE (Intelligenetics Inc., Switzerland)。序列分析表明克隆子8為一個全新的 毒素基因，命名為Lm8。其序列為SEQ ID NO:l所示的核苷酸序列 ggaaggaaaatgaacaaagtttgctttgtcgtcgttcttgttctcttcgtggctctggctgcatatgtgtcacctatcgaaggtgt accaacaggaggatgcccactttcggattcgctgtgtgccaaatattgcaagtcccacaaatttggcaaaaccggaagatg caccgg3cc3犯c犯gatgaaatgta3atgtctcgtgteataaaatgteagcg3ata肌gatttgtgaatga犯aa犯膽3a aa。該基因含有一個完整的開放閱讀框，有兩個加尾信號aataaa。 Lm8的前體組 織形式編碼65個氨基酸殘基，由二個部分組成，即信號肽(25個殘基)和成熟 肽(40個殘基)MNKVCFVVVLVLFVALAAYVSP正GVPTGGCPLSDSLC AKYCKSHKFGKTGRCTGPNKMKCKCLV (SEQIDNO:2)。信號肽序列為前25 個氨基酸殘基MNKVCFVVVLVLFVALAAYVSP正G，其成熟毒素是由40個氨基 酸組成VPTGGCPLSDSLCAKYCKSHKFGKTGRCTGPNKMKCKCLV(圖1)。
實施例11:設計引物及PCR擴增細尖狼蝎Kvl.3阻斷劑基因
按照SEQIDNO: l所提供的細尖狼蝎Kvl.3阻斷劑基因(Lm8基因)序列 設計 PCR 正 向和反 向 引物 8-FP ( 8-FP: 5-GCGGGATCCGATGACGATGACAAGGTACCAACAGGAGGATGC-3)禾口 8-RP (8-RP: 5-GCCCTCGAGTTACACGAGACATTTACA-3)，以從蝎毒腺細胞cDNA庫中篩選所獲 得的Lm8基因(SEQIDNO: l)克隆子為模板，進行PCR反應，大量擴增細尖狼 蝎Kvl. 3阻斷劑基因的成熟肽區序列。PCR反應條件1^1 Taq聚合酶(1U)、 0.5^1 四種(腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶)脫氧單核苷酸等比混合液(10mmol/L)、 16.5pl無菌雙蒸水、2.5pl 10倍PCR緩沖液、1.5pl氯化鎂(25ramol/U 、 Al (10|imol/L)和A2 dO，ol/L)引物以及Lm8基因模板各1^1,總體積為25pl。 PCR反應過程:94。C預變性300秒、94。C變性60秒、55。C復性60秒、72。C延伸 60秒、循環35次、72。C最后延伸300秒。
實施例12: Lm8和pGEX-6p-l的雙酶切與連接
將實施例1中所得PCR產物經過酚:氯仿異戊醇(25: 24: 1)抽提，無水 乙醇(2. 5倍體積)沉淀后用滅菌水溶解沉淀。用限制性內切酶和 i7wl (Takara公司產品)對回收的PCR產物和表達載體pGEX-6p-l質粒進行酶 切。酶切反應5aw別(14U4d)和屈oI(20U4U)各l|xl， 10倍緩沖液2.5^1,， PCR 產物或pGEX-6p-l質粒50-100ng，加無菌水至總體積為25pl。 37。C水浴5小時， 酶切產物經酚氯仿異戊醇抽提，無水乙醇(2.5倍體積)沉淀后用TJ)NA連接 酶將PCR產物與表達載體pGEX-6p-l連接。連接反應T4DNA連接酶(lU/^d) 1^1， PCR產物與表達載體pGEX-6p-l的摩爾比為3: 1，并且DNA總量為O.lpg， 5倍連接酶反應緩沖液4pl，加無菌水至總體積為20^1， 16'C放置24小時。
實施例13:大腸桿菌DH5a和R0SSETTA(DE3)感受態細胞的制備
DH5a感受態細胞的制備在劃線平板上挑取DH5ot單菌落，接種于5ml LB 培養液，37°C， 250rpm搖床中培養過夜；以1 %量轉接于5ml LB培養基中，生 長至OD,到0.4 0.6，取菌液lml于預冷的1.5mlEppendorf管中，冰浴5 10 分鐘，4°C 12,000rpm離心20 30秒，收集菌體，倒置1分鐘，再冰浴10分鐘； 沉淀重懸于lml預冷的0.1M CaCl2中，冰浴20 40分鐘(可省略)，4°C 12,000rpm 離心20 30秒，收集菌體，將菌體重懸于150pl預冷的CaCl2中，冰浴2 7小 時，4"C冰箱保存，如放置在-70'C則可保存6個月。
Rossetta(DE3)感受態細胞的制備同于DH5ot感受態細胞的制備。
實施例14:連接產物的轉化和陽性克隆的鑒定
將實施例12中的20|al連接反應液加到10(^1的DH5a感受態細胞，混勻， 冰浴30分鐘，42。C水浴90秒(不能搖動)，再冰浴2分鐘；加等體積2XLB培 養液，37'C搖床(120rpm)溫育1小時；搖勻菌液，取200^1涂布于LB/AP+瓊 脂平板上，待菌液吸干后倒置于37'C培養12 16小時，觀察結果。
LB/AP+瓊脂平板上挑取單菌落10個，于50(^1含氨節的LB液體培養基中 37"C振搖4小時，取2pl菌液作為模板，以實施例11中的正反向引物進行PCR。 PCR篩選的陽性克隆子進一步使用限制性酶切反應鑒定。兩者都為陽性結果的
克隆子送上海三博公司進行測序分析。測序引物是針對pGEX-6p-l質粒的通用 測序引物pGEX5'primer 。
實施例15:重組表達質粒Lm8/pGEX-6p-l提取和基因工程菌Rossetta (DE3) (Lm8/pGEX-6p-l)的制備
將實施例14中測序確證的陽性克隆子按照堿裂解法提取重組表達質粒 Lm8/pGEX-6p-1 (方法見《分子克隆》第二版)。按照實施例14中的轉化方法將 提取的Lm8/pGEX-6p-l質粒轉入實施例13制備的大腸桿菌感受態Rossetta (DE3) 細胞中。平板為LB/AP+瓊脂平板。挑取單克隆子獲得基因工程菌Rossetta(DE3) (Lm8/pGEX-6p-l)，保存于中國典型培養物保藏中心。重組大腸桿菌^ c力ej7'c力is Rossetta(DE3)/Lm8/pGEX-6p-l， CCTCC N0:M207132。
實施例16:重組GST-Lm8的表達和親和層析
在含氨芐青霉素的LB液體培養基中以1: 100的比例接種克隆子(重組大腸 桿菌Rossetta (DE3) /Lm8/pGEX-6p-l )， 37。C培養至0D6。。 0. 8時加入IPTG(終 濃度為0. lmM)對培養物進行誘導，然后將培養物在28'C培養4小時以進行目的 基因的表達(見圖5)。濃縮誘導后的培養物50倍，超聲波破細胞(80HZ,30秒/ 次，至培養物變清亮為止)，12000rpm離心15分鐘，所得上清加入到GST親和 層析膠中充分混合后26。C作用1小時使融合蛋白GST-Lm8與GST親和層析膠充 分結合。用含50mM的EDTA的Tris-Cl緩沖溶液(l. OmM, pH8. 0)反復沖洗GST親 和層析膠去除雜蛋白。然后用lOmM的GSH溶液按照50ml/L培養物洗脫融合蛋白 GST-Lm8。
實施例17:重組GST-Lm8蛋白的濃縮脫鹽和小腸激酶酶切
將實施例16中洗脫的融合蛋白GST-Lin8通過15ml的1 OKDa超慮管(Mi 11 ipor e， Centricon, USA)離心濃縮脫鹽，離心速度為3500rpm/min，溫度為4。C。然后濃 縮脫鹽的GST-Lm8融合蛋白進行小腸激酶(Biowisdom， China)消化。小腸激酶酶 切反應體系如下小腸激酶10U， 10倍緩沖液100ul， GST-Lra8融合蛋白10mg，加 無菌水至總體積為1000y 1。 37'C水浴12小時。酶切消化的蛋白結果可以在
Tricine-SDS-PAGE電泳中檢測(見圖6)。
實施例18: HPLC分離rLm8蛋白和質譜分析rLm8蛋白
將實施例17中消化的GST-Lm8融合蛋白通過HPLC (美國安吉倫公司產品)， 把Lm8蛋白和GST蛋白分離。HPLC的參數設置為分離柱子C18 column (EliteHPLC， China' 10X250咖，5—，流速5ml/min'液相為含有0. 1%TFA的 CH3CN (10% to 80%)洗脫液，紫外檢測設置在230nm處。手工收集Lm8蛋白峰， 并且冷凍干燥(一40。C )。通過Tris-Tricine緩沖液的SDS-PAGE蛋白質電泳檢測 收集液中的重組Lm8蛋白，并用Bradford方法測定含量。高純度的rLm8蛋白 通過MALDI-TOF-MS (Voyager-DESTR， Applied Biosystems)測定其分子量為 4241.05 (見圖7)，與理論推導一致，表明成功的獲得了高純度的與天然Lm8蛋 白完全一致的重組蛋白質。
實施例19:穩定超表達mKvl. 3的綠色熒光蛋白的Cos7細胞系
鼠的電壓門控鉀離子通道Kvl. 3克隆到真核綠色熒光表達載體pIRES2-EGFP 中，構建了重組真核表達載體pIRES2-EGFP-mKv1.3。測序確證正確的陽性克隆 子用來大量提取pIRES2-EGFP-mKvl. 3質粒。
質粒pIRES2-EGFP-mKvl. 3轉染Cos7細胞使用購自廣州太陽馬公司的轉染試 驗盒。轉染的最適DNA濃度約為5-30pg/mL。為了獲得最好的轉染效率，細胞 密度應該為60-70%。 對于24孔板，最理想條件是在轉染前18-24h，每孔接種 8 x 104 -2.0 x105個細胞。0.6pg DNA質粒稀釋于30(iL不含血清和抗菌素的 DMEM中，輕輕混勻；l-2iiL梭華-SofastTM稀釋于30nLDMEM中，輕輕混勻； 30mL梭華-SofastTM稀釋液滴加到DNA稀釋液中， 一邊滴加一邊混勻；室溫孵 育15-20 min; 60(aL梭華-SofastTM/DNA復合物加到每孔中并輕輕搖動使均勻 混合；放置37'CC02孵育箱孵育24-48h后，觀察并分析報告基因轉染效率。然 后吸出培養液和沉淀物，用PBS將單層細胞再洗一次，每孔加入2mL預加溫G7 °C)的完全培養基。在非選擇性培養基上培養72h后，使所轉移基因得到充分表 達，再用胰蛋白酶消化細胞，以l: 10的濃度轉接，加非選擇性培養基培養24h 后，再換含有適當濃度G418 (800ng/mL)的選擇性培養基，這種培養基在2-3
周內每2-4d須更換1次，以便除去死細胞殘骸并使抗性細胞集落得以生長。篩 選得到的穩定轉染細胞系可以通過綠色熒光蛋白表達得以鑒定(見圖8)。將強 烈表達綠色熒光蛋白的Cos7細胞集落傳代培養，用于下一步膜片鉗試驗。
實施例20:重組Lm8蛋白對mKvl. 3電流的高效阻斷作用
采用微電極拉制器(PP-83，日本光電)雙步拉制玻璃電極，再進行拋光處理， 選擇尖端整齊，開口直徑約為0.5-2um的電極。用全細胞膜片鉗的方法對重組肽 Lm8的活性進行檢測。吸取實施例19中細胞放置于樣品池中，用細胞外液洗三遍， 再加入細胞外液，以備測量。膜片鉗試驗采用EPC-10放大器記錄， Pulse/Pulsefit(HEKA elektronik， Germany)軟件操作。膜片鉗操作的外液(mM): NaCl 125， KC1 5， MgS04 1.2， CaCl2 1.0, Na2HP041.6， NaH2P04 0. 4， Glucose 10.5 和HEPES 32. 5，用l mM NaOH調至pH 7. 4。內液(mM) : KF 145, MgCl22, EGTA 10 and冊PES 10，用l mM K0H調至pH 7.2。鉗制電壓為-80mV，測試電壓為-80mV ——+50mV，步增長為10mv，刺激頻率O. 5Hz， 25。C進行。電壓刺激細胞并記錄 mKvl.3電流，通過給藥系統加入重組細尖狼Lm8多肽，再記錄mKvl. 3電流的變化。 結果表明，重組細尖狼Lm8多肽對mKvl.3電流有高效的阻斷作用(見圖9)，其半 效抑制劑量為26.40土1.62nM (見圖IO)。
SEQUENCE LISTING
〈110〉武漢大學
<120> —種細尖狼蝎Kvl. 3阻斷劑基因及制備方法和應用
<130> —種細尖狼蝎Kvl. 3阻斷劑基因及制備方法和應用
〈160〉 2
<170> Patentln version 3.1
<210> 1
<211> 251
<212> DNA
〈213〉 Lychas mucronatus
< 1
gg犯gg犯犯tg犯ca犯gt ttgctttgtc gtcgttcttgttctcttcgt ggctctggct60
gcalatgtgt cscctatcga 3ggtgtacca acaggaggatgcccactttc ggattcgctg120
tgtgccaaat attgcaagtc ccacaaattt ggcaaaaccggaagatgcac cggaccaaac180
aagatgaaat gtaaatgtct cgtgtaataa aatgtaagcgaataaagatt tgtga_atgaa240
251
<210〉 2
<211> 65
<212> PRT
〈213> Lychas mucronatus
<400> 2
Met Asn Lys Val Cys Phe Val Val Val Leu ValLeu Phe Val Ala Leu
1 5 1015
Ala Ala Tyr Val Ser Pro lie Glu Gly Val ProThr Gly Gly Cys Pro
20 25 30
Leu Ser A印Ser Leu Cys Ala Lys Tyr Cys Lys Ser His Lys Phe Gly
35 40 45
Lys Thr Gly Arg Cys Thr Gly Pro Asn Lys Met Lys Cys Lys Cys Leu 50 55 60
Val 6權利要求
1、一種細尖狼蝎Kv1.3阻斷劑基因，其特征在于細尖狼蝎Kv1.3阻斷劑基因重組大腸桿菌Escherichia coli DH5a/Lm8/pSPORT1，CCTCC NOM207131。
2、 一種細尖狼蝎Kvl. 3阻斷劑基因重組大腸桿菌，其特征在于細尖狼蝎 KvL3阻斷劑基因重組大腸桿菌^sc力eric力ia co"' Rossetta(DE3)/Lm8 /pGEX-6p-l, CCTCC NO: M207132。
3、 一種分離的多肽，其基因序列為SEQIDNO:l所示的核苷酸序列。
4、 一種分離的蛋白質，其序列為SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。
5、 一種實現權利要求1所述的一種細尖狼蝎Kvl. 3阻斷劑基因的制備方法， 它包括下列步驟A、 構建細尖狼蝎毒腺組織cDNA文庫，包括其毒腺用于總RNA的分離； 取500mg的蝎尾腺在液氮中研成細粉末，通過Trizol方法制備的蝎毒腺總RNA;B、 通過A步驟制備的蝎毒腺總RNA量為3mg，采用PolyA Tract mRNA分 離系統分離和純化mRNA，紫外分光光度計測定其獲得的蝎毒腺mRNA;C、 用5嗎mRNA為起始量，進行cDNA的第一鏈和第二鏈合成；D、 繼續雙鏈cDNA與Sall銜接頭的連接，Notl消化雙鏈cDNA，去除雙鏈 cDNA分子中的過量Sail銜接頭和酶切片段；E、 雙鏈cDNA與pSPORTl載體的連接和轉化，毒腺細胞cDNA文庫的鑒 定，從細尖狼蝎毒腺細胞cDNA文庫中挑選100克隆子，測序，為一個新的細 尖狼蝎鉀離子通道毒素基因。
6、 一種實現權利要求2所述的細尖狼蝎Kvl. 3阻斷劑基因重組大腸桿菌的 制備方法，其步驟是A、 根據細尖狼蝎Kvl.3阻斷劑基因序列設計與合成PCR上游引物，8-FP: 5-GATGGATCCGATGACGATGACAAGAATGAAGCGGTGCCAACA-3禾卩下游引物，8-RP: 5-GCTCTCGAGTCAGATAGAACATTTACA-3，用PCR技術從細尖狼蝎毒腺cDNA庫 中擴增Kvl.3阻斷劑基因的成熟肽編碼片段，并通過表達載體轉化到受體菌大腸 桿菌DE3;B、 設計的PCR引物含小腸激酶酶切位點gatgacgatgacaag: DDDDK，將PCR 擴增的Kvl.3阻斷劑成熟肽編碼片段經過限制性內切酶酶切；C、 回收純化后與經B"m/ZI和，oI酶切的pGEX-6p-l質粒連接，連接產物 轉化大腸桿菌感受態DH5a中；D、 PCR方法和雙酶切法鑒定陽性克隆子，陽性克隆子測序確證Kv1.3阻斷 劑成熟肽編碼片段克隆到表達載體中，提取重組測序正確的重組陽性克隆子質粒 Lm8/ pGEX-6p-l，轉化到大腸桿菌DE3中獲得重組大腸桿菌Rossetta (DE3)/Lm8/pGEX-6p-l;E、 將重組大腸桿菌Rossetta(DE3)/Lm8/pGEX-6p-l經0. lmM的IPTG誘導， 表達了谷胱甘肽轉移酶-Lm8融合蛋白，經谷胱甘肽親和層析柱純化得到了融合 蛋白GST-Lm8，超慮離心脫鹽后用小腸激酶28'C酶切過夜，酶切產物經過高效液 相色譜HPLC將Lm8和GST分開，收集Lm8蛋白峰，低溫冷凍凍干，獲得了重組 細尖狼蝎Kvl.3阻斷劑多肽Lm8。
7、 一種細尖狼蝎Kvl. 3阻斷劑多肽在制備治療或預防自身免疫疾病的藥物 中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種細尖狼蝎Kv1.3阻斷劑Lm8的基因及制備方法和應用，其方法為首先是構建細尖狼蝎毒腺細胞cDNA文庫；從細尖狼蝎毒腺cDNA文庫中篩選細尖狼Kv1.3阻斷劑基因Lm8的陽性克隆子；進行測序，序列分析其細尖狼蝎Kv1.3阻斷劑Lm8的編碼特征，確定該阻斷劑Lm8的氨基酸序列；采用基因工程的方法構建細尖狼蝎Kv1.3阻斷劑Lm8重組大腸桿菌。表達和純化了高純度的重組Lm8多肽；膜片鉗證實了重組Lm8多肽對電壓門控mKv1.3的高效阻斷作用。細尖狼蝎Kv1.3阻斷劑多肽在制備治療或預防自身免疫疾病的藥物中的應用。
文檔編號C12N1/21GK101392252SQ20071005332
公開日2009年3月25日 申請日期2007年9月21日 優先權日2007年9月21日
發明者吳文瀾, 吳英亮, 曹志賤, 李文鑫, 馬一保 申請人:武漢大學