甘藍型油菜自交不親和的顯性scar分子標記及應用的制作方法

專利名稱：：甘藍型油菜自交不親和的顯性scar分子標記及應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于油菜育種
技術領域：
，具體涉及人工創造的甘藍型油菜自交不親和的顯性SCAR分子標記及其在甘藍型油菜標記輔助選擇中的應用。
背景技術：
：與甘藍型油菜當前主要的雜種優勢利用途徑一細胞質雄性不育相比，自交不親和雜種具有選育周期短、恢復系多、無不良胞質效應、制種產量高等優點，是油菜雜種優勢利用的重要途徑之一，近年來成為國內外育種學家研究的熱點之一。白菜型油菜(AA)和甘藍(CC)都表現為天然的自交不親和，而甘藍型油菜(AACC)卻表現為自交親和，自交不親和資源缺乏。通過對甘藍型油菜自交不親和變異株的定向選擇、屬間雜交、種間雜交等途徑可選育出優良的甘藍型油菜自交不親和材料。然而甘藍型油菜自交不親和的遺傳機制十分復雜，環境和外界因素影響較大，表現不穩定。傳統的表型選擇容易受到環境條件影響，存在許多缺點，效率低。分子標記輔助選擇是一種高效的育種方法，它可在任何生長期進行，不受環境條件影響，可排除非等位基因相互作用而造成的干擾，具有快速、經濟，效率高、準確性強等優點。在甘藍型油菜自交不親和系育種過程中將分子標記技術與回交育種相結合是一種全新的雜種優勢利用途徑。不但可以借助分子標記對自交不親和性狀的基因型進行直接而快速地選擇，以排除環境和外界因素的影響，同時對背景進行選擇，加快遺傳背景恢復速度，縮短育種年限和減輕連鎖累贅的作用。蕓薹屬的自交不親和性受單位點(S位點)、復等位基因控制，三個S位點基因SLG(S-locusglycoprotein),SRK(S-locusreceptorkinase)禾卩SP11(S墨locusprotein11)參與了花粉識別反應。在研究自交不親和反應機理的過程中，分離克隆了很多甘藍和白菜型油菜以及部分甘藍型油菜的自交不親和基因。本發明就是以這些基因為甘藍型油菜自交不親和性的侯選基因進行研究的。在甘藍型油菜中'ParkinIAP等(ParkinIAP等，IdentificationoftheAandCgenomesofamphidiploid5ms57.ca"opws(oilseedrape).'Genome，1995，38:1122-1131)發展了一個RFLP標記來定位甘藍型油菜的S位點。Ekuere等(EkuereUU等，LatentSallelesarewidespreadincultivatedself-compatible萬raw/cfl朋戸.，Genome,2004，42:257-265)利用RFLP標記來鑒定人工合成的以及普通甘藍型油菜的自交不親和基因型。MShring等(M6hringS等，DevelopmentofamolecularCAPSmarkerfortheself-incompatibilitylocusin5ms57'cawa/wsandidentificationofdifferentSalleles.，PlantBreeding,2005,124:105-110)得到與甘藍型油菜自交不親和性完全連鎖的共顯性CAPS標記。這些工作為分子標記輔助選擇(MAS)自交不親和性奠定了基礎，但目前在甘藍型油菜自交不親和的研究中鮮有應用。
發明內容本發明的目的在于利用已有的自交不親和基因序列設計引物，找到與甘藍型油菜自交不親和性連鎖的SCAR(Sequencecharacterizedamplifiedregions,序列特征擴增區域)分子標記，應用得到的SCAR分子標記對甘藍型油菜自交不親和表型進行快速而又準確的選擇，以加快油菜自交不親和新品系的選育。本發明通過以下技術方案實現申請人通過篩選，得到一批人工創造的甘藍型油菜自交不親和S位點的顯性SCAR分子標記，包括自交不親和系S位點顯性標記和自交不親和恢復系S位點顯性標記，其中自交不親和系S位點顯性標記被分別命名為SRKa，SRKb和SPlla，它們的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1，2，6所示；自交不親和恢復系S位點的顯性標記分別被命名為SLGa，SLGb和SLGc，它們的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:3，4，5所示。一種篩選甘藍型油菜自交不親和S位點顯性SCAR分子標記的方法，其步驟如下-1)以甘藍型油菜自交不親和系S-1300為母本，以來自加拿大的甘藍型油菜自交不親和恢復系Defendor為父本進行雜交，得到F,種子，將種子播種得到植株，對該植株套袋自交得到F2分離群體，取F,植株花粉與SI1300進行回交，獲得Bd分離群體；2)調査F2和Bd植株的自交不親和表型，采用親和指數法進行分類；3)利用同源序列法設計引物，對歩驟l)的S-1300和Defender進行PCR擴增和電泳檢湖IJ，選有差異的引物對F2和Bd分離群體進行標記性狀關聯分析，確定其是否與自交不親和性狀連鎖；4)回收、克隆、測序步驟3)篩選得到的甘藍型油菜自交不親和S位點SCAR標記的DNA片段；5)根據步驟3)所示的引物，獲得兩個多重PCR標記，使其能通過一次PCR反應區分純合親和，雜合親和以及純合不親和三種基因型，并驗證輔助選擇效果。在上述發明中，步驟3)所述的引物的序列如下所示其中與甘藍型油菜自交不親和系的S位點完全連鎖的顯性標記引物的DNA序列如下SRKa正向引物5'-CAAGTTCTAATGAACGAGGTGG-3''反向引物5'-CTGAGGAATAATAGGAGATACG-3';SRKb正向弓I物5'-CGTATCTCCTATTATTCCTCAG-3'，反向引物5'-GCACATGCGGTCATATTATTCT-3';SPlla正向引物5'-CATAAGTCATGAGATATGCTAC-3'，反向引物5'-CCGTCGTATATTGCATAGAGTA-3';其中檢測甘藍型油菜自交不親和恢復系S位點的三個顯性SCAR標記的正、反向引物DNA序列如下所示SLGa正向引物5，-GATTCTACTTCCTCCTGCCT-3，，反向弓I物5'-ATTACAGTCGCTAAGGCACC-3';SLGb正向弓l物5，-GATTCTACTTCCTCCTGCCT-3，，反向引物5'-TTGGATACAGTTACACACCGGT-3';SLGc正向引物5，-GATTCTACTTCCTCCTGCCT-3，，反向引物5'-GAAGACGTTCCATACCACTGAT-3'。申請人已將上述制備的分子標記成功地應用在甘藍型油菜自交不親和系輔助選擇上。本發明的積極效果是本發明成功得到與甘藍型油菜自交不親和S位點完全連鎖的顯性SCAR分子標記，并成功轉化得到兩對多重PCR標記。本發明進行了F2，BChF3,BQF2等不同世代群體的分子標記選擇結果與親和指數法鑒定表型結果的比較，發現無錯選單株，也無檢測到標記與S位點發生重組，證明本發明制備的這些分子標記輔助選擇效率達到100%，可以應用在甘藍型油菜自交不親和品系選育中。利用這些分子標記進行輔助育種，可以克服油菜育種過程中根據表型選擇的缺點，大大的減少育種工作量，縮短育種年限，為快速培育甘藍型油菜自交不親和新品系奠定了基礎。圖l:A是本發明的育種親本之一S-1300自交與剝蕾自交的表現，B是成熟的莢果發育比較。圖2:是本發明得到的SCAR標記在甘藍型油菜品種S-1300和Defendor中的擴增結果。圖中泳道P^戈表S-1300，泳道P2代表Defendor，M表示分子量大小，六對引物如圖所示。圖3:是本發明制備的SLGa標記在油菜BC,群體中的擴增效果。圖中泳道P,為油菜品種S-1300，泳道P2為油菜品種Defendor，泳道3為F,，泳道1-IO為本發明制造的甘藍型油菜自交不親和單株，泳道ll-20為甘藍型油菜自交親和單株，圖中M表示分子量大小。圖4:是本發明制造的SRKa在油菜F2群體中的擴增效果。圖中泳道P,為油菜品種S-1300，泳道P2為油菜品種Defendor，泳道3為F,，泳道1-10為本發明制造的甘藍型油菜自交不親和單株，泳道11-20為甘藍型油菜自交親和單株，圖中M表示分子量大小。圖5:是本發明得到的SRKb標記的DNA序列與目的序列Blast結果，圖5中序列的257bp處有一個堿基"T"的插入(插入位置請參見下劃線處)。圖6:是本發明制備的多重PCR標記SLGb+SPlla在甘藍型油菜自交不親和F2群體的不同基因型單株中的擴增效果。圖中泳道P,為油菜品種S-1300，泳道P2為油菜品種Defendor，泳道3為F,，泳道1-10為本發明制造的甘藍型油菜自交不親和單株，泳道ll-20為甘藍型油菜自交親和單株，圖中M表示分子量大小。具體實施方式實施例l申請人通過篩選，得到一批人工創造的甘藍型油菜自交不親和S位點的顯性SCAR分子標記，包括自交不親和系S位點顯性標記和自交不親和恢復系S位點顯性標記，其中自交不親和系S位點顯性標記被分別命名為SRKa，SRKb和SPlla，它們的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1，2，6所示；自交不親和恢復系S位點的顯性標記分別被命名為SLGa，SLGb和SLGc，它們的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:3，4，5所示。一種篩選甘藍型油菜自交不親和S位點顯性SCAR分子標記的方法，其步驟如下1)以甘藍型油菜自交不親和系S-1300為母本，以來自加拿大的甘藍型油菜自交不親和恢復系Defendor為父本進行雜交，得到F,種子，將F,種子播種得到F,植株，對該植株套袋自交得到F2分離群體，取F^直株花粉與SI1300進行回交，獲得Bd分離群體；2)調査F2和Bd植株的自交不親和表型，采用親和指數法進行分類；3)利用同源序列法設計引物對，對步驟1)的S-1300和Defendor進行PCR擴增和電泳檢測，選有差異的引物對(見表l)進行F2和BQ分離群體標記性狀的關聯分析，確定其是否與自交不親和性狀連鎖；4)回收、克隆、測序步驟3)篩選得到的甘藍型油菜自交不親和S位點SCAR標記的DNA片段；5)根據步驟3)所示的引物，獲得兩個多重PCR標記，使其能通過一次PCR反應區分純合親和，雜合親和以及純合不親和三種基因型，并驗證輔助選擇效果。1、分離群體的獲得以甘藍型油菜自交不親和系S-1300(見文獻馬朝芝等，甘藍型油菜雙低自交不親和系的選育，華中農業大學學報，1998，17(3):211-213)為母本，以來自加拿大的甘藍型油菜自交不親和恢復系Defendor為父本(見文獻沈金雄等，甘藍型油菜自交不親和系雜種優勢的初步研究，華中農業大學學報，2001,20(6):528-530)進行雜交，得到F,種子，將F,種子播種得到Fi植株，對該植株套袋自交得到F2分離群體，取F!植株花粉與S-1300進行回交，獲得Bd分離群體。2、DNA的提取從本發明構建的所有油菜植株的小苗中提取和純化DNA，具體制備方法參照李佳等(李佳等，一種有效提取油菜葉片總DNA的方法，華中農業大學學報，1994，13(5):521-523)報道的方法進行。3、利用親和指數法判斷表型表型調査方法參見Yang等(Yang等，Geneticanalysisoffourself-incompatiblelinesin5ms57'ca"op肌，PlantBreeding,2001,120:57-61)。對所有調査的油菜單株進行套袋自交，當主枝上有3-5朵花開放時，摘除主枝已開花朵和花序中心的小蕾以限制主枝無限生長，然后用硫酸鈉紙袋套住主枝和2-3側枝，每隔一天把紙袋向上抽提，在抽提的過程中用手輕拍紙袋使花粉散落有利于自交授粉，起到輔助授粉的作用。當硫酸鈉紙袋內不再有花開放時，去掉紙袋讓角果充分發育，并根據結實情況和角果發育初步判斷表型(附圖l)。種子成熟時分單株收獲、脫粒，考察主枝結實情況，以親和指數表示，并參考側枝結實情況。按照公式親和指數(Self-compatibilityIndex,SCI)=籽粒數/花朵數。根據親和指數分布結果，參考Yang等(2001)分類研究結果，以該文獻中定義的2為標準，將所有植株分成兩類SCI值為小于2為自交不親和，SCI值為大于2為自交親和。對自交不親和單株選擇兩個分枝進行剝蕾自交收獲種子。遺傳分析表明單位點控制甘藍型油菜自交不親和表型，自交不親和恢復系S位點對自交不親和系S位點為顯性。申請人將甘藍型油菜自交不親和系S等位基因命名為SI，自交不親和恢復系s等位基因命名為sc，這兩個等位基因可組成三種基因型即sisi,scsi,scsc，其中具有SISI基因型的植株表現自交不親和，具有SCSI和SCSC的植株表現自交親和。4、利用同源序列法設計引物，篩選與甘藍型油菜自交不親和S位點連鎖的SCAR標記在美國國家生物技術信息中心(NCBI,NationalCenterforBiotechnologyInformation,http:〃麗w.ncbi.nlm.nih.gov)上已經公布的甘藍型油菜S-A10的SLG基因序列(GenBank登錄號Z21608)和白菜型油菜S60單倍型的SRK基因序列(GenBank收錄號AB097116)和SPll基因(GenBank收錄號AB067446),用Primer3引物設計軟件(httt):〃redb.croDlab.org/modules/redbtools/primer3.pht))設計特異引物。要求引物GC含量為40%-70%,Tm值為60'C-70。C，目標片段長度在4001300bp之間，引物的長度為20bp-22bp，引物內無二級結構，引物間不能相互配對。引物的序列如表1所示。所有引物由上海生物工程公司合成。表l本發明的顯性SCAR標記的引物序列、相位及片段的大小<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>5、PCR擴增條件PCR反應體系lxPCRbuffer,1.35mmol/LMgCl2，0.08mmol/LdNTPs，l.OUTaqpolymerase(四者均為MBIFermentas,Lithuania),100ngDNA，0.45pmol/L正反向引物(Forward,Reverse),ddH20補充至終體積20pl。熱循環參數為94°C3min;94°C30s，復性溫度45s，72°C60s，38個循環；72°C10min，l個循環；4'C保存，反應是在PTC-225PCR儀上完成。擴增產物在水平電泳槽上1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測，使用lxTAE緩沖液(0.04MTris-acetate，0.001MEDTA，pH8.0)，電壓3V/cm，電泳1.5hrs左右。電泳完畢，凝膠成像系統(UVP)拍照保存，記錄多態性結果。6、甘藍型油菜自交不親和S位點的顯性SCAR標記表l所示的六對引物在S-1300和Defendor中的擴增見附圖2。命名為SLGa，SLGb和SLGc的三對引物在Defendor有擴增產物，而S-1300中無。用雜交組合S-1300與Defendor的F2和BC！群體進行標記性狀關聯分析時，發現所有親和單株產生相應的帶型，出現情況一致，而不親和單株如S-1300—樣無任何擴增產物(附圖3)，表明該標記與自交不親和恢復系S等位基因SC完全連鎖。三對引物命名為SRKa，SRKb禾卩SPlla在S-1300中有擴增產物而Defendor中無。用上述同樣的分離群體分析時，除所有不親和單株擴增出目標片段外，2/3的親和單株也出現擴增產物(附圖4)，說明這些標記與自交不親和系的隱性S等位基因SI完全連鎖。7、一回收、克隆、測序篩選到的SCAR標記的片段擴增的目標DNA片段從1.2%的瓊脂糖膠上用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒(購自上海生物工程公司)進行回收。操作程序按試劑盒說明書提供的方法用刀片挖出目標片段放入1.5ml的離心管，加入BingBufferII，置于50-60。C水浴中加熱10min，每隔2min混勻一次；將融化的膠溶液轉移至套在收集管內的UNIQ-10柱中，室溫放置2min，8，000rmp離心lmin;倒掉收集管中的廢液，加入500^WashSolution,8,000rmp室溫離心1min，此步驟重復一次；倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一個收集管中，12,000rmp離心15sec;將UNIQ-10柱放入一根新的1.5ml的離心管中，在柱子膜中央加30piElutionBuffer,室溫放置2min;12,000rmp離心lmin，離心管中的液體即為回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20'C備用。取上述回收的目標DNA片段2pl作模板，用表1所示的引物進行PCR擴增，在1.2%的瓊脂糖膠檢測擴增片段是否為所需的目標片段。如果不是則需要重新擴增回收；如果是所需目標片段則進行下一步TA-克隆操作。回收的目標片段連接在pMDT-18載體(購自TaKaRa公司，大連寶生物公司代理)。操作程序按試劑盒說明書提供的方法試劑盒中試劑在使用前先短暫離心將其收集在管底部；在0.5ml的離心管中建立如表2所示的連接反應體系表2目標片段連接在pMDT-18載體的反應體系反應成分_標準體系SolutionI2.5(_dpMDT-18載體0.5nlDNA2単用移液管來回吸幾次混勻，置4'C冰箱進行過夜連接反應；準備LB液體培養基和LB固體培養基(含100mg/ml氨芐青霉素amp,24mg/ml的IPTG異丙基硫代一p-D—半乳糖苷和20mg/ml的X-Gal5-溴-4-氯-3-吲哚-a-D-半乳糖苷)；從-70。C冰箱中取出感受態細胞放在冰上待它慢慢解凍(大約5min);離心收集連接反應液，取2nl反應液加入到一個已經滅菌的1.5ml離心管(放在冰上預冷)；用手指輕彈裝有感受態細胞的管底以混勻，取50^1感受態細胞加入裝有2pl連接反應液的1.5ml離心管，用手指輕彈混勻，放在冰上20min;在42卩水浴中熱激90sec(勿搖動)，然后在冰上放置2min;加500pl的LB液體培養基后在37。C振蕩培養1.5hrs(150rmp/min);吸取振蕩培養后的轉化液100pl涂在無菌的LB固體培養基上，在37"C放置16-24hrs;藍、白斑篩選，挑選12個陽性克隆在無菌的液體LB培養基(含50ug/ml的amp)振蕩培養16-24hrs;取2nl菌液作PCR模板，用M13引物(正向引物5'-CAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3';反向引物5'-CGGATAACAATTTCACACAGGA-3')擴增，在1.2%的瓊脂糖膠上檢測目標片段是否轉化成功。如果所得的片段比目標片段大200bp左右，證明轉化成功，編號并吸取300pl送給上海生工公司進行序列測定。剩余200nl渾濁菌液加200^50%無菌的甘油在1.5ml無菌的離心管中于-7(TC編號保存。測序結果通過NCBI網站公開使用的BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)軟件，與GeneBank數據庫中公布的甘藍型油菜自交不親和基因進行序列同源性比較(表3)。表中Bn表示甘藍型油菜(Brassicanapus)，Br表示白菜型油菜(B.rapa)，SLG-A10表示自交不親和S-A10位點的SLG基因。結果表明，這些片段與候選基因序列同源性很高。SLGa，SLGb禾口SLGc與同一個序列BnSLG-AlO(GenBank注冊號Z21608)同源性達99%，都是在三個位置有堿基差異，12bp處C突變為G,425bp處A突變為G，711bp處有個簡并堿基S，而BnSLG-AlO對應位置是C。SRKa的片段與BrSRK-60的25072-26129有兩個堿基差異，在lllbp和519bp處發生了A到G的突變。SRKb對應的片段序列與BrSRK-60的26108-26650在257bp處有1個堿基T的插入，其余序列100%相同(附圖5)。SPlla的片段與目的片段BrSPll-60(GenBank注冊號AB067446)在序列5，方向180bp完全不同，而與BrSPll-60(GenBank注冊號AB097116)僅在正向引物的前三個堿基不同，其余432bp100%相同。表3本發明制備的SCAR標記與侯選基因序列同源性標記片段候選基因序列序列相似性(％)GenBank注冊號SLGaBnSLG-AlO99Z2廳SLGbBnSLG-AlO99Z21608SLGcBnSLG-AlO99Z2畫SRKaBrSRK-6099AB097116SRKbBrSRK-6099AB097116SPllaBrSPU-6060AB067446BrSPll-6099AB0971168、轉化多重PCR標記將自交不親和系S位點的顯性SCAR標記和自交不親和恢復系S位點的顯性SCAR標記引物結合轉化成同時區分等位基因的多重PCR標記。經過多次反復實驗，成功得到兩個多重PCR標記，一是SLGa+SRKa,—是SLGb+SPlla。PCR反應體系以100ngDNA為模板，"PCRbuffer,1.35mmol/LMgCl2，0.08mmol/LdNTPs，1.0UTaqpolymerase(四者均為MBIFermentas，Lithuania),引物組合中擴增片段小的引物即SLGa和SPlla0.30pmol/L，另一個引物即SRKa禾口SLGb0.45pmol/L,ddH20補充至終體積20pl。熱循環參數為94°C3min;94°C30s，59°Clmin，72°C90s，35個循環；72°C10min，1個循環；4。C保存。兩個多重PCR標記能夠明確區分純合親和，雜合親和以及純合不親和三種基因型(附圖6)。9、標記性狀關聯分析雜交組合S-1300與Defendor的Fz和Bd群體的基因型和基因頻率分布見表4。表4甘藍型油菜自交不親和分離群體的基因型和基因頻率分布<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>從表4可見，在甘藍型油菜自交不親和F2群體中，等位基因SC和SI的基因頻率為中等，在基因型分布上，SCSI基因型占總數的1/2。在與SI1300回交的兩個回交群體中，等位基因SI的基因頻率為SC的3倍，在基因型分布上，理論上SCSI基因型與SISI基因型分布相等，但實際觀察結果SCSI基因型占優勢。10、多重PCR標記在甘藍型油菜自交不親和系輔助選擇上的應用應用本發明制備的如序列表SEQIDNO:1、2、3、4、5、6所示的分子標記，對甘藍型油菜雜交組合S-1300x06-育9(中國的半冬性油菜(分類命名5fOMfca"印itfL)品系，于2007年9月20日保藏在中國湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCCNO:P200703)的Fz和BC,分離群體進行了檢測。根據多重PCR標記推測單株的自交不親和基因型，依據田間調査和親和指數鑒定表型，結果發現這兩個群體的基因型和基因頻率分布與組合S-1300xDefendor結果相似(見表4)。選S-1300xDefendor的Fz和Bd群體中6個純合親和單株，19個雜合親和單株以及21個純合不親和單株的自交后代對多重PCR標記進行評價。鑒定的甘藍型油菜自交不親和基因型與調査表型結果完全一致，基因型和基因頻率分布也與預期吻合(見表5)。表5甘藍型油菜不同基因型單株后代基因型和基因頻率分布檢測株系(個數)個體數基因型等位基因頻率scscSCSISISISCSI純合親和(6)1971970010雜合親和(19)4421182131110,5080.492純合不親和(21)5130051301序列表<110>華中農業大學<120>甘藍型油菜自交不親和的顯性SCAR分子標記及應用<130〉〈141〉2007-09-22<160>6〈170〉Patentlnversion3.1<210>1<211>翻<212>醒<213>甘藍型油菜(Brassicanapus)<220><221〉gene<222〉(l)..(腦)〈223〉〈220〉〈221>mutation<222>(111)..(Ill)<223>13<220>〈221>mutation<222>(519)..(519)<223〉<400>1c肌gttctaatg犯Cg3ggtggtgttaccatacatttttctggtgaggac60atttgg肌ctttcattgatggetgtttgaagctgttgtcacggCC￡LCCg￡L￡l120catttctctgggtcggaaaaggtggUttggtgttgtttacaaggtataa180gg犯tCELCt3tgaatttttttctttttttgcaatggtg朋240aacccacttagagtttctaatttaacaaaatc犯tatctaatctattaaa300actgat幼cacaattagtacttaactctagttttt￡ictt￡tatatttac組360tact鄉cgtatacactgtgttttat犯cttaact犯cgcgcct犯t犯atttacgtcta420ctta犯acttaccg3ttgaacctaa犯tcatgtggtttgt■atgcatcagtttaatttggtctgC3ga城c犯aac3agcatgtUcggt540ccttggttaaatgttagtctaacc3犯ttatacatagttcggttcactac600attttgtaaatacttaaccaceitaatttcgatccaatata660gt犯ttettceiagg犯ctgtttctcgtcttaaictattgUt720ttgtgtactcggtttttgtttsttgtt犯tstcatggtat780tcatatagcatgtata犯ataacttcgggtagttattatcattatactcg840tgca犯tc犯犯CCgtCg8ttccaaacattgataacattctcctattatt9003CgcattC3tct卿aatac￡iact￡i￡icgcaatctactttca咖ttgc犯atcatgtttg960gcttagcttatattatgtttattatgatgagaaatgtacei1020cet犯t3cgtatctcctattattcctcag畫<210〉2<211>544<212>腿<213>甘藍型油菜(Brassican即us)<220><221〉gene<222>(1)..(544)<223><220><221〉mutation<222>(257)..(257)<223><400〉2cgtatctcctattattcctcagaataaagttactattatttgcgaattgatttttcacaataatatcgtttatacccttaatggattttatagatttattttctagataattgattataacttatatacattgtgttgttatctaaaaattataacataattt3tgatt3aatattaatctaa肪tattt3t33tatctg3gt3tctatattgatgaaa8tatgtcatatatc組aattagtta3teatttattatattgagttttgaatgtgcctacaaaatatcccaatatatctatatcta60t333gctcaaacgttaaaagttaaagcggt120tataattaaaaacaaatttcaagtt肪taa180attaatattttcaaaaaaataaaaataatt240aatattttctattaaaaaeitaaaattaaga300aaacaaaaatatttgtataaagatattttc360aatttcaacccaataatgcatatatatt420taatgtttgattt肌aaeiatttaaaacata480tagtatcgtaagaataatatgaccgcat540544<210>3〈211>805<212>DNA<213〉甘藍型油菜(Brassicanapus)<220〉<221>gene<222〉(1)..(805)<223><220〉<221〉mutation<222>(12)..(12)<223><220>〈221〉mutation〈222>(425)..(425)<223><220><221>mutation<222>(711)..(711)<223〉〈400〉3gattctacttcgtcctgccttttcgattaacactttgtcttctgaagaatctcttacaat60atcaagc犯cagaacacttgtatctcggggtgatgtcttc眺ctcggtttcttcaagac120cacctctagttctcgttggtatctcgggatatggtac犯gaaatttccatatagaaccta180tgtatgggttgCC犯C3g3gataaccctctccccaattccattgg犯ccctcaaaatatc240caacatgaaccttgtcctccttgatcactctaataaatctgtttggtccacgaatcttac300t卿cgtaatg卿gaactcCggtg3tggCagagcttctcgctaatggaascttcgtgat360gagagactccaataacaacgatgc犯gtgaattcttgtggcaaagtttcgattaccctac420卿tgctttgcttccagagatgei咖tgggttac犯cctca幼犯agggct肌sc3ggtt480ccttatatc3tgg卿agttcagatgstccgtc卿cgggg3ttactcgtaceiagctcga540accccgaaggcttcctgagttttatctactgC36lgg,Cgttcg卿gc3tCgg3gtgg600tccatgg肌cttagtgggat3Ctag3ggacc犯aagctgagttacatgga660gtacaatttcgtg鄉娜tcgcttatacattccgaatgascaacaacag720cttctactcg3g3ttgacactaagctccac￡Lgggt￡Lttttgagcgactgacgtgggctcc780gtcatcsgtggtatggaacgtcttc805<210〉4<211>901<212>DNA〈213>甘藍型油菜(Brassicanapus)<220><221>gene〈222〉(1)..(901)<223〉〈220〉<221〉腿tation〈222〉(12)..(12)〈223〉〈220〉〈221〉mutation〈222〉(425)…(425)〈223〉〈220〉〈221〉mutation<222〉(711)..(711)〈223〉〈400〉4gattctacttcgtcctgccttttcgattaacactttgtcttctgaagaatctcttacaat60atcaagcaacagaaceicttgtatctcggggtgatgtcttcgagctcggtttcttcaagac120cacctctagttctcgttggteitctcgggatatggtacaagaaatttccatatag肪ccta180tgtatgggttgcc犯cagagat肌ccctctccccaattccattgg犯ccctc肌犯tEitc240c肌catg咖cttgtcctccttgatcactct肌t犯atctgtttggtccacgaatcttac300tagacgtaatgagagaactccggtgatggcagagcttctcgct犯tggaaacttcgtgat360gagagactccaataacaacgatgcaagtgaattcttgtggcaaagtttcgattaccctac420agatgctttgcttccagagatgaaactgggttacaacctcaaaaaagggctaaacaggtt480ccttatatcatggag犯gttcagatgatccgtcaagcggggattactcgtac犯gctcga540accccgaaggcttcctgagttttatctactgcaaggagacgttcgagagcatcggagtgg600tccatggaacggaatccgatttagtgggatactagaggaccaaaagctgagttacatgga660gtacaatttcacagagactagtgaggaggtcgcttatacattccg肌tgasc犯caEicag720cttctactcg卿ttgacactaagctccacagggtattttgagcgactgacgtgggctcc780gtcatcagtggtatggaacgtcttctggtcttctcctaaccaccagtgcgatatgtacaa840gatttgtgggccttactcttactgtgacgtgaccacatcaccggtgtgtaactgtatcca■a901<210〉5<211〉1099<212>DNA<213>甘藍型油菜(Brassicanapus)<220><221>gene〈222〉(l)..(翻)<223〉<220〉<221〉mutation<222>(12)..(12)<223〉<220〉<221>mutation<222>(425)。(425)<223><220><221〉mutation<222>(711)..(711)<223〉<400>5gattctacttcgtcctgccttttcgattaacactttgtcttctgaagaatctcttacaat60ag幼cacttgtatctcggggtga/tgtcttcgagctcggtttcttcaagac120cacctctagttctcgttggtatctcgggatatggtacaaga犯tttccatatagaaccta180tgtatgggttgccaacagagataaccctctcccc犯ttccattggaaccctcaaaatatc240cttgtcctccttgatcactctaat犯atctgtttggtccacg犯tcttac300gagagaactccggtgatggcagagcttctcgctaatgg犯acttcgtgat360gagagactccaataacaacgatgcaagtgaetttcttgtggcaaagtttcgattaccctac420agatgctttgcttccagagatgaaactgggccttatatcatggagaagttcagatgatccaccccgaaggcttcctgagttttatctacttccatgg犯cgg組ccgatttagtgggatgtsc犯tttcac3g3g3ctegtgaggaggtcttctactcgagattgacactaagctccacgtcatcagtggtatgg犯cgtcttctggtcgatttgtgggccttactcttactgtgacgtagggttcagacccaagaaccggcagcagtga,鄉acgcggctg3gctgcagtgg卿gcc柳aactacgatggct3ttgtcgaccggtgccttagcgactgtaatttacaacctcaetaaaagggctaaacaggtt480gtcaagcggggattactcgtacaagctcga540gcaagg卿cgttcgagagcatcggagtgg600actagaggacca犯agctgagttacatgga660cgcttatacattccgaatgeiscaacaacag720agggtattttgagcgactgacgtgggctcc780ttctcctaaccaccagtgcgatatgtacaa840gaccacatcaccggtgtgtaactgtatcca900ggatctgagaatctcattaagggggtgtat960tggttttgccaggatgaagtatatgaagtt1020cagtattggtgtgaa卿atgtg卿卿g10801099〈210〉6〈211〉435<212〉DNA〈213〉甘藍型油菜(Brassicanapus)<220〉〈221〉gene<222>(1)..(435)〈223〉〈220〉<221〉mutation<222〉(1)..(1)〈223〉〈220〉<221〉mutation<222〉(2)..(2)〈223〉〈220〉<221〉mutation〈222〉(3)..(3)〈223〉〈400〉6cagaagtcatgagatatgctacttctatatatacattttt肌caaatatacactacttat60gtttcatatttttgattttgacatatgttcaaggtaaactatatcaataactttccccct120tttatggacgcUtaggattUtcUacct組tgc組tcataaUttttgttaattta180aagcact卿tgtgggagcttggaaatgccctgaaggcatcgtctatccgagtcctatct240cagg肌ggtgcattaattcc8ggagcacagagtgta犯aaacactatgaagttgagggac300ageiatgttactaattgccgttgtgatacttatagcatgcaaaatcctgcgaggattactt360gctactgttgcaaagttaaatcataattgatcaacgaaacatccagagacggttactcta420tgc組atacgacgg43權利要求1、人工創造的甘藍型油菜自交不親和S位點的顯性SCAR分子標記，包括自交不親和系S位點顯性標記和自交不親和恢復系S位點顯性標記，其中自交不親和系S位點顯性SCAR標記被命名為SRKa，SRKb和SP11a，它們的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1，2，6所示；自交不親和恢復系S位點的顯性SCAR標記被命名為SLGa，SLGb和SLGc，它們的核苷酸序列如序列表SEQIDNO3，4，5所示。2、一種篩選甘藍型油菜自交不親和S位點顯性SCAR分子標記的方法，其步驟如下1)以甘藍型油菜自交不親和系S-1300為母本，以甘藍型油菜自交不親和恢復系DefendOT為父本進行雜交，得到F!種子，將F,種子播種得到F！植株，對該植株套袋自交得到F2分離群體，取F,植株花粉與SI1300進行回交，獲得BC,分離群體；2)調查F2和BC,植株的自交不親和表型，采用親和指數法進行分類；3)利用同源序列法設計引物，對步驟O的S-1300和Defendor進行PCR擴增和電泳檢測，選有差異的引物對F2和Bd分離群體進行標記與關聯分析，確定其是否與自交不親和性狀連鎖；4)回收、克隆、測序步驟3)篩選得到的甘藍型油菜自交不親和S位點SCAR標記的DNA片段；5)根據步驟3)所示的引物，獲得兩個多重PCR標記，使其能通過-次PCR反應區分純合親和，雜合親和以及純合不親和三種基因型，并驗證輔助選擇效果。3、根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟3)所述的引物的序列如下所示其中與甘藍型油菜自交不親和系的S位點完全連鎖的顯性標記引物DNA序列如下SRKa正向引物5'-CAAGTTCTAATGAACGAGGTGG-3'，反向引物5'-CTGAGGAATAATAGGAGATACG-3';SRKb正向弓I物5'-CGTATCTCCTATTATTCCTCAG-3'，反向引物5'-GCACATGCGGTCATATTATTCT-3';SPlla正向弓l物5'-CATAAGTCATGAGATATGCTAC-3'，反向引物5'-CCGTCGTATATTGCATAGAGTA-3';其中檢測甘藍型油菜自交不親和恢復系S位點的三個顯性SCAR標記的正、反向引物DNA序列如下所示SLGa正向引物5'-GATTCTACTTCCTCCTGCCT-3'，反向引物5'-ATTACAGTCGCTAAGGCACC-3';SLGb正向弓l物5，曙GATTCTACTTCCTCCTGCCT-3，，反向引物5'-TTGGATACAGTTACACACCGGT-3';SLGc正向弓I物5，-GATTCTACTTCCTCCTGCCT-3，，反向弓l物5'-GAAGACGTTCCATACCACTGAT-3'。4、權利要求1所述的分子標記在甘藍型油菜自交不親和系輔助選擇中的應用。全文摘要本發明屬于油菜育種領域，具體涉及油菜自交不親和性完全連鎖的顯性SCAR標記及其應用。人工創造了一些甘藍型油菜自交不親和S位點的顯性SCAR分子標記，這些分子標記包括自交不親和系S位點顯性標記和自交不親和恢復系S位點顯性標記，其中自交不親和系S位點顯性SCAR標記被命名為SRKa，SRKb和SP11a，它們的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1，2，6所示；自交不親和恢復系S位點的顯性SCAR標記被命名為SLGa，SLGb和SLGc，它們的核苷酸序列如序列表SEQIDNO3，4，5所示。這些分子標記能夠通過一次PCR就能區分純合親和，雜合親和以及純合不親和三種基因型。應用這些分子標記對甘藍型油菜自交不親和表型進行了驗證。本發明為油菜分子育種提供了實用標記和利用方法。文檔編號C12Q1/68GK101255461SQ20071005335公開日2008年9月3日申請日期2007年9月25日優先權日2007年9月25日發明者傅廷棟,張幸果,沈金雄,涂金星,馬朝芝申請人:華中農業大學