一種重組葡激酶及其高效分泌表達的方法

專利名稱：一種重組葡激酶及其高效分泌表達的方法
技術領域：
本發明涉及一種生物菌株及其制備方法，具體地說是一種葡萄球 菌激酶及利用生物技術高效分泌表達重組葡萄球菌激酶的方法。
技術背景葡萄球菌激酶(Staphylokinase， SAK)是一種由某些金黃色葡萄 球菌(6YapA77ococcM 產生的外分泌蛋白，相對分子量為15.5-18.0kDa。早在1948年，Lack發現金黃色葡萄球菌培養物上清液 中有一種蛋白質(SAK)能溶解人血栓，就引起了許多學者的興趣， 但由于天然SAK來源少、制劑純度不高等一直限制了它的進一步研究 和應用。近年來研究者成功地克隆了^A基因，并在大腸桿菌、枯草 桿菌、鏈球菌和乳球菌中較好地表達了SAK蛋白，從此以臨床應用為 目的的有關重組葡激酶的溶栓作用機制、結構和功能的研究以及建立 在此基礎上的蛋白質工程研究成為近年來新型溶栓劑研究的熱點之 一。關于SAK的研究使人們認識到了它是一種非常有前景的溶栓藥， 其溶栓效果與組織纖溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activator, t_PA)相近，但對血栓的選擇性高于t-PA，并且在大腸桿 菌中可以實現低成本大規模生產，市場價格遠低于t-PA。作為新一代 溶栓藥物，SAK以其專一性高，出血副作用小的特點受到人們的廣泛 關注。在動物模型中，SAK表現出比尿激酶(UK)和鏈激酶(SK)更 好的應用效果，故其應用前景非常被看好。但早期的報道中重組SAK 多以包含體存在，須經過變性、復性后才能得到有活性的表達產物； 國內早期的研究成果已于2005年拿到了世界第一張重組SAK的新藥證 書，但這并未能推廣SAK的應用，這與其價格仍高于普通病人的支付 能力是分不開的；所以本研究擬從金黃色葡萄球菌中分離葡激酶基因，構建其原核表達質粒并期望得到其在大腸桿菌中分泌表達的工程菌，為降低葡激酶的生產成本及臨床推廣應用打下基礎。Sako等于 1983年首先克隆了ssA基因，并在大腸桿菌中實現表達。隨后關于^A 克隆和表達方面的研究日益增多。Sang Jun Lee等(High level secretion of recombinant staphylokinase into periplasm of ^!sc力eric力j'a ccJj'，Biotechnology Letters, 1998)公開了——禾中在大腸桿菌中分泌表達葡激酶的方法，其構成是用PCR技術從含有s^ 基因的金葡菌株NCTC10033中經PCR擴增得到大量saA，并插入含有一 個tac啟動子和一個ompA信號序列的表達載體pKK-ompA，轉化到大腸 桿菌JM109， JM109攜帶重組質粒分泌產生重組SAK: 15mg/L到外周胞 質，5mg/L到胞外，不足之處是產量較低。宋鋼等(低免疫原性的新 型葡激酶A醒Sak在大腸桿菌中的高效表達和分離純化，中國生物化學與分子生物學報，2000)公開了一種在大腸桿菌中高效表達低疫原 性的新型葡激酶的方法，其構成是對已構建的葡激酶N端缺失突變 體(ANSak) cDNA進行改造后得到A麗Sak，插入原核表達載體pLY-4 后轉化JF1125，經溫度誘導，重組蛋白占菌體總蛋白的60%，以包含 體形式存在，不足之處是以包含體形式存在，須經過變性、復性后才 能得到有活性的表達產物。 發明內容本發明的目的就是針對現有技術的缺陷，提供一種葡萄球菌激酶 及利用生物技術高效分泌表達重組葡萄球菌激酶的方法，它克服了現 有技術表達量低及產量低的缺點。本發明的生物樣品保藏號為CCTCC NO: M207112,生物樣品名稱 為大腸桿菌BL21-EpSS/pGEX-4T-l，保藏單位為中國典型培養物保 藏中心，地址湖北省武漢市武漢大學內，郵編430072，保藏日期 為2007年7月23日，其制備方法包括以下幾個步驟(1)擴增葡激酶基因從中國菌種保藏中心購買金黃色葡萄球菌(6YapAWococc^ aw7^a5) AS 1.879，以該菌株染色體DNA為模板，根據已知的葡激酶基 因(含信號肽)的序列設計用于PCR的上游引物 5， - GCGAATTCATGCTCAAAAGAAGTTTAT-3';和下游引物5' -CCGTCGACTTATTTCTTTTCTATAACAAC-3，。 其中GAATTC為fcoM酶切位點，GTCGAC為&Z[酶切位點，ATG為起始密 碼子，TTA為終止密碼子。通過PCR直接擴增葡激酶基因，與pMD-18T 質粒載體重組后，經核苷酸序列分析得到以下序列tea agt tea ttc gac aaa gga aaa tat aaa aaa ggc gat gac gcg agt 48 Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp Ala Ser 15 10 15tat ttt gaa_ cca_ a_ca ggc ccg t3t ttg atg gt已gtg axt gga gtt 96 Tyr Phe Glu Pro Thr Gly Pro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly Val 20 25 30gag ggt aaa gaa aat gaa ttg eta tec cct cat tat gtc gag ttt cct 144 Glu Gly Lys Glu Asn Glu Leu Leu Ser Pro His Tyr Val Glu Phe Pro 35 40 45att aaa cct ggg act aca ctt aca aaa gaa aaa att gaa tac tat gtc 192 lie Lys Pro Gly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys lie Glu Tyr Tyr Val 50 55 60gaa tgg gca tta gat gcg aca gca tat aaa gag ttt aga gta gtt gaa 240 Glu Trp Ala Leu Asp Ala Thr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val Glu 65 70 75 80tta gat cca age gca aag ate gaa gtc act tat tat gat aag aat aag 288 Leu Asp Pro Ser Ala Lys lie Glu Val Thr Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys 85 90 95aaa aaa gaa gaa acg aag tct ttc cct ata aca gaa aaa ggt ttt gtt 336 Lys Lys Glu Glu Thr Lys Ser Phe Pro lie Thr Glu Lys Gly Phe Val 100 105 110gtc cca gat tta tea gag cat att aaa aac cct gga ttc aac tta att 384 Val Pro Asp Leu Ser Glu His lie Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu lie 115 120 125aca aag gtt gtt at已gaa aag aaa taa 411 Thr Lys Val Val lie Glu Lys Lys 130 135與其他專利報道的序列不同處第99位核苷酸為G;第100位 核苷酸為G;第107位核苷酸為A。第33位氨基酸為GLU;第34 位氨基酸為GLY;第3 6位氨基酸為GLU。(2) 將擴增的葡激酶基因與載體pGEX-4T-1連接，構建成表達質粒 將上述克隆的葡激酶基因與原核表達質粒pGEX-4T-l分別用Aco^/^I[雙酶后，然后進行連接，構建成表達質粒并命名為pSS。(3) 用所構建的表達質粒轉化大腸桿菌￡ coh'(^sc力ehch's BL21將上述構建的表達質粒轉化大腸桿菌A coh' BL21，用IPTG誘導 r-Sak基因的表達，工程菌命名為EpSS。(4) 培養轉化的大腸桿菌EpSS在培養基初始pH6. 6、蔗糖2%、誘導前菌體密度為0.8、 IPTG 終濃度為O. 8ramol/L、 25"誘導9h條件下胞質及胞外重組葡激酶活性 均達最高值。本發明用PCR構建基因，基因表達水平極高，r-SAK以分泌方式表 達，以活性狀態存在于菌體外胞質及胞外，純化方法簡單，產量高， 成本低。用本發明的方法在大腸桿菌中表達重組葡激酶蛋白，表達產 物以分泌方式表達，其中外胞質中約20% (300mg/U，胞外約50%(40 mg/L)，且總產量約為340mg/L。本方法不僅在大腸桿菌中表達了可溶 性，有活性的葡激酶，而且分泌表達的表達量及產量均高于已知方法。 說明書附l.是pSS重組質粒的構建。圖2.是EpSS外胞質中表達產物鑒定，其中M:蛋白Marker， l:經 誘導的EpGEX;2: EpSS表達的胞內可溶性蛋白。圖3.是EpSS胞外表達產物鑒定，其中M:蛋白Marker， l:經誘導的 EpGEX;2: EpSS表達的胞外蛋白，3: EpSS表達的胞內可溶性蛋白圖4.是表達產物體外溶栓活性鑒定。其中1.2: SAK標準品，3.4: 陰性對照，5.6:胞內可溶性蛋白，7.8:發酵液上清(胞外蛋白)具體實施方式
以下通過實施例對本發明作詳細描述 實施例一Sak基因工程菌的構建 1、引物設計及PC財廣增根據已知的葡激酶基因(含信號肽)的序列設計上游含有^^/ I 酶切位點、啟動子和葡激酶信號肽的引物，其序列為5， - GCGAATTCATGCTCAAAAGAAGTTTAT-3，； 和下游含有5"a JI酶切位點和終止子的引物5' -CCGTCGACTTATTTCTTTTCTATAACAAC-3'。 其中GAATTC為fco/a酶切位點，GTCGAC為6W頂每切位點，ATG為起始密 碼子，TTA為終止密碼子。引物合成后，以金黃色葡萄菌ASl. 879菌株染色體DNA為模板，循 環參數為94。C45秒一45。C60秒一7(TC70秒，經30個循環，得到ssA 基因片段。2、 cDNA克隆及測序將PCR擴增得到的^^基因片段經P/。瓊脂糖凝膠回收純化后，與載 體質粒pMD-18T重組，轉化大腸桿菌，篩選出含有^^基因的陽性菌株， 命名為pTSS (圖l)。對其進行DNA序列測定，與預期一致。3、 cDNA在大腸桿菌中的表達 pTSS質粒經^co7a/^刀雙酶切，回收ssA基因片段。原核表達載體 口&￡乂-47-1經^^7 [/&^1雙酶切，回收大片段，與回收的ssA基因重組， 轉化大腸桿菌(圖2)。用氨芐青霉素-LB平板篩選，挑取單個菌落， 制備質粒，進行PCR及酶切鑒定，含有ssA基因特征的質粒命名為pSS， 菌株命名為EpSS。 EpSS在37X:培養至朋6。。約0. 6后，力口IPTG 0. lmM(終 濃度)誘導4-6小時后，離心集菌并保留發酵液上清，分別對菌體沉淀(圖3)和發酵液上清(圖4)進行SDS-PAGE分析。4、 表達產物測定(1) 存在狀態測定對工程菌誘導后的培養基上清進行生物活性 測定陽性，且SDS-PAGE顯示培養基上清中有約15. 5kDa的特異蛋白帶， 說明表達產物以分泌狀態存在；對誘導后的工程菌超聲破碎離心，離 心上清分別進行活性測定和SDS-PAGE分析，結果顯示表達產物以可溶的、活性狀態存在。(2) 生物活性測定a.標準曲線的制備稱取O. lg瓊脂糖加入18.6mL滅菌生理鹽水中，加 熱溶解后置56。C水浴中平衡，加入100IU/mL凝血酶11. 2 u L， 0. 5mg/mL人纖溶酶原224nL，混勻后加入6mg/mL的人纖維蛋白原1.76mL后，不停搖勻待渾濁后立即灌入準備好的蛋白電泳板中，充分凝固后，4°C 冰箱中放置30min后，打2mm孔，每孔加入2. 5化不同稀釋濃度的SAK 標準品，做復孔，置濕盒中37'C孵育12h。縱橫向量取溶圈直徑，取 平均值，以標準品溶液各個稀釋度的生物學活性的對數對相應的溶圈 直徑的對數進行直線回歸，求得回歸方程。b.樣品測定以同樣方法制備纖維蛋白板、打孔。將誘導后的 工程菌離心，留取培養基上清及超聲破碎后的工程菌上清，并將超聲 破碎后的工程菌上清稀釋10倍備用。每孔加入準備好的蛋白樣品2. 5 叱，置濕盒中37。C孵育12h后測量溶圈直徑。每個樣品做三次取平 均值，根據供試品的溶圈直徑的對數求供試品的生物學活性。測得的 總活性為2435AU/mL工程菌。 實施例二 EpSS工程菌誘導條件的初步研究根據工程菌EpSS培養過程中涉及的因素，選擇IPTG濃度 (腿ol/U、誘導時間(h)、漢U吸光度、培養基的pH值、培養基中蔗糖含量和誘導溫度rc)六個因素，每因素根據實際情況選擇幾個水平做單因素實驗。將所做的單因素實驗得到的蛋白樣品進行活性測 定，得到EpSS在培養基初始p朋.6、蔗糖2%、誘導前菌體密度為0. 8、 IPTG終濃度為0. 8咖ol/L、 25t:誘導9h條件下胞質及胞外重組葡激 酶活性均達最高值，每升發酵液可收獲2. 435*106AU的重組葡激酶蛋 白。SSAK-DNAAA-SEQUENCE. ST25. seq SEQUENCE LISTING<110〉 三峽大學<120> —種重組葡激酶及其高效分泌表達的方法 <130〉 070903 <160> 1<170> Patentln version 3. 3〈210〉 1〈211〉 411〈212〉 DNA<213〉 Escherichia coli<220〉<221> exon<222> (1).. (411)〈223〉 n X〈400〉 1tea agt tea ttc gac aaa gga aaa tat aaa aaa ggc gat gac gcg agt 48 Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp人la Ser 15 10 15tat ttt gaa cca aca ggc ccg tat ttg atg gta aat gtg act gga gtt % Tyr Phe Glu Pro Thr Gly Pro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly Val 20 25 30gag ggt aaa gaa aat gaa ttg eta tec cct cat tat gtc gag ttt cct 144 Glu Gly Lys Glu Asn Glu Leu Leu Ser Pro His Tyr Val Glu Phe Pro 35 40 45att a犯cct ggg act aca ctt aca aaa gaa aaa att gaa tac tat gtc 192 lie Lys Pro Gly Thr Thr Leu Thr Lys Glu lys lie Glu Tyr Tyr Val 5b ' 55 60gaa tgg gca tta gat gcg aca gca tat aaa gag ttt aga gta gtt gaa 240 Glu Trp Ala Leu Asp Ala Thr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val Glu 65 70 75 80tta gat cca age gca aag ate gaa gtc act tat tat gat aag aat aag 288 Leu Asp Pro Ser Ala Lys lie Glu Val Thr Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys 85 90 95aaa aaa gaa gaa acg aag tct ttx cct ata aca gaa aaa ggt ttt gtt 336 Lys Lys Glu Glu Thr Lys Ser Phe Pro lie Thr Glu Lys Gly Phe Val 100 105 110gtc cca gat tta tea gag cat att aaa aac cct gga ttc aac tta att 384 Val Pro Asp Leu Ser Glu His lie Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu lie 115 120 125aca aag gtt gtt ata gaa aag aaa taa_ 411 Thr Lys Val Val lie Glu Lys Lys 130 l!3權利要求
1、一種葡萄球菌激酶，其核苷酸序列如下tca agt tca ttc gac aaa gga aaa tat aaa aaa ggc gat gac gcg agt 48Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp Ala Ser1 5 10 15tat ttt gaa cca aca ggc ccg tat ttg atg gta aat gtg act gga gtt 96Tyr Phe Glu Pro Thr Gly Pro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly Val20 25 30gag ggt aaa gaa aat gaa ttg cta tcc cct cat tat gtc gag ttt cct 144Glu Gly Lys Glu Asn Glu Leu Leu Ser Pro His Tyr Val Glu Phe Pro35 40 45att aaa cct ggg act aca ctt aca aaa gaa aaa att gaa tac tat gtc 192Ile Lys Pro Gly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys Ile Glu Tyr Tyr Val50 55 60gaa tgg gca tta gat gcg aca gca tat aaa gag ttt aga gta gtt gaa 240Glu Trp Ala Leu Asp Ala Thr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val Glu65 70 75 80tta gat cca agc gca aag atc gaa gtc act tat tat gat aag aat aag 288Leu Asp Pro Ser Ala Lys Ile Glu Val Thr Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys85 90 95aaa aaa gaa gaa acg aag tct ttc cct ata aca gaa aaa ggt ttt gtt 336Lys Lys Glu Glu Thr Lys Ser Phe Pro Ile Thr Glu Lys Gly Phe Val100 105 110gtc cca gat tta tca gag cat att aaa aac cct gga ttc aac tta att 384Val Pro Asp Leu Ser Glu His Ile Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu Ile115 120 125aca aag gtt gtt ata gaa aag aaa taa 411Thr Lys Val Val Ile Glu Lys Lys130 135其分類命名為大腸桿菌BL21-EpSS/Pgex-4T-1，保藏號為CCTCCNOM207112。
2、 一種高效分泌表達重組葡萄球菌激酶的方法，它包括以下幾個步驟(1) 以金黃色葡萄球菌(6Y，力j^ococc〃5" a〃re〃s) AS1. 879的 菌株染色體DNA為模板，以5' - GCGAATTCATGCTCAAAAGAAGTTTAT-3， 作為上游引物，以5， -CCGTCGACTTATTTCTTTTCTATAACAAC-3，作為下 游引物進行PCR擴增，其中GAATTC為^bo^酶切位點，GTCGAC為&^1 酶切位點，ATG為起始密碼子，TTA為終止密碼子，引物合成后，以金 黃色葡萄菌ASl. 879菌株染色體DNA為模板，得到葡激酶基因基因片 段；(2) 將上述克隆的葡激酶基因與原核表達質粒pGEX-4T-l分別用i5bo^/6^Z[雙酶后，然后進行連接，構建成表達質粒并命名為pSS;(3) 將上述構建的表達質粒轉化大腸桿菌A coh'BL21，用IPTG 誘導r-Sak基因的表達，工程菌命名為EpSS。(4) 篩選出含有ssA基因的陽性菌株，得到葡萄球菌激酶。
3、 根據權利要求2所述的一種高效分泌表達重組葡萄球菌激酶的 方法，其中引物合成后，以金黃色葡萄菌AS1.879菌株染色體DNA為模 板，循環參數為94"45秒一45。C60秒一7(TC70秒，經30個循環，得到s^基因片段。
4、 根據權利要求2所述的一種高效分泌表達重組葡萄球菌激酶的 方法，其中EpSS在培養基初始p朋.6、蔗糖2%、誘導前菌體密度為O. 8、 IPTG終濃度為O. 8mmol/L、 25。C誘導9h條件下進行表達。
全文摘要
一種葡萄球菌激酶及利用生物技術高效分泌表達重組葡萄球菌激酶的方法。它以金黃色葡萄球菌的總DNA為模板，通過PCR擴增，獲得含信號肽的葡激酶(Sak)基因。該基因序列第33、34及36位氨基酸，不同于已報道的Sak基因。將該基因與載體pGEX-4T-1進行連接，轉化宿主菌，獲得的重組工程菌，經IPTG誘導可分泌表達具有纖溶酶原激活作用的重組葡激酶。采用本發明方法表達重組葡激酶蛋白，基因表達水平高，表達產物主要為分泌型蛋白，并以活性狀態存在于菌體外胞質及胞外，因此，純化工藝簡單，產量高，生產成本低。
文檔編號C12N9/48GK101240284SQ200710053340
公開日2008年8月13日 申請日期2007年9月20日 優先權日2007年9月20日
發明者樂超銀, 敏 劉, 偉 姚, 戴建武, 薇 梁, 梁宏偉, 偉 謝, 郭政紅, 凡 陳, 陳發菊 申請人:三峽大學