一種具有防御素功能的粟酒裂殖酵母工程菌及其構建方法

專利名稱：一種具有防御素功能的粟酒裂殖酵母工程菌及其構建方法
技術領域：
本發明公開了一種具有防御素功能的粟酒裂殖酵母工程菌及其構建方法 背景技術自然界生物體內廣泛存在著一種抗菌多肽，過去由于哺乳動物存在有效的抗原特異性反 應因而長期沒有引起重視。然而近年來由于抗菌肽的缺失或失活引起的各種疾病，尤其是越 來越多的對經典抗生素耐藥性的出現，使得抗菌肽重新受到研究者的重視。抗菌肽研究的真正興起是從20世紀80年代初開始的。1980年，Bontan等人從美國天蠶蛹中 分離得到了具有抗菌活性的多肽——cer叩ins,并于次年在Nature上公布了其氨基酸序列。 同年，Hirsh等人從兔的巨噬細胞中分離到了另一種抗菌性多肽——防御素(defensins)，并 于3年后公布了其氨基酸序列。在過去20多年，已發現500多種防御素，有的種類分布極廣。 其中某些防御素對一些致病細菌和真菌具有很強的抗性。防御素與常規的抗生素不同，抗生素是通過一系列酶合成的產物，而防御素則是某個特 定基因編碼的產物。在殺菌機制上，抗生素一般是通過抑制細菌細胞壁、蛋白質或DNA等的 合成來達到殺菌的目的，所以抗生素的抗菌一般是用特殊的受體，細菌容易通過變異對抗生 素產生抗性，而防御素抗菌時一般沒有特殊的受體，它一般是通過物理作用造成細胞膜的穿 孔而達到廣譜抗菌的效果，所以防御素的使用不容易產生抗性和交叉抗性。許多已報導的防御素基因都已在大腸桿菌中表達，但表達水平低、多肽不能分泌，而且 提取有很大困難，離工業化應用的目標還有一定的距離，所以人們將目光轉向了酵母表達系 統。酵母表達系統是近年來興起的一個真核高效表達系統,具備獨特的優點菌體自身分泌蛋 白較少，外源目的基因通過整合型質粒進入酵母染色體組，結構比較穩定，特別是可對表達的
外源蛋白進行翻譯后修飾和加工,如二硫鍵的形成、糖基化等，在表達外源基因方面應用越來 越廣泛，并且己經建立了合適的培養方法，操作簡單。目前應用的酵母表達系統有釀酒酵母 (& cc/jflramy c^cerevWea)、 巴斯德畢赤酵母(P!'cWa paWonj )和粟酒裂殖酵母 (Sc/nz仍acc/ ara，c^pom6e)系統。用粟酒裂殖酵母作為宿主直到最近才引起重視，國外目 前利用裂殖酵母成功表達外源蛋白的例子很多，但國內研究報道極少。粟酒裂殖酵母與其它 的酵母相比在進化上更高級，2002年2月基因組的測序及其各基因功能的取得更有利于研究外 源蛋白在粟酒裂殖酵母中的表達。粟酒裂殖酵母(S.pom&)是一種單細胞的、真核生物，擁有同高等生物極其相似的屬性-染色體結構和功能、細胞循環的控制以及RNA的拼接，這些屬性使S.pom&成為生產真核蛋白 的理想系統。5^om&被用來通過基因互補來克隆真核基因，意味著在S.;wm6e中異質基因的 表達是活躍的。利用各種表達構建大量的polyoma virus middle-T抗原、the human antithrombin III、 the human liver epoxide hydrolase 、 the human blood coagulation factor XIIIa、 the human lipocortin I 、 rat arginase、 rat NDP-kinase、 human interleukin-6(IL-6)、 Arabidopsis thaliana sugar transporter STP1等高等真核基因，已在S./ww&被表達和純化。

發明內容
本發明的目的是提供一種具有防御素功能的粟酒裂殖酵母工程菌及其構建方法。 本發明所提供的重組粟酒裂殖酵母工程菌，是將構建的含有防御素基因的重組粟酒裂殖酵母表達載體導入粟酒裂殖酵母中獲得的。本發明所提供的重組粟酒裂殖酵母工程菌的構建方法是將防御素基因插入到粟酒裂殖酵母表達載體pESP-2的多克隆位點處，將構建的該重組粟酒裂殖酵母表達載體導入粟酒裂殖酵
母中，獲得重組粟酒裂殖酵母轉化子，培養重組粟酒裂殖酵母使防御素基因得到表達。本發明所述的防御素基因來源于綠豆基因組DNA，為綠豆防御素基因(Dl)，其核苷酸 序列如SEQ ID NO. 1所述，以粟酒裂殖酵母表達載體pESP-2為出發載體,構建含有防御素基 因的重組粟酒裂殖酵母表達載體為pESP-2-Dl。本發明選用五SP表達系統，采用pESP-2質粒作為表達載體。這種質粒源自；^/m"ctz>/ /嚴噬菌粒且由如下四部分組成(l)一個ColE I復制起始點和氨芐青霉素抗性基因(ampicillin resistance.Amp+)，其允許在大腸桿菌(￡ co/力克隆時進行載體的復制和抗生素選擇；(2)—個 arsl序列可以提供在粟酒裂殖酵母0^o附6e)中使載體自動復制所需要的復制起始點；(3)選擇 標記基因LEU2-d，源自釀酒酵母可以作為向粟酒裂殖酵母(S.pom&)細胞中轉化表達結構的選 擇標定物；(4)一個表達盒，包括粟酒裂殖酵母(S.jwm6e)全長的nmtl啟動子(Pn礎)-終止子 (Tnmtl)，其中夾著一個GST(glutathione S-transferase)基因和一個多克隆位點(multiple cloning site,MCS)。 pESP-2的MCS處有一個N端使之與GST相結合。帶有PnmtI的表達載體被廣泛應用于活體基因功能的研究。該載體是含有融合蛋白(GST)、防御素基因、Pnmrt啟動子和終止子序列、多克隆位點以及篩選標志的重組粟酒裂殖酵母表達載體pESP-2—Dl。 pESP-2質粒 的物理圖譜如圖l所示。本發明所述防御素基因位于粟酒裂殖酵母表達載體的多克隆位點處的Nhel和BglII限制 性內切酶酶切位點之間。本發明所述篩選標記有兩種， 一種為氨芐青霉素抗性基因(ampicillin resistanceAmp+)，其 允許在大腸桿菌克隆時進行載體的復制和抗生素選擇； 一種為選擇標記基因LEU2-d，源自釀 酒酵母可以作為向粟酒裂殖酵母(5.;^附^)細胞中轉化表達結構的選擇標定物。
本發明所述的粟酒裂殖酵母表達載體以PESP-2為出發載體，構建含有D1基因的重組表達 載體為pESP-2-Dl,獲得的重組粟酒裂殖酵母工程菌為SP-Q01/pESP-2-D1。本發明所提供的防御素基因表達的方法，是將構建的含有防御素基因的重組粟酒裂殖酵 母表達載體pESP-2—D1的質粒DNA，采用電穿孔法導入粟酒裂殖酵母SP-QOl中，獲得重組 粟酒裂殖酵母轉化子，培養重組酵母轉化子使防御素基因得到表達，重組酵母表達的時間為 2-6天。本發明具有以下優點本發明所提供了具有防御素活性的粟酒裂殖酵母工程菌及其構建方法，彌補了傳統防御素制備方法以及原核表達系統、釀酒酵母和畢赤酵母表達系統的不足。(1) 防御素基因在原核表達系統大腸桿菌中表達會對宿主菌構成較大傷害，而且提取有 很大困難，離工業化應用的目標還有一定的距離。(2) 雖然粟酒裂殖酵母屬于酵母類，但粟酒裂殖酵母與其它的酵母相比在進化上更高級， 其類似的操作技術也能應用于其它的酵母，但很多性質不同于芽殖的釀酒酵母，如本發明所 用的是含有內含子的防御素基因轉入釀酒酵母中不能表達，但同樣的基因在粟酒裂殖酵母中 卻獲得了表達，其產物表達水平高，并具有正常的生物學活性。這樣在進行工程菌構建時就不 需要提取總RNA在進行反轉錄來克隆防御素基因，只需要提取其總基因組DNA,成本低、省時 省力。(3) 本發明所用的粟酒裂殖酵母表達菌株是SP-Q01,是用于ESP酵母表達和純化系統 中的單倍體菌株，含有h—交配型的和leul-32基因型，這個表達菌株包括一個變異的LEU1基 因，它編碼亮氨酸生物合成必備的3-丙基脫氫酶，LEU1基因突變導致亮氨酸營養缺陷。而選 用的表達載體卻含有選擇標記基因LEU2-d，就可以通過基因互補直接對轉化子進行篩選，提
高了篩選效率；而畢赤酵母系統需要用價格昂貴的抗生素進行篩選。(4)本發明所獲得的工程菌在進行培養使防御素基因獲得表達時，無需加入誘導物，彌 補了傳統防御素制備方法以及原核表達系統、釀酒酵母和畢赤酵母表達系統的不足。S./wm6e 中的PnmU被培養基中硫胺(維生素B,)的濃度嚴格調控，當培養基中含X).5pM硫胺時，Pnmtl 就被強烈的抑制，防御素基因不表達，而當培養基中不含硫胺時，啟動子的誘導率約為400 倍，防御素基因高度表達。防御素產品因具有廣譜抗菌作用，對畜禽有促生長、保健和治療疾病的功能，屬無毒副 作用、無殘留、無致細菌耐藥性的一類環保型制劑。由于防御素分子小，分離提取存在一定 的困難，故天然資源有限。但其分子空間結構較大，能耐受詞料制粒時的高溫。本試驗采取 基因工程方法，利用粟酒裂殖酵母表達系統表達生產防御素，規模化發酵生產防御素。產品 在推廣應用后不會出現工程菌的擴散而導致環境生態問題。防御素以工程菌工業化發酵生產 的方法可大規模生產，生產成本低且不受季節和氣候變化等外在環境的影響。防御素基因在 酵母中克隆并表達成功，為進一步研究防御素的抗菌活性、影響因素和其在醫藥、畜牧業生 產上的應用奠定基礎，防御素有望成為替代抗生素的無毒副作用、無殘留、無致細菌耐藥性 的新型詞料添加劑和抗菌藥物抗生素在疾病防治中具有非常重要的地位。因此，若將發明應 用于工業化防御素的生產，則具有生產規模大，防御素活性高，生長周期短，提取成本低的 優點，具有重要的實際意義和廣闊的開發前景。


圖1為粟酒裂殖酵母表達載體pESP-2的物理圖譜。圖2為含有防御素基因的重組粟酒裂殖酵母表達載體構建流程圖。
圖3為防御素基因PCR擴增結果。圖4為重組克隆載體pMD18-T-Dl的PCR和酶切鑒定。圖5為重組粟酒裂殖酵母表達載體pESP-2-Dl的PCR鑒定。圖6為重組粟酒裂殖酵母表達載體pESP-2-Dl的酶切鑒定。圖7為重組粟酒裂殖酵母表達載體pESP-2-Dl的電穿孔轉化子。圖8為重組粟酒裂殖酵母菌株SP-Q01/pESP-2-Dl質粒DNA的PCR鑒定。圖9為重組粟酒裂殖酵母菌株SP-Q01/pESP-2-Dl表達產物的SDS-PAGE分析。圖10為重組粟酒裂殖酵母菌株SP-Q01/pESP-2-Dl表達產物抑菌活性檢測結果。下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。實施例1、防御素基因的克隆1、 以東北綠豆(Mgrarafifeta)為材料，采用改良的CTAB法進行基因組DNA的提取。2、 引物設計根據GenBank已發表的防御素基因Dl (GenBank的登錄號為AY437639)的DNA序列， 應用PrimerPremier5.0引物設計軟件分別設計一對特異性引物，為了便于定向克隆和載體構 建，在上游引物和下游引物的5'端分別加入限制性內切酶位點和保護堿基(畫線部分為加入 的酶切位點)Dl上游引物5'-TTT GCTAGCTTG GAT CCA CCT CAA CAA TTC ATC ACT C -3， (Nhel) 下游引物5'-GGT AGA TCT GGG AAT TCC GAA AAG GGT TCAACA G -3' (BglII) 3、防御素基因的PCR擴增以東北綠豆(K/卵a raoYate) DNA為模板，通過PCR擴增防御素基因的DNA片段，PCR
擴整的反應體系使用大連寶生物公司的Taq酶。PCR反應結束后，全量反應液進行1%瓊脂 糖凝膠電泳檢測反應產物，結果如圖3所示圖3為防御素基因電泳檢測圖(泳道1、 2為 PCR產物，泳道3為DNA分子量標準)泳道l、 2在355bp處有一條清晰條帶，所得結果與預 期結果相符。綠豆防御素基因(Dl)的核苷酸序列如SEQ ID NO. l所述。4、 重組克隆載體的構建PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分離后，采用V-gene公司的DNA Gel Extraction Kit回收 目的片斷。將回收的目的片段分別克隆到pMD18-T Vector,進行藍白斑篩選。在Eppendorf 管內配制10pl反應體系，混勻16'C反應16h。反應液直接轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞， 用含50mg/mlAmp+的LB抗性平板37。C培養過夜進行篩選。5、 對陽性菌落進行鑒定1) 重組克隆載體質粒DNA的提取對于每一個連接，挑取在上述抗生素平板上長出的單菌落接于5ml含50mg/ml Amp+的液 體LB培養基中，190rpm, 37'C過夜培養。次日，取400y 1菌液于1. 5mlL離心管中，加80% 甘油存于-80'C冰箱。其余菌液用堿裂解法提取質粒DNA。2) 重組克隆載體質粒DNA的PCR和酶切檢測以重組質粒認A為模板，分別PCR擴增防御素基因，反應體系和反應條件同上；同時對 重組質粒DNA做限制性內切酶雙酶切(Nhel和BglII)， 酶切體系20u 1，混合液置于37')C 反應3h。反應結束后，對PCR和酶切產物進行1% Agarose凝膠電泳，觀察片段的位置和大 小。結果如圖4所示圖4為Dl基因電泳檢測圖(泳道1為酶切產物，泳道2為20ulPCR 產物)泳道l、 2在355bp處各有一條清晰條帶，結果與預期結果相符，初步證明克隆載體構
建成功。將PCR和酶切鑒定都正確的重組克隆載體分別命名為pMD18-T-Dl，然后將保存的菌液 送去測序，測序由北京三博遠志公司完成。Dl測序結果與Genebank AY437639防御素Dl基因 同源性達99.08%，表明所克隆的防御素基因都正確，達到預期目的。 實施例2、防御素基因重組粟酒裂殖酵母表達載體的構建含有目的基因的重組粟酒裂殖酵母表達載體pESP-2-Dl的構建過程如圖2所示,具體步驟 如下1、 重組粟酒裂殖酵母表達載體的構建堿裂解法大量提取重組克隆載體pMD18-T-Dl和表達載體pESP-2(購自美國Stratagene公司) 質粒DNA，然后分別雙酶切重組克隆載體pMD18-T-D1和粟酒裂殖酵母表達載體pESP-2。酶切 體系20u 1， pMD18-T-D1和pESP-2用限制內切酶Nhel和BglII雙酶切，37。C酶切3h。反應 結束后，全量反應液于1%的瓊脂糖凝膠電泳，分別回收DNA。最后分別用T4DNA連接酶連接 目的片段和載體，反應體系10ul，混勻，16'C反應16h。反應液直接轉化大腸桿菌DH5a感 受態細胞，用含50mg/mlA卿+的LB抗性平板37'C培養過夜進行篩選。2、 重組粟酒裂殖酵母表達載體的鑒定1) 重組粟酒裂殖酵母表達載體質粒DNA的提取對于每一個連接，挑取在上述抗生素平板上長出的單菌落接于5ml含50mg/ml AmP+的液 體LB培養基中，190rpm， 37。C過夜培養。次日，取400ul菌液于1. 5mlL離心觀管中，加 80%甘油存于-8(TC冰箱。其余菌液用堿裂解法提取質粒DNA。2) 重組粟酒裂殖酵母表達載體PCR和酶切鑒定 以重組表達載體質粒DNA為模板，分別對表達載體質粒進行PCR擴增和限制性內切酶雙 酶切，反應體系和反應條件同重組克隆質粒的PCR檢測和酶切檢測。反應結束后，對PCR和 酶切產物進行1% Agarose凝膠電泳，觀察片段的位置和大小。結果如圖5、 6所示圖5為 重組粟酒裂殖酵母表達載體PCR電泳檢測圖(泳道1為DNA分子量標準，泳道2為PCR產物)； 圖6重組粟酒裂殖酵母表達載體酶切電泳檢測圖(泳道1、 2為酶切產物，泳道2為DNA分子 量標準)，結果與預期結果相符，證明重組表達載體構建成功，將PCR和酶切鑒定都正確的為 陽性菌種命名為pESP-2-Dl。實施例3、重組粟酒裂殖酵母表達載體的轉化及鑒定1、 堿裂解法大量提取重組粟酒裂殖酵母表達載體pESP-2-Dl的質粒DNA。2、 電穿孔轉化法宿主菌SP-Q01YCD培養基酵母浸粉10g，葡萄糖20g，水解酪蛋白2g，山梨醇218.6g溶于1L蒸餾水中 1.2M山梨醇218.604g山梨醇溶于1L蒸鎦水中。 EMM培養基(L):15.5mM lllmM0.1%(v/v)1000X stock鄰苯二甲酸氫鈉14.7mM Na2HP04 NH4C1 93.5mM 葡萄糖Salts2 %(v/v) 50Xstock Vitamins Minerals 0.01%(v/v)10000X stock Salts (50Xstock) (L)MgCl2' 6H20 0.26M CaCl2* 2H20 4.99mM KC1Vitamins (1000X stock)0.67M Na2S0414.1mM泛酸 肌醇4.20mM 煙酸55.5mM 生物素81.2mM 40.8UmMinerals (10000X stock) (L)硼酸80.9mM MnS04ZnS04 7H2013.9mM FeCl3* 6H20鉬酸2.47 mM KI23.7mM7.40mM6.02mM47.6mMCuS04 5H20 1.60mM 擰檬酸1)酵母感受態細胞的準備(1)將酵母單菌落過夜培養于lOmlYCD液體培養基中30°C， 190rpnu(2)次日將10ml菌液轉入250mlYCD中30°C, 250rpm過夜培養，至0D6。。=0. 7C(3)將細胞放到冰浴上15min，使其停止生長((4)輕輕將細胞倒入無菌250ml離心管中，3000rpra, 15min， 4 °C,收集菌體c(5)棄上清，將收集細胞的離心管置于冰上。(6)每管加入50ml滅過菌的冰上預冷的1.2M山梨醇懸浮細胞沉淀，加山梨醇至 250ml，3000g, 5min，4。C，收集菌體，棄上清。(7)重復步驟6。(8)加入20ml滅菌冰上預冷的1. 2M山梨醇懸浮沉淀，每管分裝200 y 1，將細胞放到冰上,盡可能快的用于電擊-2)用BIO-RAD MicroPluser進行電擊(1) 將預轉化的質粒DNA(約Wg)加入到200 u 1感受態細胞中，混均。(2) 將MicroPluser設為"ShS"。(3) 將DNA細胞樣品轉入0. 2cm已預冷的電擊杯中，輕輕敲打管底懸浮液，1. 5kv， 25PF， 200 Q， 4.48ms電擊一次。(4) 將杯拿出，加入冰冷的1. 2M山梨醇0. 8ml，然后將稀釋的細胞轉入到滅菌的離心管中。(5) 室溫下，將離心管室溫放置40-60min，使電擊細胞在1. 2M山梨醇的微量培養基中培養 生長。(6) 將液體平鋪于EMM-thiamine篩選培養基平板上，3(TC培養4 6天，直到長出單菌落。 結果如圖7所示圖7為pESP-2-Dl篩選出的酵母轉化子。3、重組粟酒裂殖酵母轉化子的分子鑒定1) 挑取E畫-thiamine篩選培養基平板上的單菌落于E醒-thiamine液體培養基中，30 'C培養2天，使用試劑盒提取酵母質粒，將質粒DNA儲存于-2(TC冰箱。2) 重組粟酒裂殖酵母轉化子質粒DNA的PCR鑒定將上述提取的質粒DNA進行PCR鑒定，反應條件和反應體系同重組克隆質粒的PCR檢測。 將PCR產物在1%的瓊脂糖凝膠中進行電泳分析，觀察片段的位置和大小。圖8為Dl基因電泳 檢測圖(泳道1為PCR產物，泳道2為DNA分子量標準)泳道1在355bp處有一條清晰條帶， 結果與預期結果相符，證明得到重組菌株。將鑒定正確的陽性菌株命名為SP-QOl/pESP-2-Dl。實施例4、防御素基因在粟酒裂殖酵母中表達的檢測1、目的蛋白的誘導表達YES培養基酵母浸粉0.5%(w/v)葡萄糖3.0%(w/v) 腺嘌呤,組氨酸，亮氨酸,尿嘧啶，賴氨酸，氫氧化物50-250 mg/1 PBS緩沖液(100ml): NaCl 0.82g KC1 0.02gNa2HP04 0.36g KH2P04 0.025gESB緩沖液(可在4'C貯存數天)80 mmol/L Tris-HC1 (pH 6.8) 10%甘油 2% SDS 1.5% 二硫基蘇糖醇(DTT) 0. lmg/ml溴酚藍1) 酵母細胞培養的準備(1)將含有重組質粒的酵母轉化子細胞及含有空載體的酵母轉化子細胞接種到含5ml YES培養基的指型管中，250rpm、 30。C下過夜培養。(2) 接種約lnd過夜酵母細胞于含10ml YES培養基的50ml的三角瓶中過夜培養，直到 0D=0. 2-0.4。(3) 250rpm、 30°C繼續培養約5小時，使OD=0. 7-1.0。(4) 將10ml的細胞分裝入兩個50ml的離心管中，每個5ml。用"沒誘導"標志一試管，另 一試管標志"誘導"。(5) 1000g、室溫下離心5min，收集酵母細胞沉淀。(6) 棄上清，每管中加入50ml的去離子水洗滌酵母細胞沉淀，lOOOg、室溫下離心5min棄上清。(7) 重復一次步驟5。2) GST蛋白的誘導步驟(1) 將酵母細胞沉淀分別培養于10ml EMM培養基中，加的5mM抽濾的硫胺于標記"沒 誘導"的試管中，250rpm、 30°C培養酵母細胞18 20個小時。(2) 為判斷重組蛋白誘導是否成功，分別吸移lml的菌液于1.5ml離心管中。1000g、 4°C 下離心5min收集酵母細胞沉淀。(3) 棄上清，保存酵母細胞沉淀于-80°C，在下一步的SDS-PAGE驗證中使用。(4) lOOOg、室溫離心5min后收集三角瓶中剩余的酵母細胞。(5) 棄上清，用10ml的冷PBS回溶酵母細胞沉淀。(6) 1000g、室溫離心5min，棄上清，在下一步蛋白純化中應用。2、 酵母蛋白的提取(1) 向GST蛋白的誘導步驟3中得到的酵母細胞沉淀中加入50mmol/L Tris-HCl(m=7. 5) 和10ramol/L疊氮化鈉溶液懸浮沉淀。(2) 12000rpm， 5min， 4'C離心收集沉淀細胞。(3) 棄上清，用30 yl ESB緩沖液懸浮細胞。(4) IO(TC保溫3min，使蛋白酶失活之后，將樣品存放于-2(TC。(5) 加入0. 3g直徑0. 2mm的玻璃珠，劇烈振蕩混合2min。(6) 加入150ul ESB緩沖液，稍加振蕩，置10(TC 保溫lmin。(7) 取5 20ul抽提液上樣進行SDS凝膠電泳。3、 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析將上述所提蛋白進行SDS-PAGE，結果如圖9所示在約35KD處有一特異蛋白帶，與已知 的理論分子量一致，說明防御素基因在粟酒裂殖酵母中得到了表達。4、瓊脂凝膠擴散法對防御素基因進行生物學活性測定轉化的酵母接種于EMM培養基中培養至對數中后期，離心(4 000r/min)收集菌體，細胞 重懸于5 ml預冷的PBS，加入5(^120%的Triton X-IOO，充分混勻后冰浴30 min。超聲波破 碎細胞，超聲循環為超聲l S:間隔l S;全程40 S。重復4次，每次間隙時將菌液在冰浴 中混勻，避免局部溫度太高，使蛋白質變性。樣品暫存于-20'C冰箱中備用。以金黃色葡萄球 菌為試驗敏感菌，挑單菌落接種于液體培養基中過夜培養，加入到冷卻至50。C左右的固體培 養基內搖勻后鋪板。待培養基凝固后用無菌打孔器在平板上打直徑為0.5mm的小孔，滴加50^1 上述樣品點于瓊脂平板孔中檢測其抑菌活性，并滴加50jilPBS作對照(作用16-18h檢測)。 結果見圖10: 1為PBS， 2、 3為抑菌圈。經生物學活性實驗檢測，防御素基因在酵母中得到表達。
序列表〈110〉吉林農業大學〈120〉一種具有防御素功能的粟酒裂殖酵母工程菌及其構建方法〈130〉wangpiwu200707〈160〉1〈170〉Patentln version 3.2〈210〉1〈211>1115<212〉腿〈213〉綠豆〈400〉1aaactttc3gcttcttgttcttgctccttcttgtcttagcCtCtggt33gatgcatatac60aatatacaattctctctctatatatatatagttatgatgttattttactg120attaatgtgttatgatgtg3aatcagatgtggccgt卿g卿gg卿ggctagaacttg180t3tgELtaEL已gBaag犯gggtggggaaaatgcttaattgax;accacctgtgcacsttcgtg240caagaaccgcggttacataggtgg咖ttgc犯aggcatgacgcgcacctgctattgcct300cgtc犯ctgttgaacccttttcgagatctcatgcatgcixtgtcctgacccgggt朋卿360gaatgtctccct"tgcca.gtactgctagggtttttctttcagcccattcaa420gctgcatattacgattttgtttttcgctttt卿aagtggtttagatgag480犯ttcttgatctccgacaacgagtacttttatttt"ttttgctaatcaLctttactcaatat540tagctcgaaatcgtagaaacgt卿cgggtgcg卿taccgagtggtgtagtt犯gaatt600acgtggcccacccaaaacgtgtatacttta660agaaggctataccccttcgtgttagatgtagttttagctaCCCMCCCg3gtct3tgagc720ttgacttcaggcWt￡Laatcgttttg犯ta11 aat t aaaa780attaaatatttaaaagcaatcatacgctgaa犯tttagtgctgtggct犯tcct"tcacat840gaaatgcceitaaaagtgactcaggtagt犯ctcatctact900tcattgactttgttacagcatgtg卿gst3tttatgctaaatcgtsigttacatc已tagt960aatactatgaaatcgacagatgccgcatgagcattggcttgggaatagtx1020aaaaac 111 atgatctagtccctcgcgccctgctgatgtc1080agaaccttgcgatt犯ttagacatggtaga111權利要求
1、一種具有防御素功能的粟酒裂殖酵母工程菌，其特征在于是將構建的含有防御素基因的重組粟酒裂殖酵母表達載體導入粟酒裂殖酵母中得到的。
2、 如權利要求1所述的粟酒裂殖酵母工程菌的構建方法，其特征在于是將防御素基因 插入到粟酒裂殖酵母表達載體pESP-2的多克隆位點處，將構建的重組粟酒裂殖酵母表達載體 采用電穿孔法導入粟酒裂殖酵母中，獲得重組粟酒裂殖酵母轉化子，培養重組粟酒裂殖酵母 使防御素基因得到表達。
3、 如權利要求2所述的粟酒裂殖酵母工程菌的構建方法，其特征在于重組粟酒裂殖酵母表達載體是含有融合蛋白(GST)、防御素基因、Pnmtl啟動子和終止子序列、多克隆位點 以及篩選標志的粟酒裂殖酵母表達載體pESP-2-Dl。
4、 根據權利要求3所述的粟酒裂殖酵母工程菌的構建方法，其特征在于防御素基因為 綠豆防御素基因(Dl)，其核苷酸序列如SEQ ID NO. l所述。
5、 根據權利要求3和4所述的粟酒裂殖酵母工程菌的構建方法，其特征在于所述防御 素基因位于粟酒裂殖酵母表達載體pESP-2的多克隆位點處的Nhel和BglII限制性內切酶酶 切位點之間。
6、 根據權利要求3、 4所述的粟酒裂殖酵母工程菌的構建方法，其特征在于所述篩選 標志有兩種， 一種為氨芐青霉素抗性基因，其允許在大腸桿菌克隆時進行載體的復制和抗生 素選擇； 一種為選擇標記基因LEU2-d，源自釀酒酵母可以作為向粟酒裂殖酵母細胞中轉化表 達結構的選擇標定物亮氨酸。
7、 根據權利要求2所述的粟酒裂殖酵母工程菌的構建方法，其特征在于是將構建的含 有防御素基因的重組粟酒裂殖酵母表達載體pESP-2—D1的質粒DNA，采用電穿孔法導入粟酒 裂殖酵母SP-Q01中，獲得重組粟酒裂殖酵母轉化子，培養重組酵母轉化子使防御素基因得 到表達，重組酵母表達的時間為2-6天。
全文摘要
本發明提供了一種具有防御素功能的粟酒裂殖酵母工程菌及其構建方法。本發明所提供的粟酒裂殖酵母工程菌，是將含有防御素基因的重組粟酒裂殖酵母表達載體導入粟酒裂殖酵母中獲得的。本發明將防御素基因插入到粟酒裂殖酵母表達載體的多克隆位點處，將構建的粟酒裂殖酵母表達載體導入粟酒裂殖酵母中獲得重組粟酒裂殖酵母，培養重組粟酒裂殖酵母使防御素基因得到表達。本發明彌補了傳統防御素制備方法以及原核表達系統、釀酒酵母和畢赤酵母表達系統的不足。發明應用于工業化防御素的生產時，具有生產規模大，防御素活性高，殺菌能力強，生長周期短，提取成本低的優點。
文檔編號C12N1/19GK101157899SQ20071005595
公開日2008年4月9日 申請日期2007年8月3日 優先權日2007年8月3日
發明者付永平, 王丕武, 王俊玲 申請人:吉林農業大學