專利名稱：以光能自養方式培養淡水綠藻生產花生四烯酸的方法
技術領域：
本發明涉及微藻培養和生產技術，尤其涉及以光能自養方式培養淡水綠藻生產長花生四 烯酸(二十碳四烯酸)的方法。
背景技術：
綠藻Afeoc/^on's屬或者/krj'etoc力7oris屬是屬于綠藻門的單細胞藻類，細胞圓形或卵 圓形，直徑為10-15um，在一定的培養條件下，藻體內可大量積累花生四烯酸，最高可達干重 的20%，而且該藻中的花生四烯酸大部分都分布在藻體中的油滴中，同奶中的花生四烯酸分 布方式一致，很容易被人體吸收、利用。花生四烯酸是一種重要的不飽和脂肪酸，是許多類 二十烯酸的前體，如前列腺素，凝血黃素及血三烯素等，具有重要的生理功能。二十二碳四 烯酸還是細胞和細胞膜的重要組成部分，在預防和治療人體多種疾病及嬰幼兒的發育中發揮 著重要的作用。同時，花生四烯酸還是人體大腦細胞膜以及其他神經細胞中磷脂的重要成分 之一，對嬰幼兒的大腦與視網膜發育，特別是在嬰幼兒認知能力和視力的發育中起著重要的 作用。但是，人類本身并不能合成這些脂肪酸，必須從食物中獲取，而一般食物中花生四烯 酸的含量很低。國際糧農組織(FA0)和世界衛生組織(WHO)宣稱，為保證嬰兒正常生長發 育，建議配方奶粉中加入每公斤嬰兒體重60mg的花生四烯酸。美國惠氏公司對其加入花生四 烯酸的配方奶粉聲稱，加入花生四烯酸可使嬰兒智商增加7分。
另外，花生四烯酸在食品、保健品、生物化工以及水產養殖等方面具有廣泛的應用前景。
有關花生四烯酸的生理功能及其實際應用的研究己有較多報道，這也是人們重視食用魚 油的理論依據。傳統的生四烯酸多是從魚油中提取。但是，由于深海魚油的組成非常復雜， 特別是含有很多對人體有害的飽和脂肪酸，此外，以魚油為原料獲取的花生四烯酸有很多缺 點，如帶有魚腥味、口感很差，同時還容易受到重金屬的污染，使其應用受到很大的限制。 同時，復雜的分離及提純程序也導致脂肪酸的成本很高。最后，由于漁業資源的日益枯竭以 魚油為原料的這些脂肪酸還面臨著原料短缺的問題，導致其產量和價格隨著魚的產量和價格 而波動。目前除了來自于魚油外，市場上還有利用發酵法培養被孢霉(ifom'er^aJ)生產的 花生四烯酸產品，采用發酵法生產花生四烯酸具有工藝復雜、投資大、需防止細菌的污染、 需要加入外源有機碳源以及成本過高等不可避免的問題。而微藻作為光能自養生物，既可以 在封閉條件下培養，也可以在開放式條件下培養，在培養過程中只需在培養基中添加一些無 機的營養鹽。同時，由于微藻作是屬于植物的范疇，因此不但可以提取花生四烯酸，而且還 可以以藻粉的形式直接食用。
在本發明申請之前，已經有很多生產花生四烯酸的報道和專利，如專利CN1175956、 CN1255545C、 CN1323904、 CN1362522、 CN15399825、 CN1537378等，但都局限于利用異養發 酵法培養生產花生四烯酸，由于一般微藻中的花生四烯酸含量很低，因此利用光能自養方法 大規模化培養綠藻、商業化生產花生四烯酸尚屬空白。
發明內容
為克服現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種以光能自養方式培養淡水綠藻生 產花生四烯酸的方法，本發明采用的技術方案是-
以光能自養培養淡水綠藻生產花生四烯酸的方法，包括下列步驟
① 、綠藻藻種進行馴化、篩選；
② 、馴化后綠藻類在培養基中采用光生物反應反應器進行藻種的預培養；
③ 、經預培養后，進行藻細胞的快速生長和多不飽和脂肪酸的累積，即綠藻的大規模培
養；
、上述培養液中的生物量及藻體中的花生四烯酸達到一定要求時即可進行采收；
⑤ 、收集藻細胞從而得到所需要的花生四烯酸；
⑥ 、循環利用采收后的養殖廢水。
所述的培養基，包括碳源、氮源、磷源、鉄源、無機鹽，碳源為碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳 酸、二氧化碳或其混合物；氮源選自有機氮化合物、無機氮化合物或其混合物；磷源為磷酸 鹽、磷酸氫鹽或其混合物；鉄源為有機鉄化合物、無機鉄化合物或其混合物；無機鹽為一種 或多種選自下列物質鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、錳鹽、鉆鹽、鋅鹽、銅鹽、鉬酸鹽、硼化 物及其混合物。
所述的碳源為碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸、二氧化碳或其混合物，所述的無機氮化合物包 括硝酸鹽、銨鹽其混合物，有機氮化合物為尿素。
所述的碳源濃度為0-50mM/L,所用的氮源濃度是0-50mM/L，所述的磷源濃度為 0.01-l.OmM，所述的鉄源濃度為0.01-50uM，所述的無機鹽濃度，以鈉鹽為標準，為 0. 01-100卯m。
培養基的pH值為5. 0-10.0。
所述的培養溫度為5-45°C，優選為10-30°C，更優選為15-25°C。 所述的培養是在通氣或者不通氣并且攪拌條件下進行的。 所述的培養是在人工光源或自然光源下培養的。 細化為包括下列步驟
① 、對綠藻在低溫條件下進行馴化篩選；
② 、對經馴化后的綠藻藻類在權利要求l-5之一的培養基中進行預培養；
③ 、經預培養后，再接種到上述的權利要求1-5之一的培養基中進行培養，其中在該步 驟培養基中氮源的濃度為預培養中氮源濃度的1/100-1/2。 其中預培養的溫度為10-45。C優選為10-30°C，更優選為15-25°C。，。 上述的經預培養后的培養溫度為5-45°C，優選為10-30'C,更優選為15-25°C。 所指的培養設施為封閉式的或不封閉的培養設施。 細胞收集是指采用氣泡分離、沉降、過濾或離心等方法。 收集藻細胞后的培養基處理指采用沉降、過濾、泡沫分離或三種方法的結合。 本發明可以帶來如下技術效果
通過調整培養條件，促使綠藻大量積累花生四烯酸，等花生四烯酸含量達到10%以上時 進行采收。
采用過濾法或離心機分離綠藻，分離過程不添加任何化學物質，分離后的清夜可返回養 殖池使用，解決了可食用綠藻采收問題。
采用泡沫分離法或者微孔過濾法除去藻液采收后養殖廢水中的有機物和固體顆粒，水可 以回收再利用，可以節約水資源。
本發明延長了綠藻養殖生產期，大大提高了養殖綠藻的產量和質量；生產出食用級藻粉， 研制出高附加值的二次產品。
本發明的產品本身是天然綠色保健食品，可以加工成膠囊或以食品添加劑的形式添加到 諸如奶制品和其它食品中。
本發明中的藻粉可以采用有機溶劑或植物油提取藻粉中的花生四烯酸，作為食品添加劑 使用。
具體實施例方式
本發明提供了一種淡水綠藻用的培養基，包括碳源、氮源、磷源、鉄源、無機鹽，其中 所述的碳源包括碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸、二氧化碳或其混合物；所述的氮源選自有機氮化 合物、無機氮化合物或其混合物；所述的無機氮化合物包括硝酸鹽、銨鹽或其混合物，有機 氮化合物為尿素。所述的鉄源為有機鉄化合物、無機鉄化合物或其混合物；所述的無機鹽這 為一種或多種選自下列的物質鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、錳鹽、鉆鹽、鉬酸鹽、鋅鹽、硼 化物、銅鹽及其混合物。
在本發明的培養基中，其中所述的碳源濃度為0 — 50mM/L，所用的氮源濃度是0-50mM; 所述的磷源濃度為0-0. 5mM;所述的鉄源濃度為0. l-50uM;所述的無機鹽濃度，以鈉鹽為標 準，為0. 01-100ppm。其pH值為5. 0-11.0。
本發明還提供了一種在上述的培養基中培養微藻的方法。這種方法是在通氣和/或機械攪 拌條件進行。所述的微藻是Afeoc/^oris或戶ari"oc力7on's屬藻類。藻種保存在固體斜面或 液體培養基中。
本發明所用的淡水微藻是能生產花生四烯酸的微藻，包括可以從UTEX(美國德克薩斯大 學保種中心)以及CCAP(英國藻類和原生動物保藏中心)等獲得的種類，如UTEX1707， CCAP254/6。
本發明的目的是提供一種培養綠藻生產花生四烯酸的方法，它是采用封閉式或者開放式 培養系統，培養綠藻生產花生四烯酸，該方法采用光能自養方法培養微藻，與其它方法相比， 在培養基中只需添加一些無機鹽，不許添加有機物作為營養，以光能作為能源，具有投資少、 成本低、培養簡單等優點，而且可以在鹽堿灘涂和沙漠等地區生產。
本發明采用大面積封閉式養殖綠藻的方法及設施，封閉式培養是指在封閉的透明容器。 開放式培養指在露天或溫室內的培養池中培養。池體有鋼筋混凝土或土壤建成的池子，覆蓋 或不覆蓋塑料或橡膠質的薄膜，中間有隔離帶，池中有攪拌裝置，使培養液循環流動；池上 設有由鋼材或其它材料等作骨架，以玻璃鋼、玻璃、有機玻璃或者塑料薄膜作壁、頂的罩棚， 棚的四周由通氣窗口。這種養殖池長年不用維修，可減少培養液污染，提高藻粉質量和產量， 延長養殖生產期。
下面結合實施例進一步說明本發明。 實施例1:
將消毒的淡水放入一級育種的管道式光生物反應器中，調整PH為6 8，營養鹽濃度為 1. 5g/升NaN03、 36mg/LCaC12、 20mg/L Na2C03、 75mg/L MgS04、 30mg/L K2HP04、 lmg/L Fe-EDTA 以及微量元素溶液，按照0.1g生物量/L進行接種,并沖入含1-5%二氧化碳的過濾空氣，使藻 液在封閉的管道中循環流動。養殖5 10天；進入二級育種階段，在玻璃溫室內的淺水道養 殖池中放置上述養殖培養液，養殖采用自然光源，從上述一級光生物反應器中接種培養液， 接種密度為O. lg生物量/升，養殖5-IO天；進入三級育種階段，按照O. lg生物量/L，的密 度將上述二級擴種液轉入塑料大棚內淺水道養殖池中的上述養殖培養液中，養殖7 10天； 在自然條件下，將消毒的淡水放入帶有攪拌裝置的室外養殖池，調整水體，要求其中為p朋 8,向上述水體中加入三級擴種液，接種密度為0. lg生物量/L，添加上述元素，NaNO減為原 濃度的1/3-1/10，白天每隔2 3小時攪拌0. 5小時，養殖7 10天；待上述培養液生物量 達l-2g生物量/L，花生四烯酸含量達到10%時即可采用離心或微濾進行采收；分離后的藻糊 在噴霧干燥器中噴霧干燥，進口溫度為165'C，出口溫度為8(TC，即可得綠藻藻粉。
實施例2:
按照實施例l所述的步驟，其中使用養殖培養液的條件為溫度在25t:、 PH值為6-8，
0. 25g/L NaN03、 2. 5mg/L CaC12、 25mg/L NaCl、 75mg/L MgS04、 25mg/L K2HP04、 12. 5mg/L FeS04-EDTA以及微量元素溶液。
實施例3:
按照實施例l所述的步驟，其中使用養殖培養液的條件為溫度在15'C、 PH值為6-8、 營養鹽濃度為1.0/升Na亂、2. 5mg/L CaC12、 25mg/LNaCl、 75mg/LMgS04、 25mg/L K2HP04、 12. 5mg/L FeS04-EDTA以及微量元素溶液。
實施實例4 : -將消毒的淡水或放入柱式光生物反應器中進行預培養，調整PH為6 8，營養鹽濃度為
1. 5g/升NaN0:,、 36mg/LCaC12、 20mg/L Na2C03、 75mg/LMgS04、 30mg/L K2HP04、 lmg/L Fe-EDTA 以及微量元素溶液，按照0. lg生物量/L進行接種，并沖入含0 -5%二氧化碳的過濾空氣進行 攪拌，連續光照，光照強度為150W,培養溫度為25'C。養殖5 10天；等生物量達5g/L時收 集藻細胞，轉移至新配置的上述不含NaN03培養液中繼續培養，養殖5 10天，等花生四烯 酸含量達到10%時即可采用離心或微濾進行采收；分離后的藻糊在噴霧干燥器中噴霧干燥， 進口溫度為165。C，出口溫度為80。C，即可得綠藻藻粉。
實施例5 :
按照實施例1所述的培養基，其中的培養設施為板式光生物反應器，其中使用養殖培養 液的條件為溫度在20-30°C、 PH值為6-8，光照為120W，在反應器底部沖入含二氧化碳1-5% 的過濾空氣，培養5-10天，等生物量達5g/L時停止充氣，待藻細胞自然沉降至反應器底部 后，棄掉上層清液液，并加入新配置的不含硝酸鈉的培養液中繼續充氣培養，養殖5 10天， 等花生四烯酸含量達到10%時即可采用離心或微濾進行采收；分離后的藻糊在噴霧干燥器中 噴霧干燥，進口溫度為165'C，出口溫度為8(TC，即可得新綠藻藻粉。 實施例6:按照實施例1所述的培養培養，光照改為250W，共養殖培養14天后；等生物 量達5g/L并花生四烯酸含量達到10%即可采用離心或微濾進行采收；分離后的藻糊在噴霧干 燥器中噴霧干燥，進口溫度為165'C，出口溫度為8(TC，即可得綠藻藻粉。
本發明的突出的實質性的特點和積極效果可從下述實施例中得以體現,但是它們并不是 對本發明作任何限制。
因此按以上所述，按照本發明的方法，以自養方式培養綠藻工業化生產花生四烯酸，可 以低成本、穩定地提供沒有腥味的花生四烯酸，替代現有的從魚油中高成本的提取方法或者 異養發酵的方法。
此外，本發明還在碳源包括碳酸鈉、碳酸氫鈉，碳酸、二氧化碳；有機氮化合物、無機 氮化合物；無機氮化合物包括硝酸鹽、銨鹽，有機氮化合物包括尿素。所述的鉄源為有機鉄 化合物、無機鉄化合物；所述的無機鹽這為一種或多種選自下列的物質鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、 鈣鹽、猛鹽、鉆鹽、鉬酸鹽、鋅鹽、硼化物、銅鹽的條件下進行了實驗，仍能取得一定效果。 在本發明的培養基中，其中所述的碳源濃度為O、 50mM/L，所用的氮源濃度是O、 50mM; 所述的磷源濃度為0.01、 l.OmM;所述的鉄源濃度為0.01、 50uM;所述的無機鹽濃度，以鈉 鹽為標準，為O.Ol、 100卯m。其pH值為5、 IO分別進行試驗，仍能取得一定效果。 本發明預培養的溫度為5、 45°C;進行試驗，仍能取得一定效果。 氮源的濃度為預培養中氮源濃度的1/100、 1/5進行試驗，仍能取得一定效果。 以上用實施例對本發明進行了描述。本領域的普通技術人員在上述的基礎之上可以做出 多種變動，這些變動仍屬于本說明書所涵蓋范圍之內。
權利要求
1、一種以光能自養方式培養淡水綠藻生產花生四烯酸的方法，其特征是，包括下列步驟①、綠藻藻種進行馴化、篩選；②、馴化后綠藻類在培養基中采用光生物反應反應器進行藻種的預培養；③、經預培養后，進行藻細胞的快速生長和多不飽和脂肪酸的累積，即綠藻的大規模培養；④、上述培養液中的生物量及藻體中的花生四烯酸達到一定要求時即可進行采收；⑤、收集藻細胞從而得到所需要的花生四烯酸；⑥、循環利用采收后的養殖廢水。
全文摘要
本發明涉及微藻培養和生產技術，尤其涉及以光能自養方式培養淡水綠藻生產長花生四烯酸(二十碳四烯酸)的方法。為提供一種以光能自養方式培養淡水綠藻生產花生四烯酸的方法，本發明采用的技術方案是①綠藻藻種進行馴化、篩選；②馴化后綠藻類在培養基中采用光生物反應反應器進行藻種的預培養；③經預培養后，進行藻細胞的快速生長和多不飽和脂肪酸的累積，即綠藻的大規模培養；④上述培養液中的生物量及藻體中的花生四烯酸達到一定要求時即可進行采收；⑤收集藻細胞從而得到所需要的花生四烯酸；⑥循環利用采收后的養殖廢水。本發明主要用于生產長花生四烯酸。
文檔編號C12P7/40GK101096640SQ20071005747
公開日2008年1月2日 申請日期2007年5月29日 優先權日2007年5月29日
發明者陳幕釗, 高清潭 申請人:天津祿升海洋生物科技有限公司