與水稻生長發育和抗病性相關的編碼鋅指蛋白的水稻新基因的制作方法

專利名稱：：與水稻生長發育和抗病性相關的編碼鋅指蛋白的水稻新基因的制作方法
技術領域：
：本發明屬于植物基因工程領域。具體地，本發明涉及與水稻生長發育和抗病性相關的編碼鋅指蛋白的水稻新基因，包括該基因的重組質粒、宿主及其應用。
背景技術：
：鋅指蛋白參與植物抗病反應已有報道，『i^r蛋白是植物特有的一類鋅指蛋白，其中的一個重要功能是參與植物抗病反應，芹菜WRKY蛋白含有0乂4.5-0乂22.23-11《-11保守結構，通過結合到抗病相關基因(/^-/0基因)啟動子區的W盒上來激活這些基因的表達，從而提高植物對病原物的抗性(EulgemT.等1999).^^『//078是擬南芥中受病原菌和水楊酸誘導的轉錄因子，它含有一個與芹菜『欣r鋅指基元相同的結構域，功能與『欣r相似，在花椰菜花葉病毒35S啟動子下高水平表達時，影響擬南芥的生長發育，使其生長相對較緩慢；在適當的水平下表達，擬南芥對丁香假單胞菌(Ae^foAwo"w^W"g^)的抗性增強，抗性相關基因的表達水平提高，抗性增強不是由水楊酸合成增加引起的，而是與抗病調控蛋白NPR1/NIM1有關，A『//Q7S啟動子區的順式作用元件對A『/尺F/S的表達起負調控作用，可以控制A『Wi07S的表達而不至于過量而導致對自身生長不利(ChenC.H.等2002)。『//O70的表達受水楊酸的激活，甲基茉莉酸的抑制。在水楊酸參與的抗病信號傳導途徑中處于NPR1基因的下游。過量表達『欣F70基因，植物表現出對致病性病原菌軟腐菌("ecr^ra//7五.C.carafovora)禾口假單胞菌(尸sewcfowowoss少n."gaepv,fomaoDC3000)的抗性增強和受水楊酸誘導的病原相關蛋白(尸W)的組成性表達。『//O70抑制甲基茉莉酸誘導的基因表達，負調控甲基茉莉酸介導的抗病信號傳導(LiJ.等2004)。擬南芥A『/AT(5基因敲除以后，植物葉片的衰老明顯減弱，說明該基因參與細胞死亡過程。且A『欣l^基因正向調控尸/-7基因的表達，說明A)^7ia^參與植物抗病反應(RobatzekS.等2002)。擬南芥的/L4/基因調控抗病基因對各種細菌和卵菌產生抗性，突變分析顯示，/L4i基因在限制病原菌生長的程度，過敏性植物細胞死亡和氧化物的激發上起決定作用。抗性基因RPP4，RPP21，RPM1，RPS2，RPS4，RPS5發揮作用都需要/^/參與。(MuskettP.尺.等2002)。擬南芥LSD1基因編碼一個含有3個CVC2型鋅指的蛋白，它限制植物防御反應的起始和隨后過敏性反應的產生，當此基因喪失功能時擬南芥對細胞死亡起始因子誘導細胞死亡過敏，而且不能抑制死亡的蔓延，同時表現為與病原菌或化學物質誘導相同的過敏性反應和系統獲得性抗性，抗病相關基因Pi-7的表達量明顯提高(DietrichR.A.等1997)。植物抗病信號傳導的兩個重要成分EDS1和PAD4在調控細胞程序性死亡的時候均受LSD1基因的控制(RusterucciC.等2001)。Z^^突變體在誘發細胞死亡的時候需要水楊酸和NIM1/NPR1基因的參與，轉NahG(降解水楊酸)基因的丄^/7突變體和fe^/m'w/雙突變體用水楊酸處理后葉片不出現壞死斑或者壞死斑出現的時間晚且不會蔓延至整個葉片，接禾中非致病性假單胞菌(尸化wcfomo"as>>rz>2gaepv.tomatoDC3000)也不出現過敏性反應。接種致病性疫霉菌(尸eramw/7ora/7^^加^)依然表現抗性，說明/^//突變體所表現的是對病原菌的基本抗性(AvivD.H.等2002)。根據LSD1序列進行擬南芥基因組的搜索，得到4個同源性較高的基因，ZO丄/是其中之一，通過構建丄W〃/o/7雙突變體并噴灑苯并噻二唑(BTH)誘導細胞死亡，結果發現Z^/7單突變體很快就產生壞死斑并迅速蔓延到整個葉片，而"W/7o〃雙突變體沒表現出明顯的細胞死亡，說明丄OL/在L^7突變體誘發細胞死亡的時候是必需的。擬南芥體內過量表達丄0丄7易誘發細胞死亡。由此可見丄OZJ是細胞程序性死亡的正調控因子，/W/突變體所導致的細胞死亡需要丄OZJ基因的參與(EppleP等2003)。在植物的生長發育過程中鋅指蛋白也發揮著重要的作用。擬南芥的矮化突變體A/是由于轉座子插入S/7/基因的上游非翻譯區中轉座子所攜帶的。八]\4￥358啟動子發揮作用導致^///基因過量表達所致。5///基因編碼一個新型鋅指蛋白，過量表達該基因使擬南芥對外源赤霉素不敏感，植物體內赤霉素大量積累，說明S/7河能作為赤霉素反應的一個負調節因子發揮作用(Fridborg1.等1999)。擬南芥的g^突變體是在04/基因的N端缺失17個氨基酸導致該基因不能被GA激活，表現對赤霉素不敏感，矮化表型。進一步的研究分析表明C^4/基因所表達的蛋白是作為一個轉錄調節因子起作用的，定位于細胞核內。用該突變基因和其自身的啟動子轉化菊花，結果菊花表現矮小表型(PettyL.M.等2003)。擬南芥的S五//^7E基因是一個與子葉的起始與延伸，胚胎后器官發育相關的基因，編碼一個C2H2型鋅指蛋白。該基因的內源表達水平下降以后可導致擬南芥出現矮化(PriggeM丄等200D。擬南芥的SW^/M47V基因及其同源基因是一類與生長發育有關的基因，該類基因表達的蛋白也是鋅指蛋白。SC/尸五WM4iV基因突變后導致雄蕊過多發育，心皮發育不良(BowmanJ丄.等1992)。擬南芥體內過量表(—個與SW^iM47V基因同源基因)導致不能得到轉化苗，該基因在煙草中表達對煙草的生長發育的影響也很大，使得煙草生長矮小，葉片發育不正常，開花提前，且多不育(DinkinsR,D.等2003)。水稻的OAOZ2基因是作為一個與擬南芥LSDl基因同源的基因來開展的研究，鑒于LSD1基因在細胞程序性死亡和抗病性反應中所發揮的重要作用，以及在植物細胞程序性死亡和抗病信號傳導研究中的重要價值，從水稻中尋找與LSD1同源基因并研究其功能顯得有重要意義。通過序列比對發現水稻基因組中有6個基因含有與LSD1基因鋅指結構同源鋅指基元，說明含有此種結構的鋅指蛋白可以構成一類，且所表現的功能有可能比較豐富。OAO丄2基因是其中之一，表達的蛋白與LSDl基因表達的蛋白有24n/。的同源性，含有2個CVC2型的鋅指基元，其鋅指結構與LSD1的鋅指結構有74%的同源性，因此我們從此入手，開展了對0"(9丄2基因功能的研究。
發明內容本發明人通過對水稻EST測序和序列比對，發現一個EST所編碼的蛋白含有鋅指結構，與擬南芥的LSD1鋅指結構高度同源，并用PCR方法從水稻cDNA文庫中克隆到含有完整讀碼框的片段，命名為OsL0L2(SEQIDNO:l)，完整讀碼框含有492個核苷酸，編碼一個163個氨基酸的蛋白，該蛋白含有2個CVC2型鋅指結構。本發明旨在探索LSZ)7同源基因在水稻中的功能，闡明0"0丄2是否參與細胞程序化死亡，是否參與植物對病原菌的抗性反應，是否在水稻中還有新的功能。利用轉錄后基因沉默的原理，構建了用于植物遺傳轉化的sense禾口antisense載體pOsLOL2S和pOsLOL2AS，轉化水稻日本晴和煙草SR1，通過分析轉化系的表型和接種結果來揭示C^ZX^2的功能。該方法在研究基因的功能方面有獨特的優點首先是先得到基因，可以明確而有的放矢地針對此基因開展研究，其次是利用轉錄后基因沉默的原理，可以將內源基因沉默而達到與突變體相同的效果，而無需篩選突變體這樣繁瑣費時的工作，無需做圖位克隆。本發明揭示了水稻OAOZ^基因參與植物株高的調控，并作為正調控因子參與對水稻白葉枯病菌、稻瘟菌和煙草青枯雷爾菌的抗性反應。圖l:含有完整讀碼框的OAO丄2的cDNA片段(SEQIDNO:l)。圖2:A:OsLOL2與LSDl，LOLl的同源性比較。B:OsLOL2蛋白的2個鋅指結構與LSD1蛋白鋅指結構同源性比較(1，2為OAOZJ蛋白的2個鋅指結構域，3，4，5為LSD1蛋白的3個鋅指結構域)。圖3:OA(9丄2基因的Southernblot分析，1，2禾卩3為日本晴DNA;4，5禾卩6為MH63DNA;7，8，9為IR24DNA;其中1，4，7進行￡coRI酶切；2，5，8進行5awHI酶切；3，6，9進行州'"dIII酶切，M為1KbMarker(NewEnglandBiolabs公司)。圖4:pOsLOL2S(A)，pOsLOL2AS(B)，pGFP-2(C)，pOsLOL2Gl(D)，pOsLOL2G2(E)，pROK2(F)，pRGFP2(G)載體圖。圖5:Os丄OZ^基因的sense和antisense的PCR擴增片段。M為DL2000Marker(Takara公司)，l為sense片段，2為antisense片段。擴增片段長度均為579bp。圖6:水稻遺傳轉化過程中各時期愈傷狀態和轉化植株。A:l為水稻種子誘導的愈傷組織，2為共培養后篩選到的抗性愈傷，3為抗性愈傷預分化時的狀態，4為抗性愈傷分化時的狀態。B:分化獲得的抗性轉化植株。圖7:水稻轉化系的潮霉素抗性基因(HPTII)PCR檢測。A:sense轉化系的PCR檢測，l為日本晴，2，3，4，5為4個獨立的sense轉化系。B:antisense轉化系的PCR檢測，l為日本晴，2，3，4，5為4個獨立的antisense轉化系。M為DL2000Marker(Takara公司)，擴增片段為858bp。圖8:水稻C^I(9丄2基因antisense轉化系表型。l為日本晴，2，3，4，5為4個獨立的antisense轉化系。圖9:水稻sense和antisense轉化系半定量RT-PCR。A:sense轉化系，l為日本晴，2，3，4為3個獨立的sense轉化系。B:antisense轉化系，l為日本晴，2，3，4為3個獨立的antisense轉化系。M為DL2000Marker(Takara公司)，，擴增片段為579bp。圖10:煙草Os丄OZJ基因sense轉化系潮霉素抗性基因(HPTII)和CWX^2基因的PCR檢測。A:潮霉素抗性基因PCR檢測，l-8泳道為8個獨立轉化系。B:0A0丄2基因的PCR檢測，l-8泳道為8個獨立轉化系(與A相對應)。M為DL2000Marker(Takara公司)，擴增片段為858bp。圖ll:煙草Os丄0丄2基因sense轉化系To代(A)和T,代(B)表型。1為對照pCAMBIA1302轉化系，2為O^OL2基因sense轉化系。圖12:OAO丄2基因sense轉化系接種水稻白葉枯菌PX099(l為日本晴，2為pCAMBIA1301轉化系，3為接種PSA培養基對照，4，5，6，7為sense轉化系；箭頭所示圖片顯示白色為病斑)。圖13:(M^丄2基因antisense轉化系接種水稻白葉枯菌PX086(1為曰本晴，2，3，4，5為antisense轉化系；箭頭所示圖片顯示白色為病斑)。圖14:Os丄C^2基因sense水稻轉化系接種稻瘟菌Y34(l為日本晴，2，3，4為sense轉化系)。圖15:(9^X^2基因sense煙草轉化系接種青枯雷爾菌(1為SR1，2為sense轉化系)o圖16:OsLOL2-GFP融合蛋白在水稻根尖細胞內的定位(左為光鏡下照片，右為紫外光下熒光照片，箭頭所示圖片顯示為綠色熒光)。圖17:A:OsLOL2-GFP融合蛋白在煙草BY-2懸浮細胞中的定位，B:GFP蛋白在煙草BY-2懸浮細胞中的表達(左為光鏡下照片，右為紫外光下熒光照片，圖片顯示為綠色熒光)。包含564bpC^LOL2基因(SEQIDNO:l)的大腸埃希氏菌(&c/2en'c/n'a.co")DH10B于2005年9月27日送中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，北京市海淀區中關村北一條13號，中國科學院微生物研究所)保藏，保藏號為CGMCCNo.1463，命名為pOsLOL2。具體實施方式下面通過實施例詳細描述本發明。本領域的普通技術人員可以理解，下述實施例僅是用于舉例說明的目的，并非限制本發明。本發明的保護范圍由后附的權利要求所界定。實施例l:水稻cDNA文庫的構建按照HeC等(1999)的方法構建水稻cDNA文庫的構建。Trizol試劑(Invitrogen公司)提取水稻葉片總RNA，mRNA的分離用BoehringerMannheim公司的試劑盒，cDNA文庫的構建用SuperscriptPlasmid系統(Invitrogen公司)。其操作流程如下1.總RNA的提取。取水稻的葉片加液氮在研缽中研磨至粉狀，轉到離心管中加Trizol試劑提取，離心后取上清，異丙醇沉淀獲得水稻的總RNA。2.mRNA的分離。取200ng的水稻總RNA加0.5ml的裂解緩沖液，混合，65°C2分鐘，力QL5pl的生物素標記的oligo(dT)2。探針，將此混合物轉入150pl的streptavidin親合的磁粒懸浮液中混勻，37"C溫浴5分鐘，然后將磁粒分離用沖洗緩沖液洗3次，加50pl重蒸水懸浮磁粒，65'C溫浴2分鐘，轉移含mRNA的上清至新的離心管中。3.cDNA文庫的構建。(1)第一鏈的合成，取2嗎的水稻mRNA，加DEPC處理無菌蒸餾水至10^d混勻，7(TC溫浴10分鐘，置冰上冷卻，力n4pl緩沖液，2|J0.1MDTT,1pi10mMdNTP,，混勻于37。C溫浴2分鐘，力口2plSuperscript1IRT，混勻于37。C溫浴1小時。置冰上冷卻終止反應。(2)第二鏈的合成，在上述反應體系中加緩沖液30pl，3pll0mMdNTP，1(al大腸桿菌DNA連接酶，4pl大腸桿菌DNA聚合酶I，lplRNA酶H，力口DEPC處理無菌蒸餾水至終體積150^，混勻后放16。C溫浴2小時。力卩2!ilT4DNA聚合酶繼續溫浴5分鐘，轉移到冰上冷卻，加10^0.5MEDTA，用酚-氯仿純化DNA。(3)加Sa/I配接器。在純化的DNA中加25plDEPC水，10|ilT4DNA連接酶緩沖液，10piSa/1配接器(adaptor),5nlT4DNA連接酶。16'C連接反應20小時，用酚-氯仿純化DNA。(4)A^I消化。在純化的DNA中41jilDEPC水，5(alReact3緩沖液，4|ilI。37。C溫浴2小時后用酚-氯仿純化DNA。(5)柱過濾。將純化的DNA溶解與100(ilTEN緩沖液中，去除雜質。(6)與載體連接。10ngcDNA，4|ilT4DNA連接酶緩沖液，1ial經Sa/1和7VWI消化的pEXP-AD502載體，加DEPC水至19pl，加lplT4DNA連接酶，4"C反應過夜。(7)連接產物導入大腸桿菌感受態細胞。70%乙醇純化連接產物后溶與3^11無菌蒸餾水中，取lpl電擊轉化大腸桿菌感受態細胞DH10B。并涂在含100mg/L氨芐青霉素(Sigma公司)的LB固體培養基上，37'C培養過夜，挑單克隆保存，用于提取文庫質粒DNA。實施例2:OAO丄2基因的獲得及基因結構分析1.Os丄OL2基因的獲得根據Os丄OZJ已知的EST序列(GenBankAccessionnumber:192760)設計引物正向5，畫AAGTCTGTGGCTGTGGCCTC-3，(SEQIDNO:2)，反向5，-TGAAGCTTTCTTTGGAATCCG-3，(SEQIDNO:3)，PCR擴增(反應條件94。C4min，94。Clmin，60°Clmin,72。C40sec，35個循環，72。C5min。反應體系lxPCR反應緩沖液，lUTaq酶(Takara公司)，20ng從上述單克隆提取的cDNA文庫質粒DNA，0.2mMdNTP，0.2pM引物，加重蒸水至20水稻cDNA文庫，得到含有完整讀碼框(492bp)的一個564bp的片段(SEQIDNO:l)(附圖1)，該片段與pGEM-TEasy載體(Promega公司)連接，電擊轉化入大腸桿菌DH10B(Invitrogen公司)中并于2005年9月27日送中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCCNo.1463，命名為pOsLOL2。對PCR產物測序并進行序列比對，結果顯示與所對應的EST序列相同。OAOZJ編碼一個含163個氨基酸殘基的蛋白，對蛋白的結構分析表明其含有2個CVC2型鋅指，與擬南芥的LSZ)/基因表達的蛋白同源性達到24o/。(附圖2A)，鋅指結構區的同源性達到74%(附圖2B)。2.(9AC^2基因結構分析2.1Os丄(9ZJ基因的結構將上述PCR擴增獲得的564bp的片段與美國國家生物信息中心(NCBI)的水稻基因組全序列進行Blastn比對，結果顯示，該基因位于一號染色體上，含有4個外顯子和3個內含子，編碼區序列長492bp，編碼含163個氨基酸殘基的蛋白。2.2CWX^2基因的拷貝數利用該基因的序列與水稻全基因組進行序列比對，發現沒有與之高度同源或一致的序列，表明該基因在水稻中是單拷貝。同時，如下進行Southernblot分析。分別選取日本晴、MH63和IR24(均由國際水稻研究所提供，IRRI)三個水稻品種的葉片，按Dellaporta等(1984)所述方法提取DNA。DNA的定量用紫外分光光度計測定法或瓊脂糖凝膠電泳后EB染色法比較確定。選取在該基因上沒有酶切位點的三種酶(&oRI』awHI和///"(1111)酶切2-3嗎水稻基因組DNA，30pl反應體系，37'C酶切5小時以上，酶切完全后在0.8%的瓊脂糖凝膠上30V電壓電泳4-5小時。電泳結束后轉膜、雜交、洗膜、顯影均按照《分子克隆實驗指南》(Sambrook等，1989)所述方法進行。探針(上述PCR擴增獲得的564bp的片段)用a-"P-dCTP(Amersham公司)和Prime-a-GeneLabelingSystem探針標記試齊廿盒(Promega公司)進行標記。Southernblot結果表明，C^OZJ在水稻基因組內是單拷貝的(附圖3)。實施例3:O"OZJ基因轉化載體構建1.0AO丄2基因正義(sense)和反義(antisense)轉化載體的構建根據Os丄Oi:2cDNA序列設計引物sense正向5-CCCATGGAAGTCTGTGGCTGTGGCCTC-3、(SEQIDNO:4)反向5、-GGGTGACCTGAAGCTTTCTTTGGAATCCG-3、(SEQIDNO:5)antisense正向5-GGGTGACCAAGTCTGTGGCTGTGGCCTC-3、(SEQIDNO:6)反向5-CCCATGGTGAAGCTTTCTTTGGAATCCG-3、(SEQIDNO:7)其中，構建sense轉化載體的一對引物，正向引物附帶一個iVcoI酶切位點，反向引物附帶一個5WEII酶切位點。構建antisense轉化載體的一對引物，正向引物附帶一個^/ElI酶切位點，反向引物附帶一個TVcoI酶切位點。利用兩對引物PCR擴增水稻cDNA文庫，PCR的反應體系含10ng左右的cDNA文庫的質粒，lx擴增緩沖液，1UTaq酶，0.2mmol/LdNTPs，0.2pmol/L引物組成20pl反應體系。反應條件是94。C4min，94°C50sec，60°C50sec，72°C50sec，循環35次。反應結束后在1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，紫外燈下觀察有兩條579bp的帶。將兩片段從膠中切下用膠回收試劑盒(Omega公司)回收，并連接至ljpGEM-TEasy(Promega公司)載體上，電擊轉化大腸桿菌DH10B感受態細胞(Invitrogen公司)，涂在含100mg/L氨芐青霉素(Sigma公司)的LB固體培養基上，37。C培養過夜，挑單菌落于5ml液體LB培養基中37i:下250轉/分鐘搖動培養12小時，取0.5ml菌液送上海生工生物公司測序確定片段正確，剩余菌液提質粒，用A^oI和&出n(Takara公司)雙酶切并回收兩個片段。同時，A^oI和&氾II雙酶切pCAMBIA1301質粒(CAMBIA公司)，回收載體片段。然后將回收的兩片段分別連接到pCAMBIA1301載體片段上，構建成pOsLOL2S和pOsLOL2AS兩個轉化載體(附圖4A，B)。將兩個載體電擊轉化入大腸桿菌感受態細胞，并涂在含50mg/L卡那霉素(Sigma公司)的LB固體培養基上，37。C培養過夜，挑單菌落于5ml液體LB培養基中37'C250轉/分鐘搖動培養12小時，取lml菌液提質粒，質粒DNA用臉oI和5WEII酶切驗證，將轉化成功的含有構建載體的菌液于-8(TC保存。將兩個載體電擊轉化根癌農桿菌EHA105(Hood等，1993)的感受態細胞，并涂在含50mg/L卡那霉素(Sigma公司)和10mg/L利福平(Sigma公司)的LB固體培養基上，28°C培養36-48小時，挑單菌落于5ml液體LB培養基中200轉/分28'C搖動培養12小時，取lml菌液提質粒，質粒DNA用A^I和^ffin酶切驗證。將轉化成功的含有構建載體的菌液于-8(TC保存，用于遺傳轉化。2.C^LC^基因與GFP基因融合表達載體構建根據Os丄OZJcDNA序列(SEQIDNO:1)設計引物正向5、-CCTCGAGAAGTCTGTGGCTGTGGCCTC-3、(SEQIDNO:8)反向5、-GGGTACCTCCACCGGCTTCAGCTAGCCCTGATG-3、(SEQIDNO:9)其中，正向引物附帶屈ol酶切位點，反向引物附帶/^wI酶切位點，另加6個核苷酸(編碼2個甘氨酸)做緩沖。PCR擴增水稻cDNA文庫(反應條件94。C4min，94°Clmin，60°Clmin，72°Clmin，35個循環，72°C5min。反應體系lxPCR反應緩沖液，lUTaq酶(Takara公司)，20ngcDNA文庫質粒DNA，0.2mMdNTPs,0.2HM引物，加重蒸水至20^1)，將擴增片段(536bp)連接到pGEM-TEasy載體上，測序驗證。A7kI和尺/"I(Takara公司)雙酶切并回收所需片段，然后將該片段與經A7201和雙酶切的pGFP2(附圖4C，KostB等1998)連接，構建成瞬間表達載體pOsLOL2Gl(附圖4D)。將此載體電擊轉化進入大腸桿菌DH10B中保存。尸WI禾Q五coRI(Takara公司)雙酶切pOsLOL2Gl，將表達部分切下，與尸M和五coRI雙酶切的pCAMBIA1300(CAMBIA公司)連接，構建成永久表達載體pOsLOL2G2(附圖4E)。將此載體電擊轉化入大腸桿菌DH10B(Irwitrogen公司)感受態細胞，并涂在含50mg/L卡那霉素(Sigma公司)的LB固體培養基上，37。C培養過夜，挑單菌落于5ml液體LB培養基中250轉/分37'C搖動培養12小時，取lml菌液提質粒，質粒DNA用/^I和五coRI酶切驗證，將轉化成功的含有構建載體的菌液于-8(TC保存。將驗證正確的質粒電擊轉化根癌農桿菌EHA105(Hood等，1993)的感受態細胞，并涂在含50mg/L卡那霉素(Sigma公司)禾n10mg/L利福平(Sigma公司)的LB固體培養基上，28。C培養36-48小時，挑單菌落于5ml液體LB培養基中200轉/分28。C搖動培養12小時，取lml菌液提質粒，質粒DNA用i^I和EcoRI酶切驗證。將轉化成功的含有構建載體的菌液于-8(TC保存，用于遺傳轉化。將pGFP2載體上的GFP基因用Jftal和(Takara公司)雙酶切，回收，與經WaI和Sacl雙酶切的pROK2(附圖4F，Baulcombe等，1986)載體連接構建成永久表達的載體pRGFP2(附圖4G)作為對照。實施例4:植物遺傳轉化1.水稻的遺傳轉化1.1愈傷組織的誘導取成熟的水稻(日本晴)種子脫殼，用70%乙醇處理1分鐘，0.1%氯化汞處理15分鐘，滅菌的去離子水清洗4次以上，在干凈濾紙上晾干后轉移到含2mg/L2，4-D(Sigma公司)的NB。培養基上，parafilm膜封口，放在25。C培養箱內暗培養誘導胚性愈傷。7天后，把誘導的愈傷從種子上剝離，轉移至新的NBo培養基上繼代培養(附圖6A1)，約20天后用于轉化。1.2遺傳轉化將含有所要轉化載體pOsLOL2S，pOsLOL2AS和pOsLOL2G2的EHA105保存液在含有卡那霉素(50mg/L)(Sigma公司)和利福平(10mg/L)(Sigma公司)的LB固體培養基上劃線，28。C暗培養2天，挑單克隆菌斑入含相同濃度抗生素的LB液體培養基上，28°C，200轉/分搖動培養16-18小時至菌液濃度達到00595-0.5，取lml菌液提質粒酶切驗證，另取1ml菌液到含有相同濃度抗生素的100mlAB培養基中繼續培養12-14小時至菌液濃度達到00595-0.8。將菌液倒入滅菌的50mL離心管中，室溫4000轉/分離心30分鐘收集菌體，倒掉上清，用AAM培養基重懸清洗菌體1次，離心，再用AAM培養基懸浮菌體至OD595-0.4。挑選黃色、光亮、生長旺盛的水稻愈傷組織至無菌的培養皿中，把AAM培養基懸浮農桿菌菌體倒入該培養皿輕輕搖動混勻使水稻愈傷充分浸泡在菌液中，室溫靜置約40分鐘。倒掉菌液，將浸有菌液的愈傷轉移至2N6-AS培養基上，pamfilm膜封口，置培養箱中25'C黑暗條件下共培養2-3天，期間檢査農桿菌的生長情況，以農桿菌長滿水稻愈傷的表面為宜。將共培養后的愈傷轉移到干凈滅菌的三角瓶中，用滅菌的去離子水清洗10次以上，直至液體顯清晰為止，用無菌的去離子水定容至100ml，加頭孢霉素(北京鼎國生物技術公司)至濃度為500mg/L，氨芐青霉素(Sigma公司)至濃度為200mg/L，120轉/分25。C搖動2-2.5小時。倒掉液體將洗后愈傷轉移至無菌濾紙上晾干。將晾干的愈傷轉移至含有2mg/L、200mg/L氨節青霉素和50mg/L潮霉素B(Roche公司)的NBo培養基上，封口25。C暗培養，篩選轉化愈傷。期間時常觀察愈傷狀態和生長情況，避免雜菌污染。約15天后有抗性愈傷長出。挑取抗性愈傷至新的相同培養基上繼代培養一次(附圖6A2)。1.3愈傷分化和轉化苗的獲得將繼代培養約20天的抗性愈傷轉移至含有1.0mg/L6-BA(Sigma公司)、2.0mg/LNAA(Sigma公司)、5.0mg/LABA(Sigma公司)和50mg/L潮霉素B的NB()培養基上25t:暗培養，預分化(附圖6A3)3-4周。轉移白色緊實的預分化愈傷至含有2.0mg/L6-BA、1.0mg/LIAA(Sigma公司)、1.0mg/LNAA、1.0mg/LKT(Sigma公司)禾tl50mg/L潮霉素B的NB。培養基上，封口，轉移至25T:光照培養箱中16小時光照，8小時黑暗分化培養直至愈傷變綠，出現芽、根分化(附圖6A4)。將轉化水稻小苗轉移到1/2MS固體培養基上生長(附圖6B)，半個月后移栽至盆中。2.煙草的遺傳轉化2.1外植體的獲得將煙草SR1種子(購自中國農業科學院植物品種保藏中心)用70%乙醇浸泡1分鐘，10%次氯酸鈉(內加0.01%吐溫20)浸泡10分鐘，滅菌水洗4次以上，將種子放在無菌干凈濾紙上吸干水分，撒在1/2MS固體培養基上，封口。28'C暗培養2天后，轉到28'C光照培養(16小時光照，8小時黑暗)。發芽后轉到含有1/2MS固體培養基的玻璃瓶中，待苗長至約3周后即可取其葉片用于遺傳轉化。2.2遺傳轉化將含有所要轉化載體pOsLOL2S和pCAMBIA1302的EHA105保存液在含有卡那霉素(50mg/L)和利福平(20mg/L)的LB固體培養基上劃線，28。C暗培養2天，挑單克隆菌斑入含相同濃度抗生素的LB液體培養基上，28°C，200轉/分搖動培養16-18小時至菌液濃度達到00595-0.8，將菌液用1/2MS培養基稀釋10倍待用。取煙草葉片，剪成lcr^大小，在稀釋的菌液中浸泡15分鐘，取出葉片放在無菌濾紙上吸干。將吸干葉片正面朝下放在1/2MS固體培養基上，28"C暗培養48-72小時。2.3分化和轉化株的獲得將共培養后的葉片移至分化培養基(MS，+2mg/L6-BA、0.1mg/LIAA、30g/L蔗糖和2.0g/LPhytagel，pH5.8-6.0)+500mg/L羧芐青霉素(欣經科生物技術公司)和抗性篩選抗生素(20mg/L潮霉素B))，封口膜封口，放在光照培養箱中(16小時光照，8小時黑暗)，28。C培養。當分化培養基上愈傷組織長出大于1厘米的幼芽時，將其剪下移至生根培養基(MS，+0.2mg/LIAA)+抗生素(500mg/L羧芐青霉素，20mg/L潮霉素B)上，繼續光照培養，待根長出。苗長高后移栽到土中。3.煙草懸浮細胞的遺傳轉化將固體培養基上的煙草愈傷組織塊(BY-2)(Nagata等，1992)轉到NT液體培養基中懸浮培養3-5天，得到煙草懸浮細胞。將含有所要轉化載體pRGFP2和pOsLOL2G2的EHA105保存液在含有卡那霉素(50mg/L)和利福平(10mg/L)的LB固體培養基上劃線，28。C培養2天，挑單克隆菌斑入含相同濃度抗生素的LB液體培養基上，28°C，200轉/分搖動培養16-18小時至菌液濃度達到OD595-0.8。取10ml煙草懸浮培養細胞至干凈無菌三角瓶中加1ml搖好的農桿菌菌液混勻，室溫靜置4小時。再加10mlNT培養基至三角瓶中，125轉，28t:搖動共培養24-36小時。將共培養的懸浮細胞系轉入50ml離心管中，800轉/分室溫離心去掉上清，用1/2MS洗懸浮細胞5-8次，加20mlNT培養基和羧節青霉素，卡那霉素(pRGFP2)或潮霉素B(pOsLOL2G2)至終濃度分別為500mg/L，50mg/L(pRGFP2)或20mg/L(pOsLOL2G2)，懸浮培養5-7天，繼代培養直至有抗性細胞產生。實施例5:轉化系的表型分析在水稻轉化中，Os丄(9丄2sense轉化載體(pOsLOL2S)共獲得111個轉化系，antisense轉化載體(pOsLOL2AS)共獲得91個轉化系，提取轉化系水稻DNA，根據pCAMBIA1301載體上潮霉素抗性基因(潮霉素磷酸轉移酶HPTII)序列設計引物正向5'-TGCGCCCAAGCTGCATCAT-3，(SEQIDNO:10)反向5，-TGAACTCACCGCGACGTCTGT-3，(SEQIDNO:ll)，PCR擴增(反應條件94°C5min，94°C1min，60°C1min，72°C1min，35個循環，72°C5min。反應體系lxPCR反應緩沖液，1UTaq酶(Takara公司)，20ng水稻基因組DNA，0.2mMdNTP，0.2引物，加重蒸水至20nl)4個獨立的sense轉化系和4個獨立的antisense轉化系的基因組DNA以檢測轉化系是否為陽性(附圖7A，B)。結果對照日本晴無擴增條帶，sense和antisense轉化系均有擴增條帶，說明轉化株為陽性。通過對sense和antisense轉化系從TQ代到T4代的表型觀察發現，與對照日本晴相比，antisense轉化系植株表現矮小(附圖8)，而sense轉化系與對照無明顯差異。對上述sense和antisense轉化系(附圖8中2，3，4)進行半定量RT-PCR分析(水稻RNA用Invitrogen公司的Trizol試劑按說明書提取，用DNAaseI(Takara公司)處理RNA樣品，反轉錄用Invitrogen公司的Superscriptfirst-strandsynthesissystem進行，3嗎的水稻總RNA做模板)，從反轉錄反應體系中取lpl作為PCR反應的模板(反應條件94°C2min,94°C1min，60°C40see,72°C50min，25個循環，72°C3min。反應體系lxPCR反應緩沖液，1UTaq酶(Takara公司)，0.2mMdNTP，0.2|iM引物(SEQIDNO:4和SEQIDNO:5)，加重蒸水至20pl)進行PCR反應，瓊脂糖凝膠電泳。結果表明，在antisense轉化系(附圖9A)中C^O丄2基因的表達受到明顯的抑制，sense轉化系(附圖9B)中OA(9丄2基因表達量則明顯提高。綜合轉化系的表型和OAO丄2基因表達的分子檢測，發現該基因表達量下降，水稻植株表現矮小，OA(9ZJ基因過量表達時，對植株的生長無明顯影響。由此表明，a^o丄2基因參與了水稻生長發育。在煙草轉化中，OAOL2sense轉化載體轉化煙草共獲得20個轉化系，選8個轉化系做潮霉素抗性基因(HPTII)PCR(反應條件94°C5min，94°C1min，60°C1min，72°C1min，35個循環，72。C5min。反應體系lxPCR反應緩沖液，1UTaq酶(Takara公司)，20ng煙草基因組DNA，0.2mMdNTP，0.2|xM引物(SEQIDNO:10和SEQIDNO:ll)，加重蒸水至20pl)以檢測轉化系是否為陽性(附圖10A)，結果表明8個轉化系均有擴增條帶，說明均為轉化植株。同時進行了OAOZJ基因PCR反應(反應條件94°C5min，94°Clmin，60°C50sec，72°C1min，35個循環，72°C5min。反應體系lxPCR反應緩沖液，1UTaq酶(Takara公司)，20ng煙草基因組DNA，0.2mMdNTP，0.2引物(SEQIDNO:4和SEQIDNO:5)，加重蒸水至20pl)檢測OAOZ^基因轉化是否成功(附圖IOB)。結果表明這8個轉化系也均有0A0Z2基因的擴增條帶，說明OAOZJ基因被成功轉化進煙草中。煙草轉化系To代(附圖IIA)和T,代(附圖11B)表型觀察發現，Oy丄(9Z^sense煙草轉化系與對照pCAMBIA1302轉化系相比，植株表現矮小。實施例6:Os丄(Z^的水稻sense和antisense轉化系對水稻白葉枯菌(Xa"狄tf附omisO^^aepv.Oryzae)的抗性2004年4月和8月分別在海南和北京對Os丄(9ZJ基因sense和antisense轉化系進行水稻白葉枯菌接種試驗。采用剪刀剪切接種法，分別接種兩個菌株PX086(對日本晴不致病，國際水稻研究所提供，IRRI)和PX099(對日本晴致病，國際水稻研究所提供，IRRI)。接種后10天左右觀察葉片病斑的形成情況。結果發現OAO丄2基因sense轉化系表現為對水稻白葉枯菌(PX099)抗性增強(附圖12)，antisense轉化系表現為對水稻白葉枯菌(PX086)抗性減弱(附圖13)。由此表明，CWX^2基因與水稻的抗病性相關，OAO丄2基因過量表達能提高水稻的抗病性，而表達量降低會減弱水稻的抗病性。實施例7:0sIC^2基因的sense水稻轉化系對稻瘟菌(Mng/mpor狄egr/wa)的抗性選擇10個sense水稻轉化系的T3代純合系和對照日本晴用于稻瘟菌Y34的接種實驗。每個系播種20粒種子，發芽15天后接種稻瘟菌，接種7天后觀察結果(附圖14)。日本晴葉片有明顯的病斑產生，病斑大且呈繼續擴展趨勢，有的葉片甚至大部分枯死，表現出明顯的感病癥狀，感病等級達到5級。sense轉化系的葉片表現為過敏性反應，只有極小病斑產生，表現為抗性，感病等級為0級或1級。該結果再次表明，OAO丄2基因的過量表達能夠提高水稻的抗病性。實施例8:0s￡O￡2基因的sense煙草轉化系對青枯雷爾菌(及a/Wo附Viso/a"accarum)的抗性煙草青枯病是由青枯雷爾菌引起的一種以土壤傳播為主的細菌性病害。為了研究C^X^2基因在異源植物中的抗病反應，我們對sense煙草轉化系進行接種試驗。接種10天后觀察發病情況。野生型植株的葉片表現出明顯的病斑產生和感病癥狀，而轉化系葉片病斑明顯小于野生型病斑(附圖15)。此結果表明，OAO丄2基因在煙草中也能夠參與對病原菌的抗性。實施例9:(^/:o丄2基因的亞細胞定位pOsLOL2G2轉化載體轉化水稻共獲得67個轉化系，將T。代轉化系的種子滅菌在1/2MS培養基上發芽，待到芽長至1厘米左右時取根尖生長點壓片在綠色熒光顯微鏡下觀察GFP融合蛋白的細胞內定位。結果發現細胞核的熒光很強，說明OsLOL2-GFP融合蛋白富集于細胞核內(附圖16)，a^O丄2所表達的蛋白是核蛋白。pOsLOL2G2轉化載體轉化的煙草懸浮細胞(BY-2)，壓片后在綠色熒光顯微鏡下觀察，結果與水稻一致，細胞核區的熒光很強(附圖17A)，也說明該融合蛋白在煙草細胞中定位于核內。而單獨的GFP在核內外均有分布(附圖17B)。以上結果充分證明Oy丄(9丄2基因表達的鋅指蛋白是在細胞核內起作用的。結論參與了水稻和煙草的生長發育。過量表達該基因后，水稻表現出對水稻白葉枯病菌、稻瘟菌抗性的提高，煙草表現出對青枯雷爾菌抗性的提高，因此該基因在研究水稻株高發育、探索植物抗病信號傳導和水稻品種的抗病改良中可發揮重要的作用。OAOZ^表達的蛋白定位于細胞核內，推測它是作為轉錄因子發揮作用的。參考文獻1.EulgemT"RushtonPJ.，SchmelzerE.,HahlbrockK.andSomssich1.E.，(1999)，Earlynucleareventsinplantdefensesignaling:rapidgeneactivationbyWRKYtranscriptionfactors,77eJoz/rwa/18(17)，4689-4699.2.ChenC.H.，ChenZ.X(2002)，PotentiationofdevelopmentallyregulatedplantdefenseresponsebyAtWRKY18,apathogen-induced爿naZ)油戸'stranscriptionfactor.129(2)，706-716.3.MuskettP.R.,KahnK.，AustinM.J.,MoisanLJ.,SadanandomA.,ShirasuK.,JonesJ.D.G.andParkerJ.E.(2002)ArabidopsisiL4A/exertsrate-limitingcontrolofgene—mediateddefensesagainstmultiplepathogens,777e尸』Ce〃，Vol.14,979-992.4.DietrichR.A.，RichbergM.H.，SchmidtR.，DeanC.andDanglJ.L.,(1997)，Anovelzincfingerproteinisencodedbythe爿raZ^o戶'sLSDlgeneandfunctionsasanegativeregulatorofplantcelldeath.CW/，88685-694.5.DietrichR.A.，DelaneyT.P"UknesS丄，WardE.R.,RyalsJ.A.andDanglJ丄.(1994)Arabidopsismutantssimulatingdiseaseresistanceresponse.CW/，77:565-577.6.RobatzekS.andSomssichI.E.,(2002)TargetsofAWRKY6regulationduringplantsenescenceandpathogendefense.<awdZ)eve/o戸ewf，16:1139-1149.7.LiJ.，BraderGandPalvaE,T.，(2004)TheWRKY70TranscriptionFactor:ANodeofConvergenceforJasmonate-MediatedandSalicylate-MediatedSignalsinPlantDefense.7Tze尸taCW/16:319-331.8.RusterucciC,AvivDH，HoltBF3rd,DanglJ丄.andParkerJE.(2001)ThediseaseresistancesignalingcomponentsEDSlandPAD4areessentialregulatorsofthecelldeathpathwaycontrolledbyLSDlinArabidopsis.77zeP/a"fCe〃13(10):2211-2224.9.AvivD.H.,Rust6rucciC.，HoltIiiB.F.,DietrichR.A"ParkerJ.E.andDanglJ丄.(2002)Runawaycelldeath,butnotbasaldiseaseresistance,infc(i/isSA-and7V/M7/7V尸i^-dependent77ze尸/a"f/ow"a/29(3):381-391.10.EppleP"MackA.A.，MorrisV.R.F.andDanglJ丄.(2003)Antagonisticcontrolofoxidativestress-inducedcelldeathinArabidopsisbytworelatedplant-specificzincfingerproteins.授v451100(10):6831-6836.11.FridborgI.，KuuskS.，MoritzT.andSundbergE.(1999)TheArabidopsismutants/h'exhibitsreducedgibberellinresponsesconferredbyoverexpressionofanewputativezincfingerprotein.7Tze戶/awCW/11:1019-1031.12.PettyL.M.，HarberdN.P,，CarreI.A.，ThomasB.，andJacksonS.D.(2003)ExpressionoftheArabidopsisgaigeneunderitsownpromotercausesareductioninplantheightinchrysanthemumbyattenuationofthegibberellinresponse.尸/awf5Wewce164:175-182.13.PriggeM丄andWagnerD.R.(2001)TheArabidopsisS五腦7Egeneencodesazinc-fingerproteinrequiredfornormalshootdevelopment.772e尸/awfCe//13:1263-1279.14.Bow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