專利名稱：一種環狀糊精葡萄糖基轉移酶的產生菌的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物技術領域，具體地說是一種環狀糊精葡萄糖基轉移酶 的產生菌。
技術背景環狀糊精葡萄糖基轉移酶(Cyclodextrin Glucanotransferase EC 2.4.1.19， 簡稱CGTase)，是催化淀粉合成環狀糊精的酶。環狀糊精(cyclodextrin,簡稱 CD)是由D-吡喃葡萄糖基以"-l， 4葡萄糖苷鍵連接成環構成的環形低聚糖, 根據組成葡萄糖基個數的不同，分別叫做"、々、7-環糊精(葡萄糖基個數 分別為6、 7、 8個)。作為生物工程的領域之一，以環狀糊精葡萄糖基轉移酶 作用于淀粉制成的環狀糊精，具有中空的圓筒狀結構，內部疏水，外部親水， 可同分子空隙中的包蔽物質絡合成為分子包接物，能包接氣體、鹵素、染料、 香料、農藥、食品等，被譽為"分子膠囊"和"皇冠化合物"，因而在食品、 醫藥、化學、農業、分析化學以及環保等領域有著廣泛的應用。1998年全球 共消耗環糊精6000噸，價值達l億美元，2002年環糊精市場達2.5億美元。雖然環狀糊精也可以通過化學合成的方法得到，但是化學合成方法的環 糊精產率極低，只適合于科學研究的目的。因此，現有的工業化生產都是采 用酶法合成環狀糊精，即在環糊精葡萄糖基轉移酶催化作用下，轉化淀粉及 相關基質合成環狀糊精。對環狀糊精葡萄糖基轉移酶的基礎研究早在上世紀30年代就已開始， 1973年以來相繼報導的各種資料表明，芽孢桿菌屬的多種細菌都能產生 CGTase，例如軟化芽孢桿菌(及macerara 1904年)、巨大芽孢桿菌(漢 mega&Www 1972年)、環狀芽孢桿菌(及"Vrw/ara 1973年)、嗜熱脂肪芽孢桿 菌(及WearaAerwop/n'/ws 1973年)、嗜堿性芽孢桿菌(J汰a/op/n7/c 5ac/〃ws 1982 年)和肺炎克氏桿菌(K/e^W/a/ wewwo"z'ael977年)等，其中以嗜熱脂肪芽 孢桿菌的酶熱穩定性高，巨大芽孢桿菌產酶量大。此外，據報道我國淡 家林 發現不生芽孢的嗜堿細菌(1985年)也能產生CGTase，是我國特有的菌種。 現已經證明，能產生CGTase的細菌主要可分為兩大類 一類以生成a-CD為 主， 一般多用的是軟化芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌和肺炎克氏桿菌；另一 類以生成P-CD為主， 一般多用巨大芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌和嗜堿芽孢桿
菌，其酶學性質有所差異。國際上對環狀糊精的生產和應用研究始于上世紀70年代，日本是世界上 率先實現環狀糊精工業化生產的國家，國際市場上環糊精的主要生產商有法 國Cerestar、德國Wacker Biochem和日本Ensuiko Sugar等，日本在環糊精的 生產與應用研究方面處于世界領先地位。我國于上世紀70年代末和80年代 初開始對環狀糊精的生產和應用進行探索性研究，由于嗜堿性芽孢桿菌的發 酵條件較為粗放，易于控制和操作，生產成本相對較低，因此我國工業上基 本都采用嗜堿性芽孢桿菌來生產環狀糊精，但是總體上我國環狀糊精的產量 低、價格較貴且純度不高，因此對環糊精生產的研究有著重要的意義。由此可見，環狀糊精葡萄糖基轉移酶是工業化生產環狀糊精的關鍵酶， 然而在使用CGTase由淀粉工業化生產環狀糊精的過程中，由于高溫(85°C 90°C)和強堿(pH8.5)是不可缺少的反應條件，因此耐熱、耐堿的環狀糊精 葡萄糖基轉移酶才具有商業化價值。 發明內容本發明的目的是提供一種環狀糊精葡萄糖基轉移酶的產生菌，該菌產生 的環狀糊精葡萄糖基轉移酶酶活性好，極為穩定，具有很好的熱穩定性。本發明利用云南省微生物資源豐富的優勢，從淀粉含量高的麥地、淀粉 廠、糧庫等周圍篩選到一株產環狀糊精葡萄糖基轉移酶的芽孢桿菌屬 (fecLL/"s印)菌株，自命名LZ-10，保藏編號為CGMCCNo.2096，保藏日 期為2007年6月22日，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心(簡稱CGMCC)。其粗酶的最適反應pH為9.0，最適反應溫度為65 °C，熱穩定性較好，在6(TC-65X:下保溫30分鐘仍保持9596以上的殘余酶活， 在pH8. 5-9. 5條件下保溫30分鐘時仍保持90%以上的殘余酶活。該菌株的制備方法為1)菌株的分離和篩選從富含淀粉的麥地、淀粉廠、糧庫等周圍采集土 樣，稱取土樣5g至45ml生理鹽水中，加入玻璃珠充分震蕩后置于沸水浴中5 分鐘，靜置1小時。取土樣上清液100W于試管中，做梯度稀釋，取適宜稀釋 度涂布篩選平板，于電熱恒溫培養箱中37t:培養48hr。培養數天后(1、 3、 5 天，分別)觀察菌落形成與形成變色透明圈的大小，挑取有黃色透明圈者， 劃線分離純化。將純化后的菌株接入液體發酵培養基中進行搖瓶發酵，通過 酶活測定最終分離篩選到產環狀糊精葡萄糖基轉移酶酶活高且穩定性好的菌 株LZ-10。2)所用篩選培養基可溶性淀粉1%，無水碳酸鈉1%，蛋白胨1%，酵母膏0. 5%， K2HP04. 3H20 0. 13%， MgS04. 7H20 0. 02%，酚酞0. 03%，瓊脂2% (pH9. 0)。 3)所用發酵培養基玉米淀粉1%，酵母膏0. 1%， Na2C03 0 . 5% ， K2HP04. 3H200. 13%， MgS04. 7H20 0. 02%。 菌株的初步鑒定(1) 根據形態、培養特征和生理生化測定的鑒定，菌株LZ-IO為革蘭氏 陽性芽孢桿菌，芽孢卵圓形。能在10 7(TC溫度范圍內生長，最適生長溫度為 28 37。C，生長pH是7.0-10.0，最適生長pH為8.0-9.0。過氧化氫酶反應陽性， 好氧生長，V.P.反應陽性，水解淀粉和明膠，不利用檸檬酸鹽，不還原硝酸 鹽，不形成吲哚和二羥基丙酮等。(2) 根據16S rDNA序列相似性比對，LZ-10的16S rDNA與^acii〗^ sp. DSM 8714有99%的同源性，與Sacj'W〃s pate卵m'e/7^'s PAT 05 有99%的 同源性，與AacL^wssp.麗3-SN6有97。/。的同源性。菌株的16S rDNA基因 為(GenBank登陸號為DQ400103): >LZ-10CCGTTGCCAGTATGGCTACCATGGTTGCATTCCGAAGTCGAGCGGACAGAAGGGAGGTTGGTGCCG GAAGTGAGCGGGGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCCCTTAGACTGGGATAACTTCGGG AAACCGAAGCTAATACGGGATAACACTTTTTCCTACCTGGGAGAAAGTTAAAAGATGGCCTTTGTG CTATCACTAGGGGATGGGCCCGCGGCGCATTAGGTAGTTGGTAAGGTAATGGGTTACGAAGGGGAC GATGCGTAGCGGACCTGAGAGGGTGATCGGCGACACTGGGAGTGAAACAGGGCCCAGACTGCTACG GGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAATGCCGCGTGAGTGAG GAAGGCCTTCGGGTCGTAAAGCTGTGTTGTGAGGGAAGAACAAGTATCGGTTGAATAAGCCGGTAC CTTGAGGGTACCTGACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCGAGCAGGCGCGGTAATACGTAGGTG GCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCCGTAAAGGGGGGGGAGGCGGCTTCTTAAAGTCTGATGTGA AATCTCGGGGCTCACCCCCGAGCGGCCATTGGAAAGTGGGAAGCTTGAGTGGAGAAGAGGAGAGTG GAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAAGATATGTGGAGGAACACCAGTGGGGAAGGCGAGTCT CTGGTCTGTAACTGACGGTGAGGCGGGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGT CCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTAGGGGTTTCGATGGCGGTAGTGCGGAAGTAAAGAGA TTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTAGGACCGCAAGGTTGAAAGTCAAAGGAATTGACGGGGAGCCGCA CAAGCAGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACGTTAGCAGGTCTTGACATCCTT TGACCACTCTGGAGACAGAGCTTCGCCTTCGGGGGCAAAGTGACAGGTGGTGGATGGTTGTCGTCA GGTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCGCGGAAGGAGCGCAAGCGTTGATGTTAGTTGGCAGCA TTTAGTTGGGCACTGTAAGGTGACTGCGGGTGACAAACGGGAGGAAGGTGGGGACGACGTGAAATG ATCATGCCCGTTATGACCTGGGCTACAGACGTGCTACAATGGATGGTAGAAAGGGTTGCGAAGCGG CGAGGTGAAGCGAATCCCATAAAGCCATTGTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTGGGCTACATGA AGCCGGAATTGGTAGTAATCGCGGATGAGGATGGCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACA CCGGCCGTCAGACCACGAGAGTTTGTAACACGGGAAGTCGGTGAGGTAAGCTTTTGGAGCGAGCCG GCTAAGGTGGGACAAATGATTGGGGTGAAGTGGTAACAAGGTAGCCT結合菌株的菌落特征、生理生化特性、16SrDNA同源性分析等方面的區 別性特征，初步鑒定菌株LZ-10為芽孢桿菌屬(5aw7^As sp)。菌株的發酵將種子培養液接入裝有30ml發酵培養基的三角瓶中，置于回轉式恒溫調 速搖瓶柜中進行好氧發酵，轉速為200rpm/min， 37'C發酵4天。發酵液離心， 取上清液(含環狀糊精葡萄糖基轉移酶)，置于4'C保存。所用發酵培養基 玉米淀粉1%,酵母膏0. 1%， Na2C03 0. 5% ， K2HP04. 3H20 0. 13%, MgS04. 7H20 0. 02%。酶活測定方法和粗酶酶學性質 (1 )酶活觀!j定方》去(見H. J. Fuwa. A new method for microdetermination of amylase activity by the use of amylase as the substrate [J]. Biochemistry, 1954(41): 583-603)① 原理馬鈴薯淀粉與碘溶液作用后顯出藍色，當淀粉被P-CGTase 水解成P -CD后使得碘溶液引起的顏色變化變弱。② 測定步驟取0.01ml適當稀釋的酶液，加0.2ml 0.2M的Gly-NaOH 緩沖液(pH9.0)，再加溶解的0.2%馬鈴薯淀粉溶液0.2ml， 40。C反應10分鐘， 加0.5M冰醋酸0.5ml終止反應，力n 3ml 0.005%碘溶液顯色，以不加淀粉溶液 的反應液作空白，以不加酶液為對照，在700nm測定吸光度(OD值)。③ 酶活定義 一個活力單位定義為藍值下降10%所需的酶量。 酶活計算公式酶活(U/ml) =^"000><稀釋倍數a其中，a為對照組OD值，b為樣品OD值。 (2)粗酶酶學性質(見附圖) 本發明分離得到產環狀糊精葡萄糖基轉移酶的優良菌株LZ-IO，其所產環 狀糊精葡萄糖基轉移酶粗酶的最適反應pH為9.0，最適反應溫度為65"C，熱 穩定性較好，在60°C-65。C下保溫30分鐘仍保持95%以上的殘余酶活，在 pH8. 5-9. 5條件下保溫30分鐘時仍保持90%以上的殘余酶活。同已報道的環 狀糊精葡萄糖基轉移酶相比較，該酶兼具耐熱和耐堿特性，適合應用于環狀 糊精的酶法工業化生產過程。
圖1為本發明的粗酶酶學性質檢測中的最適溫度曲線。圖2為本發明的粗酶酶學性質檢測中的最適pH曲線。圖3為本發明的粗酶酶學性質檢測中的溫度對酶穩定性的影響。圖4為本發明的粗酶酶學性質檢測中的pH對酶穩定性的影響。本發明的微生物保藏日期為2007年6月22日，保藏單位簡稱CGMCC，地址北京市海淀區中關村北一條13號，保藏編號CGMCCNo. 2096，分類命名芽孢桿菌^acj'J^s邵.。
具體實施方式
實施例1、 菌株的分離和篩選從富含淀粉的麥地、淀粉廠、糧庫等周圍采集土樣，稱取土樣5g至45ml 生理鹽水中，加入玻璃珠充分震蕩后置于沸水浴中5分鐘，靜置l小時；取 土樣上清液100pl于試管中，做梯度稀釋，取適宜稀釋度涂布篩選平板，于電 熱恒溫培養箱中37。C培養48hr。培養5天后(1、 3、 5天分別)觀察菌落形 成與形成變色透明圈的大小，挑取有黃色透明圈者，劃線分離純化；將純化 后的菌株接入液體發酵培養基中進行搖瓶發酵，通過酶活測定最終分離篩選 到產環狀糊精葡萄糖基轉移酶酶活高且穩定性好的菌株LZ-10。所用篩選培養基可溶性淀粉1%，無水碳酸鈉1%，蛋白胨1%，酵母膏 0. 5%， K2HP0" 3H20 0. 13%， MgSO.,. 7H20 0. 02%，酚酞0. 03%，瓊脂2% (pH9. 0)。所用發酵培養基玉米淀粉1%，酵母膏O. 1%， Nam 0.5%， K異.3H2。 0. 13%， MgS04. 7H20 0. 02%。2、 菌株的初步鑒定-根據形態、培養特征和生理生化測定的鑒定，菌株LZ-10為革蘭氏陽性 芽孢桿菌，芽孢卵圓形。能在10 7(TC溫度范圍內生長，最適生長溫度為28 37 °C，生長pH是7.0 10.0,最適生長pH為8.0 9.0。過氧化氫酶反應陽性，好 氧生長，V.P.反應陽性，水解淀粉和明膠，不利用檸檬酸鹽，不還原硝酸鹽，
不形成吲哚和二羥基丙酮等。根據16S rDNA序列相似性比對，LZ-10的16S rDNA與勘C2'"^ sp. DSM 8714有99%的同源性，與萬aci"〃s pate卵d'e/^^s PAT 05t有9996的同源性， 與萬sc2'""s sp.麗3-SN6有97%的同源性。菌株16S rDNA在GenBank的登 陸號為DQ400103。結合菌株的菌落特征、生理生化特性、16SrDNA同源性分 析等方面的區別性特征，初步鑒定菌株LZ-10為芽孢桿菌屬(Aaw77^ sp)。3、菌株的發酵將種子培養液接入裝有30ml發酵培養基的三角瓶中，置于回轉式恒溫調 速搖瓶柜中進行好氧發酵，轉速為200 rpm/min， 37'C發酵4天。發酵液離心， 取上清液，置于4'C保存。所用發酵培養基玉米淀粉1%，酵母膏0. 1%， Na2C03 0. 5% ， K2HP04. 3H20 0. 13%, MgS04. 7H20 0. 02%。(:GTase專利—ST25.1xtSEQUENCE LIST[NG〈no>云南師范大學<120〉 一種環狀糊精葡萄糖基轉移酶的產生菌及:1L:制備方法 <130〉 12 <160〉 1<170> Patentln version 3.4<210〉 1<21i> 1499<212〉 腿<213〉 Bacillus sp.<22。〉<221〉 r隨<222> (1)., (1499)<400> 1ccgttgccag tatggctacc atccttgcat tccgaagtcg agcggacaga agggagcttg 60ctcccggaag tcagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg c朋cctgccc cttagactgg 120gataacttcg ggaaaccgaa gctaataccg gataacactt tUcctacct gggagaaagt 180taaaagatgg cctttgtgc.t at(:actaggg gatgggcccg cggcgcatta gctagttggt 240aaggtaatgg cttaccaagg cgacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcggccacac 300tgggactgaa acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg 360gacgaaagtc tgacggagca atgccgcgtg agtgaggaag gccttcgggt cgtaaagctc 420tgttgtgagg gaagaacaag tatcggttga ataagccggt accttgacgg tacctcacca 480gaaagccacg gctaactacg tgcxagcagc cgcgglaata cgtaggtggc aagcgttgtc 540cggaattatt gggccgtaaa gcgcgcgcag gcggcUctt, aaagtctgat gtgaaatctc 600ggggctcacc cccgagcggc cattgg幼ac tggg犯gctt gagtgcagaa gagg卿gtg 660gaattccacg tgtagcggt.g aaatgcgtaa gatatgtgga ggaacaccag tggggaaggc 720gactctctgg tctgtaactg acgctgaggc gcgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga 780taccctggta gtccacgccg taaacgatga gtgctaggtg ttaggggttt cgatgcccgt 840agtgccgaag taaacacatt aagcactccg cctggggagt acgaccgcaa ggttgaaact 900caaaggaatt gacggggacc cgcac犯gca gtggagcatg tggtttaatt cg犯gcaacg 960cgaagaacct taccaggtct tgacatcctt tgaccactct ggagacagag c.U.ccccttc 1020gggggc編g tg織ggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt 1080aagtcccgca acgagcgcaa cccttgatct tagttgccag catttagttg ggcactctaa 1140ggtgactgcc ggtgac朋ac cggagg朋gg tggggacgac gtcaaatcat catgcccctt 1200atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg atggtacaaa gggttgcgaa gccgcgaggt 1260gaagccaatc ccataaagcc attctcagtt cggattgtag gctgcaactc gcctacatga 1320agccggaatt gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggtcttg 1380tacacaccgc ccgtcacacc acgagagttt gtaacacccg aagtcggtga ggtaaccttt 1440tggagccagc cgcctaaggt gggacaaatg attggggtga agtcgtaaca aggtagcct 1499
權利要求
1、一種環狀糊精葡萄糖基轉移酶的產生菌，為芽孢桿菌屬(Bacillus sp)，其保藏編號為CGMCC No.2096。
2、 根據權利要求1所述的環狀糊精葡萄糖基轉移酶產生菌，其特征在于 該菌株LZ-10的16S rDNA基因為CCGTTGCCAGTATGGGTACCATCGTTGCATTCCGAAGTCGAGGGGACAGAAGGGAGCTTGCTCGGG GAAGTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGGMCCTGGCCCTTAGACTGGGATAACTTGGGG AAAGCGAAGCTAATACGGGATAACACTTTTTGGTACCTGGGAGAAAGTTAAAAGATGGCCTTTGTG GTATCAGTAGGGGATGGGGGCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAATGGGTTACGAAGGCGAC GATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAAACACGGCGCAGAGTCCTACG GGAGGCAGGAGTAGGGAATCTTCCGGAATGGACGAAAGTGTGACGGAGCAATGCGGCGTGAGTGAG GAAGGCCTTCGGGTCGTAAAGCTCTGTTGTGAGGGAAGAACAAGTATCGGTTGMTAAGCCGGTAG CTTGACGGTACCTGACCAGAAAGGCACGGCTAACTAGGTGCCAGCAGCGGCGGTAATACGTAGGTG GCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCTTCTTAAAGTGTGATGTGA AATCTCGGGGCTCACGCCCGAGCGGGGATTGGAAACTGGGAAGCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTG GAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGGGTAAGATATGTGGAGGAACAGGAGTGGGGAAGGCGACTCT CTGGTGTGTAAGTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGGAAAGAGGATTAGATACCCTGGTAGT CCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTAGGGGTTTCGATGCCCGTAGTGCCGAAGTAAACACA TTAAGCACTGGGCGTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAAGTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCA CAAGGAGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAAGGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATGCTT TGACCACTCTGGAGACAGAGCTTCGCCTTCGGGGGGAAAGTGAGAGGTGGTGGATGGTTGTCGTCA GCTCGTGTGGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCGGCAACGAGCGCAAGCCTTGATCTTAGTTGCCAGCA TTTAGTTGGGGACTGTAAGGTGACTGGCGGTGACAAACGGGAGGAAGGTGGGGAGGAGGTGAMTC ATCATGCGGGTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGTTGCGAAGCCG CGAGGTGAAGGCAATCCCATAAAGCCATTCTCAGTTGGGATTGTAGGCTGCAAGTGGCGTACATGA AGCGGGAATTGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATAGGTTCCCGGGTGTTGTACAGA CCGCCGGTGACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTGGAGCCAGGGG CCTAAGGTGGGACAAATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCGT
全文摘要
本發明是一種環狀糊精葡萄糖基轉移酶的產生菌。本發明分離得到的菌株LZ-10，經鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillus sp)，其保藏編號為CGMCC No.2096。其所產環狀糊精葡萄糖基轉移酶粗酶的最適反應pH為9.0，最適反應溫度為65℃，熱穩定性較好，在60℃-65℃下保溫30分鐘仍保持95％以上的殘余酶活，在pH8.5-9.5條件下保溫30分鐘時仍保持90％以上的殘余酶活。同已報道的環狀糊精葡萄糖基轉移酶相比較，該酶兼具耐熱和耐堿特性，適合應用于環狀糊精的酶法工業化生產過程。
文檔編號C12R1/07GK101130761SQ20071006603
公開日2008年2月27日 申請日期2007年7月13日 優先權日2007年7月13日
發明者唐湘華, 孟艷芬, 波 許, 黃遵錫 申請人:云南師范大學