專利名稱：海產甲殼類寄生血卵渦鞭蟲的pcr檢測方法
技術領域：
本發明公開了一種對海產甲殼類動物寄生血卵渦鞭蟲的PCR檢測方法，適用于梭子蟹、鋸緣青蟹、海水龍蝦、日本蟳等海產甲殼類血卵渦鞭蟲病的檢測，屬于水產養殖動物疾病的檢測技術。
背景技術：
血卵渦鞭蟲(Hematodinium)是一類危害海水甲殼動物的重要病原性寄生蟲，具有很強的致病性，可引起挪威龍蝦(N.norvegicus)、蘭蟹(C.Sapidus)、白氏雪蟹(C.bairdi)以及蛛雪蟹(C.opilo)等許多重要經濟甲殼類發病，并導致規模性死亡，由于其宿主和流行范圍廣、死亡率高、危害非常嚴重。2005年我們首次從養殖梭子蟹中發現該寄生蟲病原，并進一步證實其是引起養殖梭子蟹規模性死亡重大疾病“牛奶病”的主要病原之一，繼后又在養殖鋸緣青蟹、海捕日本蟳等其他海產甲殼類當中檢測到該寄生蟲病原。至今尚缺少該寄生蟲病原研究報道，對該寄生蟲的許多基礎研究尚屬空白，特別是缺少有關該寄生蟲的檢測技術，為該寄生蟲疾病的預防和控制帶來了困難。
發明內容
為克服上述現有技術的不足，本發明的目的是提供一種血卵渦鞭蟲的PCR檢測方法，以實現對血卵渦鞭蟲的準確檢測，為預防和控制該病的發生，為健康養殖提供科學的依據。PCR是一種具有敏感性高、特異性強的靶DNA的快速檢測方法，能實現病原的快速、正確檢測，樣品中即使含有少量的病原DNA，即能檢出。
為了實現上述本發明的目的，本發明所建立的血卵渦鞭蟲PCR檢測方法包括下列步驟1)樣品處理取檢測樣品肌肉組織100～500mg，用0.7～1mL試劑A懸浮樣品，并將樣品充分混勻；每分鐘10000～12000轉離心2～5min；或取檢測樣品血淋巴300μL，每分鐘8000轉離心5min；棄上清，用500μL試劑A懸浮樣品。
2)DNA提取取500μL上述樣品處理液，加入100μL試劑B混勻，在55℃浴中保溫30～120min，期間不斷混勻；加入等體積的酚/氯仿抽提，每分鐘12000轉離心10min，取上清并加入上清體積2倍的無水乙醇沉淀DNA，室溫放置5～10min；每分鐘12000轉離心5～10min；棄上清，75％乙醇洗滌沉淀1～2次，讓乙醇徹底揮發，將沉淀溶于30～50μL滅菌雙蒸水中，即為DNA提取液，-20℃保存備用。
3)反應體系在PCR試劑管中加入0.5～1μL上述的DNA提取液，每管加入2.5U/μL的Taq酶0.5～1.0μL，每分鐘3000～5000轉離心2～5s混勻，置于PCR試管內進行擴增。
4)擴增條件通過94℃解鏈5min；然后94℃變性45s，55℃復性45s，72℃延伸1min，如此進行循環35次；最后72℃延伸10min，得擴增物。
5)PCR擴增物分析取5～10μL擴增后的樣品，與1～4μL 0.25％(w/v)溴酚藍上樣緩沖液混合，在含0.5μg/mL溴化乙錠的1％(w/v)瓊脂糖中進行電泳和顯色，在透射紫外燈下觀察。
6)判斷標準若樣品孔有一條586bp核酸條帶為有血卵渦鞭蟲感染或污染的陽性樣品，沒有顯示該核酸條帶為陰性未感染。
其中所述的試劑A成分為0.5M NaCl，50mM Tris(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0)；試劑B成分為20mg/mL蛋白酶K、10％SDS；PCR試劑管成分為2.5～5.0μL 10 x buffer，2.0～4.0μL dNTP(為dTTP、dATP、dCTP、dGTP四種核苷酸的混合物，每種濃度2.5mM)，1.5～3.0μL25mM MgCl2，0.25～0.5μL 25μM引物1，0.25～0.5μL 25μM引物2，17.5～35μL滅菌去離子水。
PCR試劑成分最佳組成為5.0μL 10 x buffer，1μL 2.5U/ul Taq酶，4.0μLdNTP，3.0μL 25mM MgCl2，0.5μL 25μM引物1，0.5μL 25μM引物2，35μL滅菌去離子水其中dNTP為dTTP、dATP、dCTP、dGTP四種核苷酸的混合物，每種濃度2.5mM。
所述的上游引物1和下游引物2分別是由DNA合成儀按堿基序列為上游引物15’-CTGATTACGTCCCTGCCCTT-3’；下游引物25’-GCATGTCGCTGCGTTCTTC-3’合成的DNA片段。
本發明原理為試劑A和B將樣品中的血卵渦鞭蟲進行裂解，釋放出蟲體DNA，PCR反應試劑管含多聚酶鏈式反應試劑，通過試劑管中所含的血卵渦鞭蟲特異DNA片段引物和Taq酶等成份，對樣品中釋放出的DNA進行特異性的擴增。由于本發明的引物為血卵渦鞭蟲所特有，因此，如果樣品中含有血卵渦鞭蟲，那么它的DNA的特異片段在經過擴增后，濃度將達到108mol(克分子)以上，在電泳和溴乙錠染色后，紫外光檢測就可以探測到一定分子量的目的條帶。如果沒有血卵渦鞭蟲，則不能擴增到同樣分子量的目的條帶。
本發明選擇特異引物并確立血卵渦鞭蟲PCR檢測技術，具有如下優點和積極效果1.本發明方法檢測十分快速，4～8h即可得知檢測結果，而其它方法則至少需要1天或一個星期以上。
2.本發明選擇引物為針對ITS特異性引物，相比18S rRNA具有更強的特異性，進一步提高檢測的準確性和靈敏度，檢測下限低至1～10個左右的蟲體。
3.本發明可以應用于多種樣品的檢測，可以檢測所有海水甲殼類動物(包括梭子蟹、鋸緣青蟹等)遭受血卵渦鞭蟲感染的情況，還可以檢測養殖飼料和鮮活餌料是否遭受血卵渦鞭蟲污染，應用廣泛，保證了健康養殖的需要。
具體實施例方式
實施例1按以下方法配制檢測血卵渦鞭蟲試劑1)試劑A成分為0.5M NaCl，50mM Tris(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0)；2)試劑B成分為20mg/mL蛋白酶K、10％SDS；3)PCR試劑管成分為2.5μL 10 x buffer，2.0μL dNTP(為dTTP、dATP、dCTP、dGTP四種核苷酸的混合物，每種濃度2.5mM)，1.5μL 25mM MgCl2，0.25μL 25μM引物1，0.25μL 25μM引物2，17.5μL滅菌去離子水。
4)2.5U/μL Taq酶；5)含0.5μg/mL溴化乙錠的1.0％(g/mL)的瓊脂糖；
6)0.25％(g/ml)溴酚藍上樣緩沖液；按以下步驟進行檢測(1)樣品處理取蟹肌肉組織100mg，用0.7mL試劑A懸浮樣品，勻漿器勻漿。
(2)DNA提取取500μL組織勻漿，再加入100μL試劑B混勻，在55℃浴中保溫30min，期間不斷混勻；加入等體積的酚/氯仿抽提，每分鐘12000轉離心10min；取上清并加入上清體積2倍的無水乙醇沉淀DNA，室溫放置10min；每分鐘12000轉離心10min；棄上清，75％乙醇洗滌沉淀1～2次，讓乙醇徹底揮發，將其沉淀溶于30μL滅菌雙蒸水中，即為DNA提取液，-20℃保存備用。
(3)在PCR試劑管中加入0.5μL的DNA提取液，每管加入2.5U/μL的Taq酶0.5μL，每分鐘3000轉離心2s混勻，置于PCR儀內進行擴增；通過94℃解鏈5min；然后94℃變性45s，55℃復性45s，72℃延伸1min，如此進行循環35次；最后72℃延伸10min，得擴增物。
(4)PCR擴增物分析取5μL擴增后的樣品，與1μL 0.25％溴酚藍上樣緩沖液混合，在含0.5μg/mL溴化乙錠的1.0％(g/mL)的瓊脂糖中進行電泳和顯色，在透射紫外燈下觀察，如果所有樣品孔均出現一條586bp核酸條帶，說明樣品有血卵渦鞭蟲感染或污染。(其中電泳液組成、電泳方法及染色方法參考分子克隆實驗指南(第二版)，p307，p309-313，p314。)實施例2按以下方法配制檢測血卵渦鞭蟲試劑1)試劑A成分為0.5M NaCl，50mM Tris(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0)；2)試劑B成分為20mg/mL蛋白酶K、10％SDS；
3)PCR試劑管成分為5.0μL 10 x buffer，4.0μL dNTP(為dTTP、dATP、dCTP、dGTP四種核苷酸的混合物，每種濃度2.5mM)，2.5μL 25mM MgCl2，0.5μL 25μM引物1，0.5μL 25μM引物2，35μL滅菌去離子水。
4)2.5U/μL Taq酶；5)含0.5μg/mL溴化乙錠的1.0％(g/mL)的瓊脂糖；6)0.25％(g/mL)溴酚藍上樣緩沖液；按以下步驟進行檢測(1)樣品處理取蟹肌肉組織300mg，用1.0mL試劑A懸浮樣品，勻漿器勻漿。
(2)DNA提取取500/μL組織勻漿，再加入100μL試劑B混勻，在55℃浴中保溫75min，期間不斷混勻；加入等體積的酚/氯仿抽提，每分鐘12000轉離心10min；取上清并加入上清體積2倍的無水乙醇沉淀DNA，室溫放置10min；每分鐘12000轉離心10min；棄上清，75％乙醇洗滌沉淀1～2次，讓乙醇徹底揮發，將其沉淀溶于40μL滅菌雙蒸水中，即為DNA提取液，-20℃保存備用。
(3)在PCR試劑管中加入1μL的DNA提取液，每管加入2.5U/μL的Taq酶0.5μL，每分鐘4000轉離心3.5s混勻，置于PCR儀內進行擴增；通過94℃解鏈5min；然后94℃變性45s，55℃復性45s，72℃延伸1min，如此進行循環35次；最后72℃延伸10min，得擴增物。
(4)PCR擴增物分析取8μL擴增后的樣品，與4μL 0.25％溴酚藍上樣緩沖液混合，在含0.5μg/mL溴化乙錠的1.0％(g/mL)的瓊脂糖中進行電泳和顯色，在透射紫外燈下觀察，如果所有樣品孔均出現一條586bp核酸條帶，說明樣品有血卵渦鞭蟲感染或污染。(其中電泳液組成、電泳方法及染色方法參考分子克隆實驗指南(第二版)，p307，p309-313，p314。)實施例3按以下方法配制檢測血卵渦鞭蟲試劑1)試劑A成分為0.5M NaCl，50mM Tris(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0)；2)試劑B成分為20mg/mL蛋白酶K、10％SDS；3)PCR試劑管成分為5.0μL 10 x buffer，4.0μL dNTP(為dTTP、dATP、dCTP、dGTP四種核苷酸的混合物，每種濃度2.5mM)，3.0μL 25mM MgCl2，0.5μL 25μM引物1，0.5μL 25μM引物2，35μL滅菌去離子水。
4)2.5U/μL Taq酶；5)含0.5μg/mL溴化乙錠的1.0％(g/mL)的瓊脂糖；6)0.25％(g/mL)溴酚藍上樣緩沖液；按以下步驟進行檢測(1)樣品處理取蟹肌肉組織500mg，用1mL試劑A懸浮樣品，勻漿器勻漿。
(2)DNA提取取500μL組織勻漿，再加入100μL試劑B混勻，在55℃浴中保溫120min，期間不斷混勻；加入等體積的酚/氯仿抽提，每分鐘12000轉離心10min；取上清并加入上清體積2倍的無水乙醇沉淀DNA，室溫放置10min；每分鐘12000轉離心10min；棄上清，75％乙醇洗滌沉淀1～2次，讓乙醇徹底揮發，將其沉淀溶于50μL滅菌雙蒸水中，即為DNA提取液，-20℃保存備用。
(3)在PCR試劑管中加入1μL的DNA提取液，每管加入2.5U/μL的Taq酶1.0μL，每分鐘5000轉離心5s混勻，置于PCR儀內進行擴增；通過94℃解鏈5min；然后94℃變性45s，55℃復性45s，72℃延伸1min，如此進行循環35次；最后72℃延伸10min，得擴增物。
(4)PCR擴增物分析取10μL擴增后的樣品，與2μL 0.25％溴酚藍上樣緩沖液混合，在含1.0μg/mL溴化乙錠的1％(g/mL)的瓊脂糖中進行電泳和顯色，在透射紫外燈下觀察，如果所有樣品孔均出現一條586bp核酸條帶，說明樣品有血卵渦鞭蟲感染或污染。(其中電泳液組成、電泳方法及染色方法參考分子克隆實驗指南(第二版)，p307，p309-313，p314。)實施例4按以下方法配制檢測血卵渦鞭蟲試劑1)試劑A成分為0.5M NaCl，50mM Tris(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0)；2)試劑B成分為20mg/mL蛋白酶K、10％SDS；3)PCR試劑管成分為5.0μL 10 x buffer，4.0μL dNTP(為dTTP、dATP、dCTP、dGTP四種核苷酸的混合物，每種濃度2.5mM)，3.0μL 25mM MgCl2，0.5μL 25μM引物1，0.5μL 25μM引物2，35μL滅菌去離子水。
4)2.5U/μL Taq酶；5)含0.5μg/mL溴化乙錠的1.0％(g/mL)的瓊脂糖；6)0.25％(g/ml)溴酚藍上樣緩沖液；按以下步驟進行檢測(1)樣品處理取檢測樣品血淋巴300μL，每分鐘8000轉離心5min；棄上清，用500μL試劑A重新懸浮沉淀。
(2)DNA提取加入100μL試劑B，55℃浴中保溫30min，期間不斷混勻；加入等體積的酚/氯仿抽提，每分鐘12000轉離心10min；取上清并加入2倍體積的無水乙醇，沉淀DNA，室溫放置10min；每分鐘12000轉離心10min；棄上清，75％乙醇洗滌沉淀1～2次，讓乙醇徹底揮發，將沉淀溶于50μL滅菌雙蒸水中，即為DNA提取液，-20℃保存備用。
(3)PCR擴增在PCR試劑管中加入1μL的DNA提取液，每管加入2.5U/μL Taq酶1.0μL，每分鐘4000轉離心3s混勻，置PCR儀進行擴增。通過94℃解鏈5min；然后94℃變性45s，55℃復性45s，72℃延伸1min，如此進行循環35次；最后72℃延伸10min，得擴增物。
(4)PCR擴增物分析取5μL擴增后的樣品，與1μL 0.25％溴酚藍上樣緩沖液混合，在含0.5μg/mL溴化乙錠的1％(g/mL)的瓊脂糖中進行電泳和顯色，在透射紫外燈下觀察，如果樣品孔有一條586bp核酸條帶，說明樣品有血卵渦鞭蟲感染或污染。(其中電泳液組成、電泳方法及染色方法參考分子克隆實驗指南(第二版)，p307，p309-313，p314。)
權利要求
1.一種海產甲殼動物類寄生血卵渦鞭蟲的PCR檢測方法，其特征在于包括下列操作步驟1)樣品處理取檢測樣品肌肉組織100～500mg，用0.7～1mL試劑A懸浮樣品，并將樣品充分混勻；每分鐘8000～12000轉離心2～5min；或取檢測樣品血淋巴300μL，每分鐘8000轉離心5min；棄上清，用500μL試劑A懸浮樣品。2)DNA提取取500μL上述樣品處理液，加入100μL試劑B混勻；再在55℃水浴中保溫30～120min，其間不斷混勻；加入等體積的酚/氯仿抽提，每分鐘12000轉離心10min；取上清并加入上清體積2倍的無水乙醇沉淀DNA；室溫放置5～10min，每分鐘10000～12000轉離心5～10min；棄上清，75％乙醇洗滌沉淀1～2次，讓乙醇徹底揮發，將其沉淀溶于30～50μL滅菌雙蒸水中，即為DNA提取液，-20℃保存備用。其中所述的試劑A成分為0.5M NaCl，50mM Tris，10mM EDTA；Tris和EDTA pH均為8.0；試劑B成分為20mg/mL蛋白酶K、10％SDS；3)PCR在PCR試劑管中加入0.5～1μL上述的DNA提取液，每管加入2.5U/μL的Taq酶0.5～1.0μL，每分鐘3000～5000轉離心2～5s混勻，置于PCR試管內進行擴增；通過94℃解鏈5min；然后94℃變性45s，55℃復性45s，72℃延伸1min，如此進行循環35次；最后72℃延伸10min，得擴增物。其中所述PCR試劑管成分為2.5～5.0μL 10×buffer，2.0～4.0μL dNTP(為dTTP、dATP、dCTP、dGTP四種核苷酸的混合物，每種濃度2.5mM)，1.5～3.0μL 25mM MgCl2，0.25～0.5μL 25μM引物1，0.25～0.5μL 25μM引物2，17.5～35μL滅菌去離子水；所述的上游引物1和下游引物2分別是由DNA合成儀按堿基序列為上游引物15’-CTGATTACGTCCCTGCCCTT-3’；下游引物25’-GCATGTCGCTGCGTTCTTC-3’合成的DNA片段。4)PCR擴增物分析取5～10μL擴增后的樣品，與1～4μL0.25％(w/v)溴酚藍上樣緩沖液混合，在含0.5μg/mL溴化乙錠的1.0％(w/v)瓊脂糖中進行電泳和顯色，在透射紫外燈下觀察，樣品孔有一條586bp核酸條帶，為有血卵渦鞭蟲感染或污染的陽性樣品。
2.根據權利要求1所述一種海產甲殼動物類寄生血卵渦鞭蟲的PCR檢測方法其特征在于PCR試劑成分最佳組成為5.0μL 10×buffer，1μL2.5U/μLTaq酶，4.0μL dNTP，3.0μL 25mM MgCl2，0.5μL 25μM引物1，0.5μL 25μM引物2，35μL滅菌去離子水；其中dNTP為dTTP、dATP、dCTP、dGTP四種核苷酸的混合物，每種濃度2.5mM。
全文摘要
本發明公開了一種海產甲殼動物類寄生血卵渦鞭蟲的PCR檢測方法，屬于水產養殖動物疾病的檢測技術，包括由樣品處理試劑A和B、PCR試劑管、Taq酶、普通瓊脂糖、溴化乙錠溶液、溴酚藍上樣緩沖溶液組成的PCR檢測試劑的配置以及PCR、PCR擴增物分析等一套檢測操作程序。本發明在PCR反應的基礎上，進行電泳和溴化乙錠染色，可快速、準確、敏感地檢測出供檢樣品中的血卵渦鞭蟲，為水產養殖動物的健康養殖提供有效的檢測技術。
文檔編號C12Q1/68GK101067154SQ20071006770
公開日2007年11月7日 申請日期2007年3月16日 優先權日2007年3月16日
發明者許文軍, 施慧, 李鵬飛, 徐漢祥 申請人:浙江省海洋水產研究所